張玲玲 宋璐 孫京格 孟夢 侯麗華

摘要：能源危機導(dǎo)致人們將視野轉(zhuǎn)移到可再生能源的開發(fā)與利用上，乙醇作為一種不含硫及灰分的清潔燃料，逐漸進入人們的視野并被用于替代汽油和柴油。人們對乙醇生產(chǎn)方式的研究越來越多，目前生產(chǎn)乙醇的重要手段是通過發(fā)酵技術(shù)，利用酵母對糧食或纖維類廢棄物進行發(fā)酵，將其轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)燃料乙醇。近年來，國內(nèi)鮮有對釀酒酵母菌株篩選并優(yōu)化發(fā)酵條件的研究，該研究針對天津科技大學(xué)誘變的編號為H1～H17的17株釀酒酵母進行篩選，并對篩選出的4株優(yōu)良釀酒酵母進行單因素試驗和正交試驗，獲得最優(yōu)發(fā)酵條件：YPD液體培養(yǎng)基初始還原糖濃度為220 g/L，接菌量為1×108 CFU/mL，不添加葡萄糖和添加6%的乙醇，在此條件下，發(fā)酵結(jié)束后殘留還原糖含量最低，乙醇生成率最高。

關(guān)鍵詞：能源危機；乙醇；釀酒酵母；正交試驗；最優(yōu)發(fā)酵條件

中圖分類號：TS201.3? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）07-0056-05

Abstract： The energy crisis has led people to shift their vision to the development and utilization of renewable energy. As a clean fuel without sulfur or ash， ethanol has gradually entered people's vision and been used to replace gasoline and diesel.There are more and more researches on ethanol production methods. At present， an important way to produce ethanol is to use yeast to ferment and convert grain or fiber wastes into fuel ethanol through fermentation technology. In recent years， there are few studies on screening Saccharomyces cerevisiae strains and optimizing fermentation conditions in China. In this study， 17 strains of Saccharomyces cerevisiae numbered H1～H17 mutagenized by Tianjin University of Science and Technology are screened， and single facter test and orthogonal test are conducted on the four selected excellent Saccharomyces cerevisiae strains. The optimal fermentation conditions are obtained as follows： the initial reducing sugar concentration of YPD liquid medium is 220 g/L， the inoculation amount is 1×108 CFU/mL， without adding glucose and adding 6% ethanol， under these conditions， the residual reducing sugar content is the lowest and the production rate of ethanol is the highest after fermentation.

Key words： energy crisis; ethanol; Saccharomyces cerevisiae; orthogonal test; optimal fermentation conditions

隨著不可再生資源的逐漸枯竭及環(huán)境的日益惡化，資源緊缺和環(huán)境污染問題成為人們關(guān)注的焦點，人們逐漸將視野轉(zhuǎn)移到可再生能源的開發(fā)與利用上，用其取代石油資源。乙醇是一種不含硫及灰分的清潔燃料，它的用途很廣，可用于制造醋酸、飲料、香精、染料、燃料等，也被用于醫(yī)療消毒及國防工業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生、有機合成、食品工業(yè)、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域[1]。用乙醇代替汽油、柴油，一方面，可減少原油的使用，節(jié)約資源且降低成本；另一方面，它在燃燒期間抑制顆粒和氮氧化合物以及其他溫室氣體的排放[2-3]，可減少汽車尾氣對環(huán)境的污染，保護環(huán)境。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是酒及發(fā)酵食品制作過程中不可或缺的輔料。乙醇生產(chǎn)過程中，在底料中添加釀酒酵母，酵母發(fā)酵利用底物代謝生成產(chǎn)物乙醇，之后將產(chǎn)物脫水并進行適當處理即可獲得燃料乙醇。目前我國乙醇生產(chǎn)方式中以纖維素為代表的第2代乙醇發(fā)酵技術(shù)，主要存在秸稈收集處理效率低、預(yù)處理費用和纖維素酶成本高等問題[4-5]；以合成氣生物發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇的技術(shù)存在生產(chǎn)效率低、氣體底物在液相中的溶解性差、傳質(zhì)性能不佳等問題[6]。因此，我國乙醇的主要生產(chǎn)方式為以玉米和木薯等糧食為原料的第1代生物發(fā)酵法，其中玉米發(fā)酵法占比為61%[7]。釀酒酵母還含多種生理活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分，將其添加至食品和動物飼料中，不僅能提高營養(yǎng)價值，而且具有保健功能，可調(diào)節(jié)腸道菌群，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，提高免疫功能和抗氧化功能，緩解應(yīng)激[8]。此外，釀酒酵母與動植物同為真核生物，具有很多相同的細胞結(jié)構(gòu)，并且具有繁殖快、代謝時間短、易于培養(yǎng)和分離等特點，因此，常用釀酒酵母作為食品科學(xué)研究中的實驗生物[9]。篩選出優(yōu)良的釀酒酵母菌種不僅能提高乙醇的產(chǎn)量和質(zhì)量，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，而且能緩解能源危機，減輕環(huán)境污染。因此，對釀酒酵母進行篩選及乙醇發(fā)酵條件的優(yōu)化具有重要的科研意義和經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

菌種：天津科技大學(xué)誘變選育的編號為H1～H17的17株釀酒酵母。

YPD培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）[10]：1%酵母膏，2%蛋白胨，1.5%瓊脂粉，115 ℃高溫滅菌20 min，添加5%的葡萄糖。

玉米培養(yǎng)基：玉米面經(jīng)糖化后得到葡萄糖濃度為240 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，添加0.05％的（NH 4） 2HPO 4 和0.05％的KH 2PO 4。

1.2 材料與試劑

玉米面：天津市濱海新區(qū)明耀超市；重鉻酸鉀、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸（分析純）：博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司；乳糖（分析純）：天津市奧淇醫(yī)科醫(yī)藥銷售有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

微量離心機、冷凍大容量離心機、全波長酶標儀 美瑞泰克科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 檢測還原糖含量的方法

參考《生物化學(xué)實驗方法和技術(shù)》[11]中的DNS法，分兩步進行測定，測量儀器為酶標儀：繪制還原糖標準曲線，分梯度配制葡萄糖溶液，加入DNS試劑，經(jīng)過處理，在540 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線；樣品測定：取合適稀釋濃度的樣品，用同樣的方法處理并進行測定，根據(jù)第一步繪制出的標準曲線計算樣品中的還原糖含量。

1.4.2 檢測乙醇含量的方法

參考文獻[12]，用重鉻酸鉀比色法分兩步進行測定，測量儀器為酶標儀：繪制乙醇標準曲線，分梯度配制乙醇溶液，加入重鉻酸鉀溶液，經(jīng)過處理后，在600 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線；樣品測定：取合適稀釋濃度的樣品用同樣的方法處理并進行測定，根據(jù)第一步繪制出的標準曲線計算樣品中的乙醇含量。

1.4.3 檢測海藻糖含量的方法

參考文獻[13]，用蒽酮-硫酸法分兩步進行測定，測量儀器為酶標儀：繪制標準曲線，分梯度配制海藻糖溶液，加入蒽酮-硫酸溶液，經(jīng)過處理后，在630 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線；胞內(nèi)海藻糖的提取與測定：用冰水提取酵母泥的胞內(nèi)海藻糖，加入三氯乙酸，通過振蕩離心的方法提取。通過標準曲線計算海藻糖含量。

1.5 分析方法

所有試驗均重復(fù)3次以上，所列的數(shù)據(jù)均是3次獨立試驗的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選優(yōu)良釀酒酵母菌株

選取實驗室誘變選育的17株釀酒酵母（編號為H1～H17）進行乙醇發(fā)酵，整個發(fā)酵過程中，間隔一段時間檢測發(fā)酵溶液中剩余還原糖含量，檢測結(jié)果見圖1，初始還原糖濃度均為240 g/L，在發(fā)酵前25 h內(nèi)，H1～H17菌株對還原糖的消耗均很快，每隔5 h殘留還原糖的含量大幅銳減；在發(fā)酵25 h后，殘留還原糖的含量遞減速度變緩；在發(fā)酵72 h時，殘留還原糖的含量基本接近于0，可認為72 h為發(fā)酵最長時間，設(shè)置72 h為本試驗結(jié)束時間。對比不同菌株試驗結(jié)束后溶液中殘留的還原糖含量，編號為H1、H3、H6、H7、H17的菌株溶液中含量較少，分別為0.88，0.94，0.94，0.91，0.92 g/dL，可見在實驗室誘變選育的17株釀酒酵母菌株中，上述5株菌株對還原糖的消耗較多，更能充分利用發(fā)酵醪液中的還原糖。

發(fā)酵結(jié)束時測定發(fā)酵醪液中乙醇的含量，測定結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當發(fā)酵進行到72 h時，即發(fā)酵結(jié)束，編號為H1、H3、H7、H17菌株的溶液中產(chǎn)物生成量較高，乙醇含量分別達到9.42，8.50，8.31，9.08 g/dL。

判斷釀酒酵母菌株是否優(yōu)良主要看乙醇發(fā)酵過程中是否能消耗更多還原糖，生成更多乙醇。通過對17株釀酒酵母發(fā)酵過程中和結(jié)束時還原糖和乙醇含量的測定可知，H1、H3、H7、H17這4株為較優(yōu)釀酒酵母菌株，并用于后續(xù)試驗。

2.2 優(yōu)化發(fā)酵條件

分別改變YPD液體培養(yǎng)基中葡萄糖含量、乙醇含量、初始還原糖濃度、酵母菌接菌量4個不同的發(fā)酵條件，將篩選出的4株優(yōu)良菌株進行發(fā)酵試驗。

2.2.1 葡萄糖含量對發(fā)酵結(jié)果的影響

發(fā)酵醪液中初始還原糖濃度為240 g/L，分別在YPD液體培養(yǎng)基中添加葡萄糖（0%、3%、6%、9%），發(fā)酵結(jié)果見圖3。發(fā)酵醪液中殘留的還原糖含量均低于2%，隨著葡萄糖添加量的增加，殘留的還原糖含量也有所增加，而每種菌株中不添加葡萄糖的培養(yǎng)基中還原糖殘留量最少，分別為0.86，0.89，0.82，0.87 g/dL。發(fā)酵結(jié)束后測定培養(yǎng)基中的乙醇含量發(fā)現(xiàn)，乙醇含量均高于7 g/dL，隨著葡萄糖添加量的增加，乙醇生成量有所降低，每種菌株中不添加葡萄糖的培養(yǎng)基中生成的乙醇含量最多，乙醇含量分別達到9.55，8.97，8.70，9.17 g/dL。結(jié)果表明，不添加葡萄糖的培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中消耗還原糖最多，生成乙醇含量最高。

2.2.2 乙醇含量對發(fā)酵結(jié)果的影響

分別在YPD液體培養(yǎng)基中添加乙醇（0%、3%、6%、9%），結(jié)果見圖4。發(fā)酵醪液中殘留的還原糖含量均低于1.2%，每種菌株乙醇添加量為6%的培養(yǎng)基殘留的還原糖含量最低，分別為0.84，0.85，0.92，0.82 g/dL。所有試驗組發(fā)酵結(jié)束后乙醇含量均高于8 g/dL，當乙醇添加量在6%以內(nèi)時，隨著添加量的增加，乙醇生成量也逐漸增加，當乙醇添加量為9%時，乙醇含量有所降低。因此乙醇添加量為6%時，4種菌株在發(fā)酵過程中消耗更多還原糖，生成更多乙醇。

2.2.3 初始還原糖濃度對發(fā)酵結(jié)果的影響

分別改變發(fā)酵醪液中初始還原糖濃度（200，220，240，260，280 g/L），研究初始還原糖濃度對發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖5。殘留的還原糖含量差別較大，當初始還原糖濃度為200，220，240 g/L時，發(fā)酵過程中消耗的還原糖含量較多，發(fā)酵結(jié)束時殘留的還原糖含量基本都在1%以下，當初始還原糖濃度為260，280 g/L時，發(fā)酵過程中消耗的還原糖不多，結(jié)束時殘留的還原糖含量仍較高，分別為1.53，2.15 g/dL，且發(fā)酵時間延長，約在80 h發(fā)酵結(jié)束。乙醇生成量結(jié)果見圖5中b，乙醇生成量均高于8 g/dL，且初始還原糖濃度越高，乙醇的生成量就越多，為了確定最優(yōu)初始還原糖濃度，還需要通過乙醇實際與理論產(chǎn)率比來進行比較。

由表1可知，當初始還原糖濃度低于220 g/L時，隨著初始還原糖濃度的升高，乙醇實際與理論產(chǎn)率比有所提高，當初始還原糖濃度高于220 g/L時，乙醇的生成量有所增加，但乙醇實際與理論產(chǎn)率比逐漸下降，表明對原料的利用率降低，而且發(fā)酵時間延長，考慮到對原料的利用率及時間成本，選擇初始還原糖濃度為220 g/L。

2.2.4 酵母菌接菌量對發(fā)酵結(jié)果的影響

分別改變發(fā)酵醪液中的接菌量（1×107，2×107，1×108，2×108 CFU/mL）驗證酵母菌接菌量對發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖6。發(fā)酵醪液中殘留還原糖含量均低于1%，4種菌株中，接菌量為 1×108 CFU/mL的培養(yǎng)基殘留還原糖含量最低，分別為0.82，0.90，0.91，0.86 g/dL，表明發(fā)酵過程中對還原糖的消耗最多。發(fā)酵結(jié)束時的乙醇含量見圖6中b，所有試驗組乙醇含量均高于8.4 g/dL，而接菌量為1×108 CFU/mL的試驗組生成的乙醇量最高，4株菌的乙醇生成量分別達到9.71，9.31，9.26，9.57 g/dL。比較可知接菌量為1×108 CFU/mL時，最終殘留還原糖含量最少，乙醇生成量最多，發(fā)酵最徹底。

隨著乙醇發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵醪液中乙醇的濃度越來越高，發(fā)酵醪液中的滲透壓增加，不利于釀酒酵母的存活，而細胞內(nèi)的海藻糖能夠有效緩釋溶液中的滲透壓，甚至在惡劣環(huán)境中，能夠調(diào)整細胞中海藻糖的含量來抵御外界對細胞的傷害。因此，細胞中海藻糖含量越高，對活性干酵母的制備越有利。測定4個菌種不同接菌量培養(yǎng)基的細胞內(nèi)海藻糖含量，結(jié)果見圖7。每個菌種細胞內(nèi)海藻糖數(shù)量隨著接菌量的增加呈遞增趨勢，當接菌量為 1×108 CFU/mL時達到最高峰，之后隨著接菌量的增加又呈下降趨勢，結(jié)合圖6中接菌量對發(fā)酵影響的結(jié)果可知，當接菌量為 1×108 CFU/mL時，溶液中殘留還原糖含量最少，乙醇生成量最多，可見海藻糖含量高，細胞活性強，發(fā)酵產(chǎn)物多。

2.2.5 正交優(yōu)化條件

由上述4個單因素試驗得出每種變量下的最優(yōu)條件，但沒有考慮各個因素的交互作用，因此按照表2的因素水平表進行四因素三水平的正交試驗，得出發(fā)酵的最優(yōu)條件。

由表3可知，通過極差分析，因素C（初始還原糖濃度）的變化對乙醇的生成率有較大影響，因素D（接菌量）次之，影響最小的是因素B（YPD中乙醇添加量）。所以各因素的主次順序為C＞D＞A＞B，最優(yōu)組合為A 1B 3C 2D 3，即最優(yōu)發(fā)酵條件為YPD液體培養(yǎng)基初始還原糖濃度220 g/L，接菌量1×108 CFU/mL，不添加葡萄糖和添加6%的乙醇。

3 結(jié)論

本研究對乙醇發(fā)酵條件進行優(yōu)化，首先篩選天津科技大學(xué)誘變的編號為H1～H17的17株釀酒酵母，通過對發(fā)酵結(jié)束后17株釀酒酵母的培養(yǎng)液中殘留還原糖含量和乙醇含量進行比較，發(fā)現(xiàn)編號為H1、H3、H7、H17 4株釀酒酵母接入的發(fā)酵樣品中最終殘留還原糖量較低，乙醇含量較高。說明這4株釀酒酵母擁有較好的發(fā)酵能力，可以消耗更多底物，生成更多產(chǎn)物。其次對這4株優(yōu)良釀酒酵母在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，獲得最優(yōu)發(fā)酵條件為YPD液體培養(yǎng)基初始還原糖濃度220 g/L，接菌量1×108 CFU/mL，不添加葡萄糖和添加6%的乙醇，在此條件下，發(fā)酵結(jié)束后殘留還原糖含量最低，乙醇生成率最高。

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