楊宇航 楊子青 許海旭 劉恩岐 崔 玨 趙南南

（徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018）

近年來，植物多糖由于其多種藥理活性和藥用價值，且?guī)缀鯚o毒副作用而愈發(fā)受到關(guān)注。大量研究表明，多糖的生物活性主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)肝臟等[1-3]。山藥多糖通過調(diào)控Nrf2/HO-1抗氧化通路，降低炎性因子釋放，從而緩解大鼠腦缺血再灌注損傷[4]。因此，對植物多糖的研究已成為行業(yè)熱點。

石榴（Punica granatumL.）含有豐富的營養(yǎng)成分，其果皮、種子和葉還兼具藥用價值。但石榴葉在工業(yè)生產(chǎn)中常作為廢棄物。研究表明，植物葉中含有多種活性成分（多糖類、黃酮類、鞣質(zhì)類等），能夠促進(jìn)畜禽的生長，提高免疫性能和抗氧化能力[5]及維持腸道微生態(tài)平衡[6]。石榴葉提取物具有抗炎[7]、緩解非酒精性脂肪肝[8]、預(yù)防肥胖[9]及抗菌[10-11]等功效。目前，關(guān)于石榴葉多糖（PLP）在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用較少。有研究表明，添加番石榴葉提取物能夠降低仔豬腹瀉率，提高仔豬抗氧化能力和免疫力[12]。對石榴葉潛在價值的探索研究，不僅降低了資源浪費，還能夠促進(jìn)石榴葉資源深度開發(fā)利用，對石榴產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。本研究以石榴葉為原料提取PLP，優(yōu)化超聲波法提取工藝條件；通過體外試驗評估PLP 的抗氧化活性和抗炎功效，為PLP 在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

石榴葉購自徐州惠春堂藥店，60 ℃烘干粉碎，過80目篩，保存。

DPPH 和ABTS 試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，一氧化氮檢測試劑盒、RIPA裂解液和BCA蛋白濃度試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，COX2、iNOS、NF-κB p-p65和p-IκB抗體購自proteintech生物公司，腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

7230G 可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），RE-201D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（常州華特儀器有限公司），HH-8 數(shù)顯式恒溫水浴鍋（常州市萬豐儀器制造有限公司），XO-SM100 超聲-微波協(xié)同反應(yīng)工作站（南京先歐儀器制造有限公司），Min P4 蛋白質(zhì)電泳儀、VersaDoc 4000MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國伯樂儀器）。

1.2 PLP提取條件優(yōu)化

1.2.1 PLP含量測定方法

本文采用苯酚-硫酸法測定PLP中多糖含量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測在470 nm 處吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合方程為y=0.019 2x+0.058 9，R2=0.996 9。PLP多糖得率為：

1.2.2 單因素試驗

分別考察液料比（15、20、25、30、35 mL/g）、超聲功率（70、100、130、160、190 W）、超聲時間（5、10、15、20、25 min）和水浴溫度（40、50、60、70、80 ℃）對PLP多糖得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化方案

基于單因素試驗結(jié)果，以多糖得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken Design 響應(yīng)面試驗設(shè)置4 因素3 水平設(shè)計，研究得出PLP 多糖得率的優(yōu)化條件。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 試驗因素與水平設(shè)計

1.3 體外抗氧化分析試驗

1.3.1 DPPH自由基清除率

參考郭育東等[13]和Cao等[14]方法，對PLP進(jìn)行去蛋白脫色處理，冷凍干燥，獲得精制多糖。取0、0.2、0.4、0.6、0.8 g/L粗PLP 1 mL分別加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，充分混勻，37 ℃水浴30 min，517 nm 測定吸光度。以去離子水作為空白對照，VC作為陽性對照組。

式中：A0為去離子水的空白對照的吸光度；A1為樣品和DPPH的吸光度；A2為樣品和去離子水的吸光度。

1.3.2 ABTS清除率測定

取不同濃度粗PLP，加入ABTS溶液200 μL。充分混合，在溫度較低且光線較暗的情況下放置1 h，734 nm處測量吸光度。無水乙醇作為空白對照，VC 作為陽性對照組。

式中：A0為無水乙醇的吸光度；A1為樣品和ABTS的吸光度；A2為樣品和無水乙醇的吸光度。

1.4 體外抗炎活性試驗

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿后，按照1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4.2 NO檢測和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試驗

在6 孔板中加入1×105RAW264.7 巨噬細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%左右時，加入不同質(zhì)量濃度的PLP（0.2、0.5、1.0 g/L，分別作為低、中、高劑量）預(yù)處理2 h，加入1 mg/L的脂多糖LPS溶液刺激處理，培養(yǎng)22 h。參考說明書，取50 μL細(xì)胞上清液，按照Griess法檢測NO的含量。取細(xì)胞上清液采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.4.3 蛋白免疫印跡試驗

按照1.4.2 進(jìn)行藥物處理24 h 后，6 孔板每孔RAW264.7巨噬細(xì)胞加入200 μL RPIA裂解液，冰上裂解15 min；4 ℃，12 000 r/min離心5 min；采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定和校正。通過SDS-PAGE 凝膠檢測COX2、iNOS、NF-κB p-p65和p-IκB的蛋白含量，采用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLP提取的單因素試驗結(jié)果（見圖1）

圖1 不同提取因素對PLP得率的影響

由圖1（a）可知，隨著液料比升高，PLP 的得率呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，在液料比為35 mL/g時，得率達(dá)到最高，主要是因為溶液增加了多糖在水中的溶解量，但由于本試驗中液料比處于持續(xù)上升趨勢，若選取液料比35 mL/g無法判斷后續(xù)PLP得率的變化趨勢，故考慮將最佳液料比前移至30 mL/g。由圖1（b）可知，PLP得率從70 W 到130 W 逐步升高，在130 W 時達(dá)到頂峰；超過130 W 后，呈現(xiàn)下降趨勢，主要原因可能是功率過高導(dǎo)致PLP降解。由圖1（c）可知，5～20 min，PLP得率逐步提高，隨后時間延長呈逐步降低趨勢，這可能是由于超聲時間過長導(dǎo)致能量過強(qiáng)（包括機(jī)械力和熱效應(yīng)）引發(fā)多糖降解。由圖1（d）可知，當(dāng)溫度在40～60 ℃，PLP得率呈現(xiàn)升高走勢，之后溫度升高PLP 得率走勢下降，可能原因是溫度過高破壞了多糖的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致溶解降低。綜上所述，選擇液料比30 mL/g、超聲功率130 W、超聲時間20 min 及水浴溫度60 ℃作為響應(yīng)面優(yōu)化方案的中心值。

2.2 PLP多糖提取的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果（見表2、表3）

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

采用Design-Expert 12軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到多元二次回歸方程：Y=1.26-0.004 2A-0.014 2B-0.01C-0.02D+0.002 5AB-0.035AC-0.01AD+0.027 5BC-0.022 5BD+0.017 5CD-0.227 2A2-0.142 2B2-0.121C2-0.118 5D2。

根據(jù)表3 回歸模型方差分析結(jié)果可知，回歸模型P＜0.000 1，方差顯著；失擬項P＞0.05，方差不顯著，表明本試驗的回歸方程可靠，可對PLP 提取工藝進(jìn)行優(yōu)化預(yù)測。此外，由表3的F值和P值可知水浴溫度和超聲功率對PLP的提取影響最大，其次是超聲時間和液料比。

通過響應(yīng)面分析可知，最佳優(yōu)化方案為液料比29 mL/g、超聲功率128.47 W、超聲時間19.73 min、水浴溫度59.19 ℃，此時理論上PLP 的得率為1.26%。根據(jù)實際試驗條件調(diào)整為液料比30 mL/g、超聲功率128 W、超聲時間20 min、水浴溫度60 ℃。試驗重復(fù)5 次后，實際值為1.27%，與理論預(yù)測值相近，表明優(yōu)化后模型參數(shù)可靠，制備工藝可行。

2.3 PLP體外抗氧化結(jié)果（見圖2）

圖2 PLP的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力

為了解PLP 的抗氧化能力，進(jìn)行了DPPH 自由基和ABTS自由基清除試驗。結(jié)果表明，隨著PLP質(zhì)量濃度的增加，DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率顯著上升，呈劑量依賴性關(guān)系；其中PLP 和VC 對DPPH 自由基的IC50值分別是0.71、0.46 g/L，對ABTS自由基的IC50值分別是0.34、0.27 g/L；清除活性順序是ABTS＞DPPH，且PLP對兩者的清除活性均顯著低于VC溶液。

2.4 PLP體外抗炎作用（見圖3、圖4）

圖3 PLP對LPS刺激的RAW 264．7細(xì)胞NO、TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

圖4 PLP對LPS刺激的RAW 264．7細(xì)胞炎性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步明確PLP 的活性，體外采用脂多糖（LPS）刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，觀察PLP 的抗炎功效。LPS刺激能夠顯著促進(jìn)NO釋放，然而PLP能夠逆轉(zhuǎn)LPS促進(jìn)NO釋放現(xiàn)象（P＜0.05）。

由圖3中ELISA 試驗分析發(fā)現(xiàn)，隨著PLP 濃度增加，LPS 產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量呈劑量依賴性減少（P＜0.05）。

采用Western blot 法檢測PLP 對LPS 刺激的RAW 264.7 細(xì)胞炎性相關(guān)蛋白的影響。由圖4 可知，添加PLP能夠緩解LPS誘導(dǎo)的COX2和iNOS蛋白過表達(dá)，進(jìn)而影響NO 的分泌。NF-κB 信號通路在炎癥的發(fā)生中起到重要作用，其中p65 能夠作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多種促炎因子的表達(dá)（如TNF-α、IL-1β和IL-6等）；添加PLP能夠降低LPS所致的p65和IκB的磷酸化水平，表明PLP可能通過NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用。

3 討論

本試驗以石榴葉為原料，采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面方法優(yōu)化了超聲波提取PLP 的工藝條件，結(jié)果表明，影響PLP提取率的主次順序依次是水浴溫度、超聲功率、超聲時間和液料比，優(yōu)化后的最佳工藝條件為液料比30 mL/g、超聲功率128 W、超聲時間20 min、水浴溫度60 ℃，PLP得率是1.27%，與預(yù)測值相吻合。Luo等[15]研究表明，超聲功率404 W、提取溫度62 ℃、超聲時間20 min時，番石榴葉多糖最佳得率為1%，與本試驗結(jié)果比較接近。此外，景年華等[16]以枇杷葉為原料提取枇杷葉多糖，采用超聲輔助提取，經(jīng)響應(yīng)面法得出超聲浸提溫度60 ℃、超聲浸提時間150 min、超聲功率450 W 及液料比20 mL/g為最佳提取工藝，得率為0.71%。而以石榴皮為原料提取多糖，在液料比23 mL/g、提取時間62 min、提取溫度57 ℃、超聲功率為145 W 的最佳提取條件下，得率為13%[17]；以乙醇濃度91%、液料比42 mL/g、提取時間62 min、提取溫度96 ℃為最佳提取條件，得率為16%[18]。此外，采用復(fù)合酶法獲得石榴籽最佳提取得率是2.01%[19]。結(jié)果表明，同一植物不同部位所含有的多糖含量有所差異。

本試驗抗氧化試驗結(jié)果表明，PLP 具有很強(qiáng)的清除自由基能力，對DPPH 和ABTS 的IC50值分別是0.71、0.34 g/L，對ABTS的清除活性大于DPPH，與文獻(xiàn)[20]報道結(jié)果一致。此外，體外細(xì)胞抗炎試驗結(jié)果表明，PLP能夠抑制LPS 刺激的RAW264.7 巨噬細(xì)胞NF-κB 信號通路，降低p65的磷酸化水平，進(jìn)而減少促炎因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）釋放，最終減少炎性反應(yīng)；也有可能是通過影響iNOS 的表達(dá)而抑制細(xì)胞內(nèi)NO 的產(chǎn)生。最近研究表明，PLP 能夠改善糖尿病小鼠總抗氧化能力，緩解肝臟、腎臟和胰腺的損傷[21]。此外，石榴葉的其他成分也具有相似的作用，石榴葉的水醇提取物能夠緩解LPS誘發(fā)的小鼠急性肺損傷，降低TNF-α和白蛋白水平，提高IL-10的含量；恢復(fù)LPS刺激誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞NO 含量及IL-1β、IL-6 和IL-10 的mRNA 表達(dá)[22]。此外，石榴葉的乙醇提取物呈劑量依賴性地降低LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞COX2 和iNOS 蛋白表達(dá)，調(diào)控炎性因子的分泌[23]。Chu等[24]研究表明，石榴葉水提物能夠通過調(diào)節(jié)肝臟中的葡萄糖代謝以及恢復(fù)腸道微生物菌群的平衡，從而緩解2 型糖尿病的高血糖和胰島素抵抗。而且石榴葉三萜類提取物能夠調(diào)控NF-κB信號，減輕糖尿病周圍神經(jīng)性病變[25]。盡管本試驗中PLP 提取率較低，但研究發(fā)現(xiàn)PLP 具有很強(qiáng)的抗炎、抗氧化等作用，而且提取流程所需設(shè)備操作技術(shù)簡單、投資少，具有很大的開發(fā)價值。

4 結(jié)論

本研究以石榴葉為原料，通過響應(yīng)面法優(yōu)化PLP 的提取率，最佳提取條件為液料比30 mL/g、超聲功率128 W、超聲時間20 min、水浴溫度60 ℃；在此條件下，PLP 得率是1.27%。體外抗氧化和細(xì)胞試驗結(jié)果表明，PLP 具有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的能力，能夠緩解LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞炎性反應(yīng)，有可能是通過NF-κB 通路。后期還需要對PLP 的體內(nèi)抗炎作用及分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，本研究結(jié)果可為PLP的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。