楊紅紅 巴 濤 倪 凡 朱余蓉 常向云

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科 （石河子 832000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種危害人類(lèi)健康的代謝性疾病，由IDF統(tǒng)計(jì)全球約有4.63億人次患有糖尿病；而我國(guó)2型糖尿?。╰ype 2 diabetes millitus，T2DM）在糖尿病人群中的占比90%以上［1-2］。T2DM長(zhǎng)期不僅累及腦、心、眼、腎等多器官的病變，而且還與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，嚴(yán)重威脅人們的生存及生活質(zhì)量［3-4］。肝臟是葡萄糖和脂類(lèi)合成、代謝、儲(chǔ)存及再分配的核心器官，是胰島素作用的主要靶組織，同時(shí)肝臟組織還會(huì)分泌一系列的肝激素及脂肪因子來(lái)參與血糖、血脂的調(diào)節(jié)［5］。而在T2DM中，由于高糖狀態(tài)使肝臟組織中糖代謝的中心樞紐6-磷酸葡萄糖下游的代謝途徑增加，引起肝臟合成的甘油三酯增加、異位脂質(zhì)在肝臟中堆積，導(dǎo)致肝臟脂肪變性，加速胰島素抵抗（insulin resistance，IR）［6-7］。環(huán)狀RNA（circRNA）是一種不被核酸外切酶降解的特殊類(lèi)型的閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，通過(guò)海綿作用吸附miRNA，影響靶基因的表達(dá)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展、發(fā)展［8］。尤其是在糖尿病這一領(lǐng)域，已有多項(xiàng)研究［9-10］表明circRNA參與其中。Hsa-circRNA-0003340是位于人體第7號(hào)染色體（chr7）：44684925-44687358（ http：//www.circbank.cn/search.html），基因同源性分析顯示，該circRNA也存在大鼠體內(nèi)，位于大鼠第14號(hào)染色體chr：86434307|86438230，由OGDH基因反剪產(chǎn)生。肝臟作為胰島素的主要靶組織，參與血糖調(diào)節(jié)，circRNA在T2DM肝臟組織中的表達(dá)鮮有研究。因此本研究擬通過(guò)觀(guān)察circRNA-0003340在T2DM大鼠模型肝臟組織中的表達(dá)情況，探討circRNA與T2DM的關(guān)系，為深入研究circRNA在T2DM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的調(diào)控功能提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為T(mén)2DM的診治開(kāi)拓新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑和儀器

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD大鼠30只（n=30），5周齡，體質(zhì)量約（200±20）g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。鏈脲佐菌素（Streptozotincin，STZ）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，血糖測(cè)試儀購(gòu)于羅氏公司，ELISA試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技有限公司。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購(gòu)于日本TAKARA公司，Trizol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，引物購(gòu)自上海生工。蘇木紅素、伊紅染液均購(gòu)自武漢塞維爾生物。

1.2 動(dòng)物模型的建立與分組

將SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對(duì)照（normal control，NC）組10只與造模組20只。造模組高脂高糖飼料飼養(yǎng)4周，于第4周末禁食12 h，按30 mg/kg給予一次性腹腔注射1%STZ，72小時(shí)后尾靜脈采血測(cè)血糖，以空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）≥11.1 mmol/L或隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L作為T(mén)2DM造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。2型糖尿病模型建立成功后繼續(xù)高脂高糖飼料再喂養(yǎng)到8周［11］。8周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組與造模組各6只大鼠進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 腹腔糖耐量實(shí)試驗(yàn)及胰島素耐量試驗(yàn)

建模成功后的第4周，對(duì)2組SD大鼠隔夜禁食12 h后行腹腔糖耐量（introperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）試驗(yàn)，依次腹腔注射20%葡萄糖（2 g/kg），分別于0、15、30、60、90、120 min使用羅氏血糖儀測(cè)大鼠尾靜脈血糖并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。隔日對(duì)2組SD大鼠行腹腔胰島素耐量（introperitoneal insulin tolerance test，IPITT）實(shí)驗(yàn)，每組禁食6 h，依次腹腔注射胰島素注射液（0.75 U/kg），分別于0、15、30、60、90、120 min使用羅氏血糖儀測(cè)大鼠尾靜脈血糖并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4 各組生化指標(biāo)的測(cè)定

造模成功第6周末，取尾靜脈血用羅氏血糖儀測(cè)血糖；處死SD大鼠，取頸靜脈血3 mL，3 000 r離心取上清液，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）測(cè)定SD大鼠的空腹血清胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）。全自動(dòng)生化儀測(cè)血清FPG、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）=FINS×FPG/22.5。

1.5 HE染色

將胰腺組織標(biāo)本置于4 ℃的10%的福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋處理。將石蠟切片依次置入二甲苯、無(wú)水乙醇、75%酒精脫蠟，用塞維爾蘇木素染液染色3～5 min，自來(lái)水沖洗；塞維爾生物蘇木素反藍(lán)液進(jìn)行反藍(lán)，自來(lái)水沖洗，置入85%、95%的酒精分別脫水5 min；伊紅染色5 min，用無(wú)水乙醇、二甲苯進(jìn)行脫水透明，封片。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍鏡視野（×100），觀(guān)察比較2組SD大鼠胰島細(xì)胞的形態(tài)。經(jīng)具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)的3位病理科醫(yī)師復(fù)審切片，確保真實(shí)性及準(zhǔn)確性。

1.6 RT-PCR檢測(cè)大鼠肝臟組織circRNA-0003340的表達(dá)

麻醉處死SD大鼠后立即打開(kāi)腹腔，無(wú)菌環(huán)境下分離新鮮的肝臟組織，置于無(wú)菌袋中凍存于-80 ℃冰箱中備用。按照試劑操作說(shuō)明書(shū)提取總RNA，以總RNA的1.0 μg為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，總的反應(yīng)體積是20 μL，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增circRNA-000334片段。circRNA-0003340及內(nèi)參照GAPDH的引物有上海生工生物工程公司合成設(shè)計(jì)。PCR的反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)體系為40個(gè)循環(huán)，先95 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃變性15 s，再把溫度降到60 ℃，30 s進(jìn)行退火/延伸反應(yīng)。本研究擬使用管家基因GADPH作為內(nèi)參照。circRNA的相對(duì)表達(dá)使用經(jīng)典方法-ΔΔCt法，即2-ΔΔCt，每個(gè)樣本重復(fù)3次，取平均值，2-ΔΔCt越大，代表circRNA的相對(duì)表達(dá)水平越高。

表1 用于分析circRNA-0003340表達(dá)水平的RT-qPCR引物

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件和Graphpad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)±四分位間距M（P25，P75），正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。Spearman相關(guān)分析2組間肝臟組織中circRNA-0003340的表達(dá)水平與各指標(biāo)的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組生化指標(biāo)及circRNA-0003340表達(dá)水平比較

與NC組比較，T2DM組的AST、ALT、FPG、HAb1c、FINs、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C均升高（P＜0.05），HDL、circRNA-0003340的表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表2、3。

表2 2組血清AST、ALT、FPG、HbA1c、FINs、HOMA-IR水平比較 （n=6）

表3 2組血脂水平比較 （n=6）

2.2 2組IPGTT及ITT結(jié)果比較

在0、15、30、60、90、120 min與NC組比較，T 2 D M 組的血糖水平均高于N C 組（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 2 組IPGTT、ITT 結(jié)果比較

2.3 各組大鼠胰腺組織的HE染色

與NC組比較，T2DM組胰島細(xì)胞明顯縮小，胰島細(xì)胞之間的間隙增大，并且出現(xiàn)空泡變性。與T2DM比較，NC組胰島細(xì)胞更飽滿(mǎn)，數(shù)量更多（見(jiàn)圖2）。

圖2 2 組胰腺HE 染色（100×）

2.4 2組SD大鼠肝臟組織中circRNA-0003340的表達(dá)情況變化

circRNA-0003340在T2DM組大鼠肝臟組織中的表達(dá)較NC組大鼠肝臟組織中的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠circRNA-0003340 在肝臟組織中的表達(dá)

2.5 SD大鼠肝臟組織中circRNA-0003340與生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

Sperman相關(guān)分析顯示，大鼠肝臟組織中circ-0003340表達(dá)水平與FPG、TG、TC呈負(fù)相關(guān)（r=-0.829、-0.943、0.886，P＜0.05，見(jiàn)表4）。

表4 大鼠肝臟組織circRNA-003340表達(dá)水平與各指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

circRNA大量存在于真核細(xì)胞內(nèi)，具有高度穩(wěn)定性、特異性、敏感性的表達(dá)特點(diǎn)，參與脂肪肝、胰島素抵抗、糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［12］。circ-0003340是本課題組前期通過(guò)基因測(cè)序技術(shù)在健康人群與T2DM人群中篩選出的具有明顯差異性表達(dá)的circRNA，基因同源性分析發(fā)現(xiàn)同樣存在于大鼠體內(nèi)。

已有多項(xiàng)研究證實(shí)了circRNA參與糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。hsa-circ0054633可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及細(xì)胞代謝，影響β細(xì)胞的增殖成為診斷T2DM的新生標(biāo)志物［13］。糖尿病性腎病中circ-010383的下調(diào)通過(guò)作為miR-135a的海綿促進(jìn)蛋白尿的形成及腎臟纖維化［14］。circ-RNA072097可能作為miR-3150a3p的海綿，通過(guò)調(diào)節(jié)KRAS在糖尿病足潰瘍中發(fā)揮作用［15］。糖尿病性視網(wǎng)膜病中circCOL1A2 在VEGF的作用下參與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與凋亡［16］。而此外，Liang等人［17］研究發(fā)現(xiàn)his-circRNA-0003340在食道鱗狀細(xì)胞癌中通過(guò)與海綿化mir-615-5p參與谷氨酰胺代謝及糖酵解過(guò)程，而肝臟是糖、脂代謝的重要器官，猜想circRNA可能也通過(guò)海綿化mir影響血糖水平，參與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。Zhang等人［18］研究發(fā)現(xiàn)高血糖通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧干擾電子運(yùn)輸系統(tǒng)及糖酵解及ATP的產(chǎn)生，這將影響三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA），而TCA是糖脂代謝的橋梁，間接影響SREBPs（是甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白），從而誘導(dǎo)肝臟脂肪變性［19］，增加了非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的患病風(fēng)險(xiǎn)。最新證據(jù)顯示，T2DM是NAFLD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，IR又是NAFLD重要發(fā)病機(jī)制，但未有強(qiáng)有力的證據(jù)表明糖尿病、IR、NAFLD之間有某種明確關(guān)聯(lián)。同時(shí)，circRNA具有一定的組織特異性與時(shí)間特異性，據(jù)組織特異性（tissue specific，TS）circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gb.whu.edu.cn/TSCD）顯示不同的組織circRNA的豐度有明顯的特異性，且與發(fā)育階段、物種相關(guān)，例如在成年人類(lèi)中，食道、肝臟中TS circRNA的豐度很高，在胎兒時(shí)期，大腦、骨骼肌中TS circRNA的豐度更高，而在小鼠的大腦、睪丸組織中具有最高的TS circRNA豐度［20］。

本研究通過(guò)構(gòu)建T2DM大鼠模型，測(cè)定SD大鼠的空腹血糖及分離SD大鼠的胰腺組織行HE染色和免疫熒光雙重證實(shí)造模的成功性及真實(shí)性。HE染色顯示T2DM大鼠的胰島體積較NC組明顯縮小，胰島個(gè)數(shù)明顯減少，在組織學(xué)水平再次提示T2DM造模成功。在本研究中T2DM的成模率約為50%，考慮與飼養(yǎng)SD大鼠的環(huán)境及大鼠習(xí)性相關(guān)，尤其是冬季室內(nèi)溫度偏低，大鼠更具有攻擊性，彼此之間相互撕咬（大鼠尾巴、爪子），增加感染風(fēng)險(xiǎn)，從而降低了成模率。

本研究中，T2DM組血漿中的TG、TC、LDL-C明顯高于NC組，表現(xiàn)出明顯的脂代謝紊亂；AST、ALT水平高于NC組，表現(xiàn)出肝功受損；FPG、HAb1c、FINs、HOMA-IR水平均高于NC組，提示胰島素抵抗，這與韓等人［21］研究結(jié)果一致。IPGTT和ITT試驗(yàn)表明T2DM組胰島素分泌節(jié)律異常，從而說(shuō)明其T2DM組的胰島功能受損。相關(guān)分析顯示大鼠肝臟組織中circRNA-000334表達(dá)水平與F P G、T G、T C 呈負(fù)相關(guān)，提示circRNA-0003340可能參與糖脂代謝，促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。與NC組相比，T2DM組中circRNA-0003340在肝臟組織中表達(dá)水平下調(diào)，而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在SD大鼠T2DM組的外周血中circRNA-0003340表達(dá)水平上調(diào)，這與本研究結(jié)果相悖［11］，查閱相關(guān)文獻(xiàn)提示其可能與環(huán)狀RNA的組織特異性或時(shí)間特異性相關(guān)。在Zhao等［22］研究中發(fā)現(xiàn)circRNA SCAR在非酒精性脂肪性肝炎的肝臟組織中的表達(dá)水平是下調(diào)的。Piwecka等人研究發(fā)現(xiàn)ciRS-7/CDR1as在腦組織中表達(dá)量最高，而在其他組織表達(dá)水平明顯低下，且病理狀態(tài)下會(huì)抑制circRNA的表達(dá)［23-24］，再次論證了circRNA功能的特殊性。

綜上所述，2 型糖尿病大鼠肝臟組織中circRNA-0003340的表達(dá)水平是明顯下調(diào)的，可能通過(guò)參與糖脂代謝來(lái)影響2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。