趙瑞玲 林彩霞

1 廣州市越秀區(qū)兒童醫(yī)院 （廣州 510000）

2 廣東藥科大學(xué) （廣州 510000）

糖尿病腎病是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，也是我國導(dǎo)致終末期腎臟病的常見病因。血糖控制不佳、糖尿病病程長是糖尿病腎病發(fā)病的相關(guān)因素，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞在高糖環(huán)境下發(fā)生損傷是與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物學(xué)環(huán)節(jié)［1-2］。有研究報(bào)道，腎小管上皮細(xì)胞在高糖環(huán)境下發(fā)生轉(zhuǎn)分化對(duì)糖尿病腎病發(fā)病過程中的腎臟纖維化、腎功能損害具有促進(jìn)作用，轉(zhuǎn)分化過程涉及炎癥反應(yīng)激活、細(xì)胞外基質(zhì)沉積［3-4］。核因子-κB激活劑1（NF-κB activator 1，Act1）是近些年新發(fā)現(xiàn)的炎癥調(diào)控基因，該基因表達(dá)的蛋白能夠在胞漿中介導(dǎo)炎癥信號(hào)的傳導(dǎo)、促進(jìn)下游NF-κB活化并激活炎癥反應(yīng)。為深入認(rèn)識(shí)Act1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用［5］，本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察了Act1對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

腎小管上皮細(xì)胞株MK2購自中科院上海細(xì)胞資源中心，陰性對(duì)照（negative control，NC）siRNA、Act1 siRNA購自上海吉瑪生物科技公司，總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化科技公司，Act1、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、I型膠原（type I collagen，Col-I）、III型膠原（type III collagen，Col-III）的特異性一抗購自美國Abcam公司，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MK2細(xì)胞復(fù)蘇后在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，然后收集細(xì)胞、按照1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組處理 傳代后的MK2細(xì)胞按照1×106個(gè)/孔的密度接種在12孔板中，貼壁24 h后進(jìn)行分組處理。對(duì)照組用含有5.5 mmol/L葡萄糖的常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)基處理，高糖組用含有30 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)基處理，每組處理12 h、24 h、48 h、72 h；si-NC在常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染NC siRNA，si-NC+高糖組在含有30 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染NC siRNA，si-Act1在含有30 mmol/L葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染Act1 siRNA，每組連續(xù)處理48 h。

1.2.3 細(xì)胞中基因mRNA表達(dá)水平的檢測 取處理后的MK2細(xì)胞，使用細(xì)胞總RNA提取試劑盒分離提取細(xì)胞中的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用熒光定量檢測試劑盒對(duì)cDNA中Act1、E-cadherin、N-cadherin、Col-I、Col-III的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測，按照試劑盒說明書配置PCR反應(yīng)體系、設(shè)置PCR反應(yīng)程序，以β-Tubulin為內(nèi)參，計(jì)算Act1、E-cadherin、N-cadherin、Col-I、Col-III的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平的檢測 取處理后的MK2細(xì)胞，加入裂解液并在冰上裂解細(xì)胞、提取細(xì)胞蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，將30 μg蛋白樣本用于檢測，在聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃孵育Act1一抗（1∶400稀釋）、E-cadherin一抗（1∶600稀釋）、N-cadherin一抗（1∶500稀釋）、Col-I一抗（1∶1 000稀釋）、Col-III一抗（1∶1 000稀釋）、β-Tubulin一抗（1∶5 000稀釋）過夜。次日，洗膜3次后室溫孵育辣根過氧化物酶二抗（1∶5 000稀釋）1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)中通過化學(xué)發(fā)光得到Act1、E-cadherin、N-cadherin、Col-I、Col-III、β-Tubulin的條帶，根據(jù)蛋白條帶灰度值，以β-Tubulin為內(nèi)參計(jì)算Act1、E-cadherin、N-cadherin、Col-I、Col-III的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞因子含量的檢測 取處理后的MK2細(xì)胞培養(yǎng)基，采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0版本的軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料、以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高糖對(duì)MK2細(xì)胞中Act1表達(dá)的影響

處理12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)，與對(duì)照組比較，高糖組MK2細(xì)胞中Act1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均增加（P＜0.05）；高糖組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較，處理12 h、24 h、48 h時(shí)Act1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均隨處理時(shí)間延長而增加，處理72 h時(shí)Act1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平與處理48 h比較無差異（P＞0.05）。因此后續(xù)選擇處理48 h研究Act1的生物學(xué)功能。

表1 對(duì)照組與高糖組不同時(shí)間點(diǎn)MK2細(xì)胞中Act1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較 n=5

圖1 對(duì)照組與高糖組不同時(shí)間點(diǎn)MK2 細(xì)胞中Act1 蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較

圖2 MK2 細(xì)胞中Act1 的蛋白條帶圖

圖3 3 組MK2 細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達(dá)水平的比較

圖4 3 組MK2 細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達(dá)水平的比較

2.2 常規(guī)葡萄糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染Act1 siRNA對(duì)MK2細(xì)胞中Act1表達(dá)的影響

在常規(guī)葡萄糖環(huán)境下進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，處理48 h時(shí)，si-NC組與si-Act1組MK2細(xì)胞中Act1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 si-NC組與si-NC+高糖組MK2細(xì)胞中Act1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較 n=5

在高糖環(huán)境下進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，處理48 h時(shí)，與si-NC組比較，si-NC+高糖組MK2細(xì)胞中Act1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.05）；與si-NC+高糖組比較，si-Act1+高糖組MK2細(xì)胞中Act1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。表3。

表3 3組MK2細(xì)胞中Act1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較 n=5

2.3 敲低Act1對(duì)高糖處理MK2細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子含量的影響

處理48 h時(shí)，與si-NC組比較，si-NC+高糖組MK2細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均增加（P＜0.05）；與si-NC+高糖組比較，si-Act1+高糖組MK2細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均降低（P＜0.05）。表4。

表4 3組MK2細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量的比較 n=5

2.4 敲低Act1對(duì)高糖處理MK2細(xì)胞中EMT基因表達(dá)的影響

處理48 h時(shí)，與si-NC組比較，si-NC+高糖組MK2細(xì)胞中E-cadherin的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低，N-cadherin的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均增加（P＜0.05）；與si-NC+高糖組比較，si-Act1+高糖組MK2細(xì)胞中E-cadherin的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均增加，N-cadherin的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。見表5。

表5 3組MK2細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin mRNA表達(dá)水平的比較 n=5

2.5 敲低Act1對(duì)高糖處理MK2細(xì)胞中Col-I、Col-III表達(dá)的影響

處理48 h時(shí)，與si-NC組比較，si-NC+高糖組MK2細(xì)胞中Col-I、Col-III的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均增加（P＜0.05）；與si-NC+高糖組比較，si-Act1+高糖組MK2細(xì)胞中Col-I、Col-III的mRNA相對(duì)表達(dá)水平和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。見表6。

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中重要的病理特征之一，表現(xiàn)為腎小球細(xì)胞外基質(zhì)聚積，最終對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)和功能造成不可逆損害［6-7］。高糖作用于腎臟、刺激腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程涉及炎癥反應(yīng)的激活、過度的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)的過度合成和聚積等生物學(xué)環(huán)節(jié)［8-10］，但調(diào)控上述生物學(xué)環(huán)節(jié)的機(jī)制尚不十分清楚。

Act1是近些年新發(fā)現(xiàn)的炎癥調(diào)控基因，編碼產(chǎn)物具有多個(gè)炎癥反應(yīng)調(diào)控結(jié)構(gòu)域，在炎癥性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺部感染等疾病中通過與多種TRAF蛋白結(jié)合的方式促進(jìn)下游NF-κB活化、啟動(dòng)多種炎癥基因表達(dá)、促進(jìn)炎癥反應(yīng)激活［11-12］。為認(rèn)識(shí)Act1在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究首先在高糖處理的腎小管上皮細(xì)胞中觀察了Act1表達(dá)的變化，高糖處理后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中Act1的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加，表明Act1高表達(dá)可能參與糖尿病腎病的發(fā)生以及高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

腎小管上皮細(xì)胞中Act1在高糖誘導(dǎo)下表達(dá)增加的趨勢(shì)具有時(shí)間依賴性并且Act1表達(dá)增加在高糖處理48 h時(shí)達(dá)到峰值，隨著處理時(shí)間延長至72 h、Act1的表達(dá)水平未進(jìn)一步增加。因此，選擇高糖處理48 h的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行Act1生物學(xué)功能的研究。為了驗(yàn)證高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞中Act1表達(dá)增加的生物學(xué)意義，本研究通過轉(zhuǎn)染siRNA手段在高糖環(huán)境下敲低Act1的表達(dá)，而后觀察腎間質(zhì)纖維化過程中腎小管轉(zhuǎn)分化相關(guān)的炎癥反應(yīng)激活、細(xì)胞外基質(zhì)聚集等環(huán)節(jié)的變化。

高糖作用于腎小管上皮細(xì)胞能夠激活炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成。炎癥反應(yīng)激活的過程涉及TNF-α、IL-1β、IFN-γ等多種促炎細(xì)胞因子的大量釋放［13-15］；細(xì)胞外基質(zhì)合成的過程中涉及細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及膠原的表達(dá)增加［16-17］。本研究在高糖處理的腎小管上皮細(xì)胞中檢測到TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量以及N-cadherin、Col-I、Col-III表達(dá)增加，E-cadherin表達(dá)降低，與既往糖尿病腎病發(fā)病過程中間質(zhì)纖維化的研究結(jié)果吻合。在高糖環(huán)境下敲低Act1后，細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量以及N-cadherin、Col-I、Col-III表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)增加，表明Act1參與高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)激活、細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)增加。

綜上所述，高糖促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞中Act1的表達(dá)；Act1表達(dá)增加對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)激活和細(xì)胞外基質(zhì)增多具有促進(jìn)作用。