陳立喜，陳元良，卓澤銘，王和杰

慢性骨髓炎是細菌感染引起的伴有骨質破壞的慢性炎癥過程，好發(fā)于開放性骨折或創(chuàng)傷后多次手術人群，骨折部位不穩(wěn)定、置入固定物、軟組織損傷、清創(chuàng)不徹底等因素可引起感染后局部組織潰爛、骨壞死，導致病情反復發(fā)作，經久不愈［1-2］。手術徹底清創(chuàng)后抗菌藥物灌注治療是目前臨床上治療慢性骨髓炎的主要方式，但抗菌藥物長期使用會增加致病菌耐藥性，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染引起的慢性骨髓炎發(fā)病率呈升高趨勢［3］。利奈唑胺屬于唑烷酮類抗菌藥物，可通過抑制細菌蛋白質合成來滅殺甲氧西林耐藥革蘭陽性球菌［4］。慢性骨髓炎引起的骨骼肌纖維化、瘢痕形成是導致患者肢體功能障礙的主要因素，轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1 是組織纖維化過程中的重要分子標志物，已被證實在創(chuàng)傷性骨髓炎大鼠骨組織中表達明顯升高［5］。TGF-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenic protein，BMP）是哺乳動物骨形成生理過程中的重要信號通路之一，TGF-β1/BMP-2 可協同促進骨分化過程［6］。本研究通過MRSA 構建慢性骨髓炎大鼠模型，給予利奈唑胺干預，初步探究利奈唑胺的作用效果是否與TGF-β/BMP 信號通路變化有關，旨在為慢性骨髓炎的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級健康雄性Wistar 大鼠45 只，6～8 周齡，體質量290～350 g，購自廣東維通利華實驗動物技術有限公司［動物生產許可證號：SCXK（粵）2022-0063］，飼養(yǎng)于海南醫(yī)學院動物房。實驗動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水和攝食，飼養(yǎng)室溫度24～25 ℃，相對濕度12%，光/暗循環(huán)為12 h。動物實驗相關操作嚴格遵守中華人民共和國國家標準GB/T35892-2018《實驗動物福利倫理審查指南》。MRSA 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；利奈唑胺葡萄糖注射液（國藥準字：H20150223）購自江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司；TGF-β1、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6 檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；兔源抗TGF-β1、激活素受體樣激酶1（activin receptor-like kinase 1，ALK-1）、BMP-2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam公司；兔源抗Smad1/5、p-Smad1/5抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；BX53型顯微鏡購自日本日立公司；Western blot 電泳儀、ChemiDoc MP 凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司；Multuskan Go 1510 酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 動物分組、建模及干預

以隨機數字表法將45只Wistar大鼠分為假手術組、模型組、利奈唑胺組，各15只。參考文獻［7］方法造模：大鼠稱質量后以氯胺酮（10 mg/kg）腹部皮下注射麻醉，8%硫化鈉（Na2S）擦拭膝關節(jié)及小腿皮膚脫毛，完成后生理鹽水反復沖洗，仰臥位固定于手術臺，于膝關節(jié)沿脛骨內側做1.5 cm 切口，依次剝開骨膜后暴露脛骨上端，于膝關節(jié)下10 mm處，用2.5 mm 鉆頭鉆入骨髓腔，挖出部分骨髓后形成空腔；模型組、利奈唑胺組大鼠于空腔內接種10 μL 含1.0×108CFU/mL 的MRSA懸液，接種后，將長度為5 mm、厚度為1 mm的克氏針插入脛骨腔，使用牙科石膏填充鉆孔，縫合皮膚并應用聚維酮碘溶液消毒。造模后7 d，利奈唑胺組大鼠參考文獻［8］中利奈唑胺的使用劑量腹腔注射54 mg/kg，假手術組及模型組給予等體積葡萄糖注射液，連續(xù)14 d。

1.3 指標觀察

1.3.1 傷口愈合及Rissing、Norden評分觀察

（1）末次給藥結束后7 d，根據傷口愈合標準［9］進行觀察，記錄各組大鼠甲、乙、丙級愈合情況。甲級愈合：傷口愈合良好；乙級愈合：愈合處有紅腫、血腫、積液等炎癥反應，但未化膿；丙級愈合：傷口處有化膿。（2）末次給藥結束后7 d，對模型組、利奈唑胺組大鼠右后肢正、側位拍攝X線片，參考改良X 線Norden 骨髓炎評分標準［10］進行半定量評估：①死骨形成。有死骨記3 分，疑似死骨形成記1.5 分，無死骨記0 分。②骨質破壞。有記2分，疑似記1分，無記0分。③骨質增生。有記1 分，疑似記0.5 分，無記0 分。④軟組織炎性包塊影。有記1分，疑似記0.5分，無記0分。最高分7分，分數越高表示骨髓炎程度越嚴重。（3）末次給藥結束后7 d，頸椎脫臼法處死模型組、利奈唑胺組大鼠，稱體質量后，剝離皮膚和筋膜后暴露脛骨組織，肉眼觀察后進行Rissing 評分［9］：嚴重骨質吸收、膿腫，記4分；紅斑并脛骨骨干增粗、竇道形成或膿液滲出，記2 分；少量紅斑，記1 分；無膿腫、紅斑、死骨、水腫和新骨形成，記0分；評分由同一人完成。收集骨髓組織用于細菌負荷測定，并取病灶組織周圍骨骼肌組織凍存后-20 ℃保存，用于酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測。將脛骨組織分成兩部分，一部分4%中性甲醛固定脫鈣后行HE 染色病理觀察，另一部分液氮凍存后-80 ℃保存，用于蛋白免疫印跡檢測。

1.3.2 細菌負荷測定

將骨髓組織勻漿培養(yǎng)于巧克力培養(yǎng)基中，放置5%CO2、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對細菌及菌落情況進行觀察。

1.3.3 HE染色觀察脛骨組織病理改變

取1.3.1中固定脫鈣后的脛骨組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，每組選取3張4μm石蠟切片，脫蠟，蘇木精、伊紅染色后脫水封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 骨骼肌炎性因子水平檢測

將凍存的病灶組織周圍的骨骼肌組織進行勻漿后，采用ELISA法檢測TGF-β1、IL-1β、IL-6等水平，所有操作過程均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.5 蛋白免疫印跡法檢測TGF-β/BMP信號通路相關蛋白表達

取50 mg 凍存的脛骨組織于含液氮的研缽中，磨成粉末后加入離心管中，加入蛋白提取試劑，BCA法檢測蛋白濃度，調整各組蛋白濃度一致后，經SDS-PAGE 凝膠電泳、電轉膜至甲醛預處理過的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，密封2 h，加入兔抗鼠TGF- β1、ALK-1、Smad1/5、p-Smad1/5、BMP-2、GAPDH 一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜，TBST 漂洗40 min，加入HRP 標記的二抗（1∶500）孵育1 h，TBST 漂洗40 min，ECL 發(fā)光液將PVDF膜顯色，曝光，Image J軟件分析條帶灰度值，以目標蛋白與內參蛋白GAPDH條帶灰度值比值表示蛋白的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件和SigmaStat 3.5軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法；2組等級資料比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 利奈唑胺對MRSA 致慢性骨髓炎大鼠創(chuàng)口愈合及Rissing、Norden評分、細菌負荷的影響

末次給藥結束后7 d觀察發(fā)現，假手術組大鼠均為甲級愈合，模型組大鼠乙級愈合3只、丙級愈合12只，利奈唑胺組大鼠乙級愈合9只、丙級愈合6只，各組大鼠創(chuàng)口愈合情況比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=35.111，P＜0.01）。與模型組比較，利奈唑胺組大鼠Rissing、Norden 評分、細菌負荷均降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of Rissing,Norden scores and bacterial load between the model group and the linezolid group表1 模型組與利奈唑胺組大鼠Rissing、Norden評分及細菌負荷比較（n=15，±s）

Tab.1 Comparison of Rissing,Norden scores and bacterial load between the model group and the linezolid group表1 模型組與利奈唑胺組大鼠Rissing、Norden評分及細菌負荷比較（n=15，±s）

＊＊P＜0.01。

組別模型組利奈唑胺組t Rissing評分/分2.85±0.32 1.62±0.38 9.589＊＊Norden評分/分2.75±0.43 1.35±0.31 10.229＊＊細菌負荷/（CFU/mL）2.13±0.42 0.51±0.04 14.871＊＊

2.2 利奈唑胺對MRSA 致慢性骨髓炎大鼠脛骨病理學的影響

假手術組大鼠脛骨無炎癥反應；模型組大鼠局部骨質破壞嚴重，明顯髓腔內及骨膜下膿腫，明顯炎細胞浸潤及局部纖維化；利奈唑胺組大鼠較模型組骨質破壞較輕，炎細胞浸潤及纖維化明顯減輕。見圖1。

Fig.1 Pathological changes of tibia tissue in each group（HE staining,×100）圖1 各組大鼠脛骨組織病理變化（HE染色，×100）

2.3 利奈唑胺對MRSA 致慢性骨髓炎大鼠骨骼肌組織TGF-β1、IL-1β、IL-6水平的影響

與假手術組比較，模型組和利奈唑胺組骨骼肌組織TGF-β1、IL-1β、IL-6水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，利奈唑胺組大鼠骨骼肌組織中TGF-β1、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison on levels of TGF-β1,IL-1β and IL-6 in skeletal muscle tissue between different groups表2 各組大鼠骨骼肌組織TGF-β1、IL-1β、IL-6水平比較（n=15，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison on levels of TGF-β1,IL-1β and IL-6 in skeletal muscle tissue between different groups表2 各組大鼠骨骼肌組織TGF-β1、IL-1β、IL-6水平比較（n=15，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與模型組比較，P＜0.05，表3同。

組別假手術組模型組利奈唑胺組F TGF-β1 21.24±5.17 185.18±16.51a 75.35±23.48ab 369.144＊＊IL-1β 29.51±6.12 115.32±25.73a 58.25±14.38ab 94.726＊＊IL-6 11.35±2.42 69.51±17.64a 28.61±7.25ab 108.634＊＊

2.4 利奈唑胺對MRSA 致慢性骨髓炎大鼠脛骨組織中TGF-β/BMP通路相關蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組和利奈唑胺組脛骨組織中TGF-β1、ALK-1、p-Smad1/5 蛋白表達升高，BMP-2 蛋白降低（P＜0.05）；與模型組比較，利奈唑胺組脛骨組織中TGF-β1、ALK-1、p-Smad1/5 蛋白降低，BMP-2蛋白表達升高（P＜0.05），見表3、圖2。

Fig.2 Expressions of TGF-β/BMP pathway-related proteins detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測TGF-β/BMP通路相關蛋白的表達

Tab.3 Comparison on expression levels of TGF-β1,ALK-1,p-Smad1/5 and BMP-2 in tibia tissue between different groups表3 各組大鼠脛骨組織中TGF-β1、ALK-1、p-Smad1/5、BMP-2蛋白表達水平比較 （n=15，±s）

Tab.3 Comparison on expression levels of TGF-β1,ALK-1,p-Smad1/5 and BMP-2 in tibia tissue between different groups表3 各組大鼠脛骨組織中TGF-β1、ALK-1、p-Smad1/5、BMP-2蛋白表達水平比較 （n=15，±s）

組別假手術組模型組利奈唑胺組F TGF-β1 0.42±0.07 1.18±0.25a 0.78±0.14ab 74.759＊＊ALK-1 0.31±0.05 1.32±0.27a 0.65±0.18ab 110.246＊＊p-Smad1/5 0.35±0.06 0.95±0.24a 0.67±0.17ab 45.017＊＊BMP-2 0.53±0.09 0.35±0.06a 0.42±0.07ab 22.319＊＊

3 討論

細菌感染是慢性骨髓炎的基本病因，骨細胞外基質中的蛋白質可作為MRSA侵入機體后的黏附載體，MRSA持續(xù)增殖后會釋放大量的內毒素，影響骨吸收、骨形成動態(tài)平衡；同時，細菌生物膜可以阻擋抗菌藥物滲入，降低細菌對抗菌藥物的敏感性，使抗菌藥物的抗菌效果減弱，抗菌藥物廣泛使用又會增加細菌的耐藥概率，因而耐藥菌感染所致慢性脊髓炎的臨床治療難度較大［11-12］。利奈唑胺可與細菌50S 亞基的23S 核糖體RNA 上的位點結合，阻止功能性70S 始動復合物的形成，抑制細菌細胞蛋白合成，且與其他抗菌藥物沒有交叉耐藥現象，目前利奈唑胺在多重耐藥革蘭陽性菌所致感染疾病治療中取得明顯效果［13］。本研究旨在通過構建MRSA感染所致慢性骨髓炎模型來探究利奈唑胺對慢性骨髓炎潛在作用機制。

目前用于慢性骨髓炎研究的動物模型類型較多，Wistar 大鼠因其脛骨小、骨質易鉆透、機體耐受力強以及成本低等優(yōu)勢［14］，常用作慢性骨髓炎模型制備的首選實驗動物。慢性骨髓炎大鼠模型制備是否成功與細菌接種劑量關系密切，細菌接種劑量過大可致死，接種劑量過小無法達到模型預期效果，10μL 1×108CFU/mL 是MRSA 目前比較適宜的造模劑量［15］。本研究結果顯示，模型組大鼠創(chuàng)口愈合較差，且創(chuàng)口有流膿現象，而利奈唑胺組大鼠創(chuàng)口愈合情況較模型組得到明顯改善，且Rissing評分、Norden評分和細菌負荷較模型組明顯降低，說明利奈唑胺干預可促進MRSA感染所致慢性骨髓炎創(chuàng)口愈合，改善病灶組織內環(huán)境，可能與降低細菌負荷有關。

本研究結果顯示，模型組大鼠的脛骨組織呈現出局部骨質破壞現象，且髓腔內和骨膜下有膿腫產生，還伴有大量炎性細胞浸潤和局部纖維化，而給予利奈唑胺干預可使慢性骨髓炎大鼠上述病理癥狀得到明顯緩解，說明慢性骨髓炎大鼠處于感染性炎癥反應狀態(tài)，給予利奈唑胺干預可以改善這種炎癥狀態(tài)。細菌感染、創(chuàng)傷愈合過程中均伴有炎癥反應，中性粒細胞、巨噬細胞浸潤會誘導多種生長因子過度表達［16］，TGF-β就是其中一員。TGF-β作為多肽信號分子，可在創(chuàng)傷愈合及瘢痕修復過程中發(fā)揮重要作用［17］。本研究結果顯示，模型組大鼠病灶組織周圍的骨骼肌組織中TGF-β1、IL-1β、IL-6 水平較假手術組升高，而利奈唑胺干預可降低TGF-β1、IL-1β、IL-6 水平，這提示利奈唑胺干預可通過抑菌作用減輕炎癥反應，促進慢性骨髓炎恢復。

TGF-β超家族可通過結合特定的Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸或蘇氨酸激酶受體，將細胞內Smad轉錄因子轉移至細胞核來發(fā)揮其相應作用［18］。ALK-1是TGF-β的Ⅰ型受體，ALK-1 激活可招募Smad1/5 并使Smad1/5磷酸化，磷酸化的Smad1/5被轉運至細胞核后編碼下游效應蛋白合成［19-20］。BMP 是TGF-β 超家族成員之一，具有成骨因子作用，可通過刺激間充質骨祖細胞分化為成熟骨細胞，誘導骨、軟骨及骨相關結締組織形成［21］。BMP-2 是促進骨形成及誘導骨細胞分化重要細胞外信號分子［22］。本研究通過分析慢性骨髓炎大鼠脛骨組織中TGF-β/BMP 信號通路關鍵蛋白表達結果顯示，模型組大鼠骨組織TGFβ1、ALK-1 及p-Smad1/5 蛋白表達較假手術組明顯升高，而BMP-2 蛋白表達較假手術組明顯降低，提示過度活化TGF-β信號通路可能抑制BMP-2表達，從而抑制骨修復，而利奈唑胺干預后可以抑制TGFβ通路，解除過度活化TGF-β信號通路對BMP-2的抑制效用，促進骨修復。

綜上所述，利奈唑胺可通過抑菌作用減輕慢性骨髓炎病灶處的過度炎癥反應，其機制可能是通過抑制TGF-β 通路解除對BMP-2 介導的骨形成抑制作用，從而促進骨修復。本研究初步探討了利奈唑胺對MRSA 感染慢性骨髓炎的可能作用機制，但其防治作用是否與其他信號通路有關尚需進一步探究。