田亞靜,楊雪,汪靜,葛文杰,何玉玲
妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期發(fā)生的一種代謝異常性疾病,可導(dǎo)致流產(chǎn)、巨大兒、早產(chǎn)等不良結(jié)局[1-2]。GDM 患者體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),引發(fā)的強(qiáng)烈氧化應(yīng)激是造成胎盤損傷與不良妊娠結(jié)局的主要原因,抗氧化藥物可緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)[3-4]。 核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)中起重要作用,激活Nrf2 可抑制高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[5],還可上調(diào)抗氧化基因血紅素單加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)/磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶-1(NADPH quinine oxidoreductase-1,NQO1)表達(dá)水平,有效減輕哮喘小鼠炎癥和氧化應(yīng)激損傷[6]。通過(guò)激活Nrf2/HO-1 可改善GDM 小鼠葡萄糖不耐受,抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激,最終改善生殖結(jié)局[7]。因此,筆者推測(cè)Nrf2/HO-1/NQO1是防治GDM的重要作用靶點(diǎn)。芒柄花素又稱刺芒柄花素,是一種異黃酮類化合物,為天然抗氧化劑。研究顯示,芒柄花素能用于多種心腦血管疾病的治療,還可激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路,進(jìn)而降低糖尿病腎病大鼠血糖、血脂,抑制其腎組織氧化應(yīng)激損傷[8-9]。本研究以不同劑量芒柄花素處理GDM模型大鼠,旨在探討芒柄花素是否可通過(guò)激活Nrf2/HO-1/NQO1信號(hào)通路來(lái)減輕GDM大鼠氧化應(yīng)激損傷。
SPF 級(jí)SD 大鼠130 只,雌雄各半,7 周齡左右,體質(zhì)量200~260 g,購(gòu)自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2020-0055。在屏障環(huán)境中分籠飼養(yǎng),4只/籠,飼養(yǎng)嚴(yán)格參照《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。鏈脲佐菌素(純度≥98%)、Nrf2 抑制劑ML385(純度≥98%)、芒柄花素(純度≥99%)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)測(cè)定試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;兔源抗大鼠β-actin 一抗、兔源抗大鼠Nrf2 一抗、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測(cè)試劑盒、兔源抗大鼠HO-1 一抗、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)偶聯(lián)羊抗兔二抗、兔源抗大鼠NQO1一抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)PM4)購(gòu)自天津微納芯科技有限公司;透射電子顯微鏡(型號(hào)Talos L120C)購(gòu)自北京歐波同光學(xué)技術(shù)有限公司;酶標(biāo)儀(型號(hào)YT-MB96A)購(gòu)自山東云唐智能科技有限公司;雙膠迷你垂直電泳槽(型號(hào)VE-180)、轉(zhuǎn)印電泳槽(型號(hào)VE-186)購(gòu)自南京普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所等。
1.2.1 GDM模型建立及分組
參照文獻(xiàn)[10]建立GDM 大鼠模型:選擇空腹血糖(fasting serum glucose,F(xiàn)SG)值正常的SD 大鼠,雌雄比為1∶1合籠過(guò)夜,次日檢查陰道栓得到孕鼠56只(記為孕0 d),隨機(jī)抽取47 只于其腹腔內(nèi)注射45 mg/kg 的鏈脲佐菌素,孕3 d 測(cè)量FSG,≥16.7 mmol/L 表示GDM 造模成功。共成功造模45只,按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、芒柄花素低劑量(50 mg/kg)組[11]、芒柄花素高劑量(100 mg/kg)組[11]、ML385(20 mg/kg)組[12]、芒柄花素高劑量+ML385組,每組9只;另取9只正常妊娠大鼠作為對(duì)照組。芒柄花素和ML385均以生理鹽水溶解至所需濃度,分別采取腹腔注射和灌胃給藥,對(duì)照組給予等劑量生理鹽水,各組均于孕3 d給藥,1次/d,持續(xù)至孕19 d。
1.2.2 大鼠體質(zhì)量及糖脂代謝指標(biāo)測(cè)定
孕20 d時(shí)以乙醚麻醉大鼠(提前禁食禁水12 h),測(cè)量其體質(zhì)量后采集尾靜脈血,放入全自動(dòng)生化分析儀中檢測(cè)FSG、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平。
1.2.3 胚胎存活率、胎鼠體質(zhì)量及胎盤形態(tài)觀察
糖脂代謝測(cè)定結(jié)束后處死各組大鼠,取1.5 mL 尾靜脈血,于4 ℃、3 000 r/min 離心10 min 取上清液,-80 ℃保存?zhèn)溆?。縱向切開腹腔及子宮,從子宮中取出胎鼠和胎盤,對(duì)胎鼠進(jìn)行計(jì)數(shù)并稱質(zhì)量,得出其平均體質(zhì)量,計(jì)數(shù)存活胚胎數(shù)和總胚胎數(shù)(即總著床點(diǎn)數(shù)),計(jì)算胚胎存活率=存活胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%。肉眼觀察各組胎盤的顏色、外觀后剪取約0.8 g 胎盤組織保存在液氮備用,剩余胎盤組織浸入含0.05 mol/L蔗糖的鈣藻酸鹽緩沖液中固定,1 h后浸沒(méi)入2.5%戊二醛中于4 ℃下繼續(xù)固定24 h,使用透射電子顯微鏡觀察胎盤超微結(jié)構(gòu)并采集圖像。
1.2.4 血清及胎盤組織MDA、GSH、SOD和TAC水平檢測(cè)
取1.2.3 中保存在液氮中的胎盤組織,加入高強(qiáng)度RIPA裂解液勻漿,4 ℃、3 000 r/min 離心20 min 取上清液,以BCA法測(cè)定蛋白總濃度后每組取300 μL。取1.2.3 中保存在-80 ℃中的血清于冰水浴中解凍后每組取300μL,按照試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)血清及胎盤組織中MDA、GSH、SOD 和TAC水平。
1.2.5 Western blot法檢測(cè)胎盤組織Nrf2/HO-1/NQO1通路蛋白相對(duì)表達(dá)水平
自1.2.4 中各組剩余的胎盤組織蛋白樣品液中取50 μg總蛋白上樣,跑電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2.5 h后,剪下檢測(cè)蛋白條帶分別孵育兔源抗大鼠β-actin、Nrf2、HO-1、NQO1一抗(稀釋比均為1∶2 000),4 ℃過(guò)夜后TBST振蕩洗膜3 次,室溫孵育HRP 偶聯(lián)羊抗兔二抗(1∶1 000),2 h 后TBST振蕩洗膜3次,通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色并采集蛋白條帶圖像,使用Image J軟件分析定量各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平。
采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與對(duì)照組比較,模型組體質(zhì)量及FSG、TG、TC水平升高(P<0.05)。與模型組比較,芒柄花素低劑量組、芒柄花素高劑量組大鼠體質(zhì)量及FSG、TG、TC水平均降低(P<0.05),而ML385 組大鼠體質(zhì)量及FSG、TG、TC 水平升高(P<0.05)。與芒柄花素低劑量組比較,芒柄花素高劑量組體質(zhì)量及FSG、TG、TC水平降低(P<0.05)。與ML385組比較,芒柄花素高劑量+ML385組大鼠體質(zhì)量及FSG、TG、TC水平降低(P<0.05)。見表1。
Tab.1 Comparison of body weight,blood glucose and blood lipid levels of rats between the six groups表1 各組大鼠體質(zhì)量及血糖、血脂水平比較(n=9,±s)
Tab.1 Comparison of body weight,blood glucose and blood lipid levels of rats between the six groups表1 各組大鼠體質(zhì)量及血糖、血脂水平比較(n=9,±s)
**P<0.01;a與對(duì)照組比較,b與模型組比較,c與芒柄花素低劑量組比較,d與ML385組比較,P<0.05;表2—5同。
組別對(duì)照組模型組芒柄花素低劑量組芒柄花素高劑量組ML385組芒柄花素高劑量+ML385組F母體體質(zhì)量/g 306.85±6.20 356.34±7.14a 332.68±5.25b 310.02±4.39bc 372.69±7.81b 351.73±6.92d 154.591**FSG/(mmol/L)3.54±0.38 17.42±3.13a 10.83±2.34b 4.02±0.54bc 26.79±3.48b 15.21±2.95d 115.158**TG/(mmol/L)0.75±0.08 1.48±0.14a 1.13±0.10b 0.81±0.09bc 1.95±0.19b 1.43±0.12d 117.919**TC/(mmol/L)2.70±0.24 5.15±0.56a 3.89±0.40b 2.78±0.29bc 6.26±0.48b 5.08±0.41d 108.771**
與對(duì)照組比較,模型組大鼠胚胎存活率降低,胎鼠體質(zhì)量升高(P<0.05)。與模型組比較,芒柄花素低劑量組、芒柄花素高劑量組大鼠胚胎存活率均升高,胎鼠體質(zhì)量均降低(P<0.05),而ML385 組大鼠胚胎存活率降低,胎鼠體質(zhì)量升高(P<0.05)。與芒柄花素低劑量組比較,芒柄花素高劑量組大鼠胚胎存活率升高,胎鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)。與ML385組比較,芒柄花素高劑量+ML385組大鼠胚胎存活率升高,胎鼠體質(zhì)量降低(P<0.05)。見表2。
Tab.2 Embryo survival rate and fetal weight of rats in each group表2 各組大鼠胚胎存活率及胎鼠體質(zhì)量(n=9,±s)
Tab.2 Embryo survival rate and fetal weight of rats in each group表2 各組大鼠胚胎存活率及胎鼠體質(zhì)量(n=9,±s)
組別對(duì)照組模型組芒柄花素低劑量組芒柄花素高劑量組ML385組芒柄花素高劑量+ML385組F胚胎存活率/%98.87±1.12 73.12±4.80a 83.84±2.15b 95.03±1.96bc 64.01±2.07b 75.74±3.39d 200.071**胎鼠體質(zhì)量/g 4.14±0.18 5.81±0.33a 5.04±0.23b 4.25±0.14bc 6.53±0.29b 5.74±0.21d 141.104**
對(duì)照組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)正常,無(wú)損傷表現(xiàn)。模型組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷:滋養(yǎng)層細(xì)胞出現(xiàn)空泡且微絨毛密度降低,與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間連接松散。與模型組比較,芒柄花素低劑量組、芒柄花素高劑量組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)損傷表現(xiàn)均減輕,芒柄花素高劑量組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)損傷表現(xiàn)相比芒柄花素低劑量組進(jìn)一步減輕;ML385 組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)損傷表現(xiàn)加重。與ML385 組比較,芒柄花素高劑量+ML385組大鼠胎盤超微結(jié)構(gòu)損傷表現(xiàn)減輕。見圖1。
Fig.1 Ultrastructure of placental tissue of rats in each group observed by transmission electron microscope(×25 000)圖1 透射電鏡觀察各組大鼠胎盤組織超微結(jié)構(gòu)(×25 000)
與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清及胎盤組織MDA 水平升高,GSH、SOD 和TAC 水平降低(P<0.05)。與模型組比較,芒柄花素低劑量組、芒柄花素高劑量組大鼠血清及胎盤組織MDA水平均降低,GSH、SOD 和TAC 水平均升高(P<0.05),而ML385組大鼠血清及胎盤組織MDA 水平升高,GSH、SOD和TAC 水平降低(P<0.05)。與芒柄花素低劑量組比較,芒柄花素高劑量組大鼠血清及胎盤組織MDA水平降低,GSH、SOD 和TAC 水平升高(P<0.05)。與ML385 組比較,芒柄花素高劑量+ML385 組大鼠血清及胎盤組織MDA 水平降低,GSH、SOD 和TAC水平升高(P<0.05)。見表3、4。
Tab.3 Serum levels of MDA,GSH,SOD and TAC in rats of each group表3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH、SOD和TAC水平(n=9,±s)
Tab.3 Serum levels of MDA,GSH,SOD and TAC in rats of each group表3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH、SOD和TAC水平(n=9,±s)
組別對(duì)照組模型組芒柄花素低劑量組芒柄花素高劑量組ML385組芒柄花素高劑量+ML385組F MDA/(nmol/L)2.81±0.32 4.93±0.45a 3.87±0.38b 2.95±0.31bc 6.01±0.48b 4.82±0.43d 87.584**GSH/(U/L)64.62±5.31 40.85±3.08a 49.97±3.53b 60.11±4.12bc 31.53±1.85b 42.04±2.98d 106.674**SOD/(U/L)91.12±7.54 60.78±4.65a 73.89±5.31b 88.67±6.24bc 48.93±3.86b 63.51±4.38d 82.515**TAC/(μmol/L)15.21±1.43 8.16±0.64a 11.08±0.91b 14.74±1.30bc 4.85±0.46b 8.74±0.65d 156.001**
Tab.4 Levels of MDA,GSH,SOD and TAC in placental tissue of rats in each group表4 各組大鼠胎盤組織氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH、SOD和TAC水平(n=9,±s)
Tab.4 Levels of MDA,GSH,SOD and TAC in placental tissue of rats in each group表4 各組大鼠胎盤組織氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH、SOD和TAC水平(n=9,±s)
組別對(duì)照組模型組芒柄花素低劑量組芒柄花素高劑量組ML385組芒柄花素高劑量+ML385組F MDA/(μmol/g)3.80±0.43 11.59±1.07a 7.87±0.92b 4.12±0.50bc 14.86±1.48b 10.93±0.95d 189.401**GSH/(U/mg)35.13±4.02 8.26±1.15a 16.14±2.36b 34.09±3.72bc 1.57±0.22b 9.05±1.17d 281.457**SOD/(U/mg)18.64±1.56 7.06±0.72a 11.89±1.03b 17.03±1.26bc 1.95±0.34b 7.86±0.81d 343.036**TAC/(μmol/g)10.68±1.02 4.51±0.53a 7.08±0.71b 9.97±0.94bc 2.04±0.36b 4.93±0.48d 197.627**
與對(duì)照組比較,模型組大鼠胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組比較,芒柄花素低劑量組、芒柄花素高劑量組大鼠胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達(dá)均升高(P<0.05),而ML385組大鼠胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與芒柄花素低劑量組比較,芒柄花素高劑量組大鼠胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。與ML385組比較,芒柄花素高劑量+ML385 組大鼠胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見圖2、表5。
Fig.2 Expression of Nrf2/HO-1/NQO1 pathway protein in placental tissue of rats in each group detected by Western blot assay圖2 各組大鼠胎盤組織Nrf2/HO-1/NQO1通路蛋白表達(dá)
Tab.5 Relative expression level of Nrf2/HO-1/NQO1 pathway protein in placental tissue of rats in each group表5 各組大鼠胎盤組織Nrf2/HO-1/NQO1通路蛋白相對(duì)表達(dá)水平(n=9,±s)
Tab.5 Relative expression level of Nrf2/HO-1/NQO1 pathway protein in placental tissue of rats in each group表5 各組大鼠胎盤組織Nrf2/HO-1/NQO1通路蛋白相對(duì)表達(dá)水平(n=9,±s)
組別對(duì)照組模型組芒柄花素低劑量組芒柄花素高劑量組ML385組芒柄花素高劑量+ML385組F Nrf2 0.96±0.11 0.35±0.04a 0.61±0.07b 0.90±0.09bc 0.10±0.02b 0.39±0.05d 205.157**HO-1 1.02±0.14 0.39±0.06a 0.65±0.08b 0.97±0.13bc 0.15±0.04b 0.43±0.07d 120.488**NQO1 1.13±0.19 0.41±0.08a 0.72±0.10b 1.08±0.15bc 0.20±0.05b 0.45±0.06d 95.741**
目前,口服降糖藥和胰島素注射是GDM主要治療方案,但長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)母嬰均可造成一定危害[13-14]。本研究采用腹腔注射鏈脲佐菌素的方法誘導(dǎo)建立GDM模型,結(jié)果顯示造模大鼠體質(zhì)量、FSG、TG、TC、胎鼠體質(zhì)量較對(duì)照組升高,抗氧化活力降低,致使大鼠胎盤萎縮且超微結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷,胚胎存活率明顯降低,表明鏈脲佐菌素可導(dǎo)致孕鼠糖脂代謝紊亂,引發(fā)高強(qiáng)度氧化應(yīng)激,損害胎盤結(jié)構(gòu)及胎鼠正常發(fā)育,導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局。
GDM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中ROS過(guò)量產(chǎn)生及抗氧化能力下降是重要的發(fā)病機(jī)制之一,拮抗患者體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷是防治GDM 的有效手段[3-4,15-16]。芒柄花素是一種天然抗氧化劑,能通過(guò)提升機(jī)體抗氧化活力而對(duì)組織器官發(fā)揮保護(hù)作用[8]。它可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激而改善膿毒癥誘導(dǎo)的大鼠急性腎功能損傷[17],還可緩解糖尿病小鼠氧化應(yīng)激損傷,改善其認(rèn)知功能[18],因而預(yù)測(cè)芒柄花素可能用于防治GDM。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,芒柄花素低劑量和高劑量組大鼠血清及胎盤組織GSH、SOD、TAC水平升高,胚胎存活率升高,母體體質(zhì)量、FSG、TG、TC、胎鼠體質(zhì)量、血清及胎盤組織MDA 水平降低,表明芒柄花素可改善糖脂代謝,降低GDM大鼠血糖及血脂水平,提升其抗氧化活力,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),減輕大鼠胎盤結(jié)構(gòu)損傷,促使胎鼠存活,提示芒柄花素能減輕GDM 大鼠氧化應(yīng)激損傷,芒柄花素在GDM的防治中有很好的發(fā)展前景。
Nrf2/HO-1/NQO1是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化信號(hào),可通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)參與缺血性腦卒中、GDM 等疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,激活該通路可抑制氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元ROS 和過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 生成,提升抗氧化酶活性,通過(guò)抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[19]?;謴?fù)GDM小鼠Nrf2/HO-1信號(hào)活性可減輕其體內(nèi)氧化應(yīng)激,改善GDM癥狀及不良妊娠結(jié)局[20]。張馨允等[9]研究表明,芒柄花素可激活Nrf2/HO-1 信號(hào),減輕糖尿病腎病大鼠腎臟氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,ML385組大鼠血清及胎盤組織GSH、SOD、TAC水平下降,胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表達(dá)及胚胎存活率降低,母體體質(zhì)量、FSG、TG、TC、胎鼠體質(zhì)量、血清及胎盤組織MDA 水平升高,表明抑制Nrf2表達(dá)可增強(qiáng)GDM大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),加重胎盤結(jié)構(gòu)損傷及不良妊娠結(jié)局。與ML385 組比較,芒柄花素高劑量+ML385 組大鼠血清及胎盤組織GSH、SOD、TAC 水平升高,胎盤組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)及胚胎存活率升高,母體體質(zhì)量、FSG、TG、TC、胎鼠體質(zhì)量、血清及胎盤組織MDA水平降低,說(shuō)明芒柄花素可逆轉(zhuǎn)ML385的作用,提示芒柄花素減輕GDM大鼠氧化應(yīng)激損傷是通過(guò)激活Nrf2信號(hào)實(shí)現(xiàn)。
綜上所述,芒柄花素可改善GDM 大鼠糖脂代謝,降低其血糖血脂,增強(qiáng)抗氧化活性,抑制大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激,減輕其胎盤損傷,提高胎鼠發(fā)育存活率,改善不良妊娠結(jié)局,激活Nrf2/HO-1/NQO1 信號(hào)通路可能是其藥理機(jī)制之一。本文證實(shí)了芒柄花素對(duì)GDM 的防治作用,為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù),但其具體的藥理機(jī)制還不夠深入,Nrf2信號(hào)下游分子調(diào)控機(jī)制不清楚,還需更多實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探討。