張玲娣, 趙 亮, 由 涌, 許 倩, 楊振軍

（1.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北 承德 067000；3.承德醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北 承德 067000；4.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，河北 承德 067000）

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，其能夠進(jìn)行自我更新，具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞潛能的原始未分化細(xì)胞的能力［1-2］。NSCs 不僅可以通過分化為神經(jīng)元進(jìn)行神經(jīng)替代，還具有增加內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子釋放、促進(jìn)血管生成和突觸重建及抑制免疫炎癥等作用［3-7］。因此，NSCs 已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

研究［8-11］發(fā)現(xiàn)：哺乳動(dòng)物胚胎時(shí)期在大腦皮質(zhì)、嗅球、紋狀體和海馬區(qū)等不同腦區(qū)均存在NSCs。成年哺乳動(dòng)物腦組織中NSCs 存在于側(cè)腦室的腦室下區(qū)及海馬區(qū)的齒狀回顆粒下層［12-13］。本研究對(duì)既往方法［14-16］進(jìn)行改良，體外分離培養(yǎng)新生SD 大鼠海馬組織中NSCs，鑒定NSCs 純度并觀察培養(yǎng)過程中NSCs 形態(tài)表現(xiàn)和生長(zhǎng)規(guī)律變化，為原代海馬組織中NSCs 提取及培養(yǎng)提供參考，并為相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供可靠細(xì)胞來源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器新生24 h 內(nèi)SD大鼠由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK （京）2019-0008。DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、B-27、L-谷氨酰胺（L-glutamine）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自美國(guó)Thermo Fisher 公司，青-鏈霉素混合液和細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司，Nestin多克隆一抗、AF-488 標(biāo)記的羊抗兔二抗、流式抗體標(biāo)記液和抗體封閉液購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，EdU-555 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒和DAPI 染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。眼科手術(shù)器械經(jīng)高壓滅菌烘干后使用；超凈臺(tái)（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本普和希公司），倒置生物顯微鏡、流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司），臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司）。

1.2 新生大鼠海馬組織分離和處理取新生24 h內(nèi)SD 新生大鼠，異氟烷氣霧麻醉，75%乙醇浸泡消毒5 min，斷頸取頭部，移入超凈臺(tái)。剝離皮膚和顱骨，暴露皮質(zhì)下海馬組織（圖1）。取新生大鼠海馬組織置入預(yù)冷PBS 緩沖液中洗凈血液，加入Accutase 1.5～2.0 mL 置于培養(yǎng)箱中，37 ℃、5%CO2混勻消化10 min，輕柔吹打至無肉眼可見組織團(tuán)塊，1 000 r·5 min－1高速離心，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照（1～10）×105mL－1的密度接種于T25 培養(yǎng)瓶中［16］，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。

1.3 原代海馬組織中NSCs 培養(yǎng)、傳代和形態(tài)表現(xiàn)觀察取海馬組織中NSCs，對(duì)培養(yǎng)第2 天獲得的原代細(xì)胞進(jìn)行純化，采用半量換液的方法去除培養(yǎng)基上層漂浮的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，細(xì)胞吹散過200 目細(xì)胞篩（孔徑75 μm）進(jìn)一步去除腦膜組織和血管，純化后細(xì)胞按照（1～10）×105mL－1的密度接種于T25 培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱懸浮培養(yǎng)。自培養(yǎng)第2 天開始，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并采集圖像，每2 天半量更換上層培養(yǎng)基。

原代取材的海馬組織中NSCs 通常2～3 d 傳代1 次，傳代時(shí)主要采用機(jī)械吹打法結(jié)合酶消化法進(jìn)行。海馬組織中NSCs 以神經(jīng)球的形式懸浮生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)球體積逐漸增大，當(dāng)觀察到神經(jīng)球的中心部分折光性變差時(shí)，即可進(jìn)行傳代。第1 和2 代神經(jīng)球結(jié)構(gòu)松散，離心后直接用200 μL 槍頭輕柔吹打，即可將神經(jīng)球吹散成單細(xì)胞懸液狀態(tài)；至第3 代以后細(xì)胞之間黏附緊密，神經(jīng)球的結(jié)構(gòu)致密，需離心后加入細(xì)胞消化液消化，再用200 μL槍頭輕柔吹散成單細(xì)胞懸液，1 000 r·5 min－1高速離心去除細(xì)胞消化液，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照（1～10）×105mL－1的密度接種于T25 培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱懸浮培養(yǎng)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原代海馬組織中NSCs純度

細(xì)胞培養(yǎng)至第8 天時(shí)倒置顯微鏡下觀察可見，視野內(nèi)雜質(zhì)和死細(xì)胞數(shù)明顯減少。以取材當(dāng)天海馬組織提取細(xì)胞，即原代海馬組織NSCs 第0 天作為對(duì)照組，對(duì)培養(yǎng)第8 天NSCs 進(jìn)行純度鑒定，繪制流式單參數(shù)直方圖。分別取培養(yǎng)第0 天和培養(yǎng)第8 天NSCs，吹散神經(jīng)球制成單細(xì)胞懸液，4%多聚甲醛固定，0.3%Triton 透膜，3%BSA 封閉，1∶100 Nestin 一抗孵育，AF-488 標(biāo)記二抗，以每管8×105mL－1的密度轉(zhuǎn)移至流式管中，檢測(cè)NSCs 純度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 免疫熒光法檢測(cè)NSCs 中Nestin 和EdU 蛋白表達(dá)分別取培養(yǎng)第2 和8 天的細(xì)胞，置于層黏連蛋白處理過的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入1∶500 的含EdU 的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)48 h，采用EdU 標(biāo)記細(xì)胞并使細(xì)胞貼壁。4% 多聚甲醛固定，0.3% Triton 透膜，3%BSA 封閉。1∶400 Nestin 一抗4 ℃孵育過夜，AF-488 標(biāo)記二抗，100 μL DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核。激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)NSCs 增殖活性取培養(yǎng)第2 天過濾后細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105mL－1，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第2、5、8、11、14 和17 天采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每次取5 個(gè)復(fù)孔，共6 次。依據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 CCK-8 法檢測(cè)NSCs 增殖活性取培養(yǎng)第2 天過濾后細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105mL－1，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第2、5、8、11、14 和17 天檢測(cè)，共計(jì)6 次。加入20 μL CCK-8 溶液，每次測(cè)量5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱孵育6 h，采用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm 處檢測(cè)各孔吸光度（A）值，繪制細(xì)胞增殖活性曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)值和A 值均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)不同時(shí)間海馬組織中NSCs 形態(tài)表現(xiàn)

培養(yǎng)第0 天，海馬組織中NSCs 以單細(xì)胞形式懸浮于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)第2 天，海馬組織中NSCs開始聚集為大小不等和形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán)塊，懸浮生長(zhǎng)。此后以細(xì)胞團(tuán)塊為中心開始增殖，形成懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)細(xì)胞球，隨時(shí)間的延長(zhǎng)神經(jīng)球體積逐漸增大。培養(yǎng)第8 天，可見神經(jīng)球大小不一，呈圓形或橢圓形桑葚狀，邊界清晰，折光度高，無明顯突起，神經(jīng)球中心部位細(xì)胞密集，折光性差，顏色暗黑。見圖2。

圖2 培養(yǎng)不同時(shí)間海馬組織中NSCs 形態(tài)表現(xiàn)Fig.2 Morphology of NSCs in hippocampus tissue after cultured for different time

2.2 海馬組織中NSCs 的純度鑒定原代培養(yǎng)第0 天，海馬組織中NSCs 純度為5.78%。原代培養(yǎng)第8 天，海馬組織中NSCs 純度可達(dá)76.50%～85.40%，可滿足實(shí)驗(yàn)需要。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間海馬組織中NSCs 純度Fig.3 Purities of NSCs in hippocampus tissue after cultured for different time detected by flow cytometry

激光共聚焦顯微鏡下可見，NSCS 中特異性標(biāo)記蛋白Nestin 在細(xì)胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)（綠色），細(xì)胞增殖標(biāo)記物EdU 在細(xì)胞核中呈陽性表達(dá)（紅色），DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色。培養(yǎng)第2 天海馬組織中NSCs 聚集為大小不等和形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞團(tuán)塊，培養(yǎng)第8 天時(shí)海馬組織中NSCs 聚集為個(gè)體較大的神經(jīng)球。視野內(nèi)可見神經(jīng)球?yàn)镹estin 與EdU共染細(xì)胞構(gòu)成，提示本研究提取的細(xì)胞為具有分裂和增殖能力的NSCs，神經(jīng)球由具有增殖能力的NSCs 聚集而成。見圖4。

圖4 免疫熒光法檢測(cè)培養(yǎng)不同時(shí)間海馬組織中Nestin 和EdU 表達(dá)情況Fig.4 Expressions of Nestin and EdU in hippocampus tissue after cultured for different time detected by immunofluorescence

2.3 原代海馬組織中NSCs 增殖活性細(xì)胞增殖標(biāo)記物EdU 在細(xì)胞核呈陽性表達(dá)（紅色），與培養(yǎng)第2 天比較，培養(yǎng)第8 天時(shí)海馬組織中NSCs 中EdU 表達(dá)明顯增加，NSCs 增殖活性明顯增強(qiáng)。見圖4。結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和CCK-8 法繪制的細(xì)胞增殖活性曲線分析，培養(yǎng)5～11 d，NSCs 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增殖速度快，細(xì)胞增殖活性較高，從培養(yǎng)第14 天開始，NSCs 增殖進(jìn)入平臺(tái)期，增殖速度減緩。見圖5。

圖5 各組大鼠海馬組織中NSCs 生長(zhǎng)曲線(A)和細(xì)胞增殖活性曲線(B)Fig.5 Growth curve(A) and proliferation activity curve(B) of NSCs in hippocampus tissue of rats in various groups

3 討 論

NSCs 具有增殖和分化能力，可以分化為神經(jīng)元，參與神經(jīng)修復(fù)，且其免疫原性極低，是理想的細(xì)胞治療材料［17］。與永生化細(xì)胞系比較，原代培養(yǎng)NSCs 直接取自活體組織，離體時(shí)間短且體外培養(yǎng)代次少，能更好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)。因此，采用原代培養(yǎng)NSCs 可以更好地建立細(xì)胞疾病模型，高效率穩(wěn)定地獲得NSCs，并進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增。

研究［18］采用孕14.5 d 胎鼠大腦半球作為取材部位提取NSCs，取材過程繁瑣且時(shí)間較長(zhǎng)，細(xì)胞死亡率較高。本研究以新生大鼠海馬組織作為取材對(duì)象，取材部位更接近成年大鼠NSCs 存在部位，細(xì)胞相似度高；肉眼直視下即可完整分離海馬組織，取材難度低，減少了污染風(fēng)險(xiǎn)；取材速度快，可以減少缺血所導(dǎo)致的腦細(xì)胞損傷。與大腦半球比較，海馬組織結(jié)構(gòu)完整易于分離，腦膜和血管組織相對(duì)較少，取材過程中無需剝離腦膜組織，培養(yǎng)第2 天經(jīng)細(xì)胞篩過濾即可完全去除腦膜和血管組織，減少了由于機(jī)械分離和操作時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷［19］。

原代取材的細(xì)胞中有腦膜組織、血管組織、神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和死亡細(xì)胞混入，因此取材后需進(jìn)一步純化，以獲得高純度高一致性的NSCs。本研究采用3 步法進(jìn)行細(xì)胞純化。取材后采用細(xì)胞篩過濾去除腦膜和血管組織。神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，死亡細(xì)胞及細(xì)胞崩解產(chǎn)物漂浮于培養(yǎng)基上層，NSCs 以神經(jīng)球形態(tài)懸浮生長(zhǎng)。根據(jù)上述特性，在培養(yǎng)過程中通過丟棄貼壁細(xì)胞以去除神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞；通過半量換液去除上層培養(yǎng)基中漂浮的死亡細(xì)胞及細(xì)胞崩解產(chǎn)物；根據(jù)NSCs 聚集成的神經(jīng)球體積偏大且低速離心即可使神經(jīng)球沉積的特點(diǎn)，在傳代過程中通過低速離心換液，進(jìn)一步去除漂浮于培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，從而達(dá)到NSCs 純化。本研究結(jié)果顯示：NSCs 純度可達(dá)76.50%～85.40%，能夠滿足實(shí)驗(yàn)需要。

Nestin 蛋白是NSCs 最具代表性的標(biāo)志物［20］，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期階段的神經(jīng)上皮干細(xì)胞中表達(dá)，隨著神經(jīng)細(xì)胞的遷移，Nestin 蛋白表達(dá)水平降低，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞完成分化時(shí)，Nestin 蛋白停止表達(dá)，因此被廣泛地應(yīng)用于鑒定NSCs。EdU 是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中代替胸腺嘧啶摻入正在復(fù)制的DNA 分子中，可以快速和準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖能力［21］。本研究采用Nestin和EdU 對(duì)NSCs 進(jìn)行免疫共標(biāo)記染色，結(jié)果顯示：海馬組織提取的細(xì)胞為具有增殖能力的NSCs。且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，NSCs 分裂和增殖增多，NSCs 形成的神經(jīng)球體積逐漸增大，Nestin 與EdU共染陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，神經(jīng)球外周光滑，無明顯突起，表明在一定的體外培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，NSCs 能很好地保持干性潛能。

來源于新生SD 大鼠海馬組織的NSCs 在體外培養(yǎng)過程中不能長(zhǎng)期保持高度增殖能力和增殖活性，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和培養(yǎng)代次的增加，細(xì)胞活性和增殖能力明顯降低。本研究結(jié)果顯示：培養(yǎng)0～3 d，NSCs 增殖活性較低，生長(zhǎng)較緩慢，神經(jīng)球形成速度較慢；培養(yǎng)5～11 d 時(shí)NSCs 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞狀態(tài)最好，可以保持較高的細(xì)胞增殖活性和增殖能力，神經(jīng)球形成速度較快；培養(yǎng)第14 天開始，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞增殖活性和增殖能力開始降低。因此，相關(guān)實(shí)驗(yàn)盡量選用培養(yǎng)5～11 d 的NSCs。

綜上所述，本研究探討了NSCs 原代培養(yǎng)的提取和純化方法，對(duì)NSCs 進(jìn)行純度鑒定，觀察培養(yǎng)過程中NSCs 增殖活性變化，為相關(guān)研究提供參考。