蘇 敏,錢 純,張 貞,姜思宇,李 菁,李云豪,周 輝

蘇敏,錢純,張貞,姜思宇,李菁,李云豪,周輝,湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心 湖南省長沙市 410000

蘇敏,主管技師,研究方向為消化疾病醫(yī)學檢驗.

0 引言

腸結核是由結核分枝桿菌引起的一類常見肺外結核病.結核病是全球第三大致死性疾病,尤其好發(fā)于發(fā)展中國家[1].在全球范圍內,肺外結核病占總結核病的20%,而腸結核占所有肺外結核的10%[2].腸結核的臨床表現(xiàn)主要是腹痛腹瀉、腹部包塊等,且治療預后較差,常常引發(fā)腸狹窄、梗阻、穿孔出血等危及生命的并發(fā)癥[2,3].類似傳統(tǒng)的抗肺結核化療方案雖能緩解癥狀,但具體的治療方案及療程國際上仍無明確標準[4,5].而且長時間的使用抗結核化療藥物可引發(fā)不同程度的藥物不良反應[6].隨著祖國醫(yī)學的日益發(fā)展,越來越多的中醫(yī)療法或中藥方劑在治療腸結核上展現(xiàn)出了較好的療效,長時間使用也不會出現(xiàn)嚴重的藥物不良反應[7,8].

附子理中丸是中醫(yī)上常用于腸結核治療的一種藥物.據(jù)《本草綱目》記載,附子理中丸可以治療“癰瘡腫毒、腹中積滯、結核氣痛、風寒痹痛”等癥.東漢張仲景所著《金匱要略》中提及附子理中丸可用于治療“痰迷、寒結、滿悶、疝瘕、腹中有熱氣、氣滯疼痛”.一項現(xiàn)代臨床研究表明[9],附子理中丸聯(lián)合抗結核藥物治療腸結核的療效顯著優(yōu)于單純應用抗結核藥物.但因為中藥成分繁多,具體的藥物作用機制極其復雜,目前尚無明確的研究能夠解釋附子理中丸治療腸結核的作用機制.為此,本研究將基于網(wǎng)絡藥理學初步探索附子理中丸在腸結核治療上的生物學作用機制,為未來的臨床或基礎研究奠定理論基礎.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 公共數(shù)據(jù)集: 附子理中丸相關藥物活性成分及作用靶蛋白下載自中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫(TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),腸結核的相關疾病靶點下載自Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/).

1.1.2 分析軟件: 本研究所使用的數(shù)據(jù)分析均由基于R Studio平臺的R4.1.2軟件完成.

1.2 方法

1.2.1 藥物活性成分及靶點篩選: 應用TCMSP數(shù)據(jù)庫分別檢索附子理中丸中附子、干姜、黨參、白術、甘草的有效成分.口服生物利用度(oral bioavailability,OB)是指藥物被人體循環(huán)吸收的速度和程度.類藥物(druglike,DL)性質反映了具有特定官能團或包含相同或相似物理特征的藥物的性質.以口服OB≥30%、類藥性DL≥0.18為條件篩選5中配方的藥物活性成分.然后獲取TCMSP及Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)中藥物成分的作用靶蛋白質,并去除沒有作用靶蛋白質的活性成分.然后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/uploadlists/),將物種限定為“Homo sapiens”后把獲取的靶蛋白質轉換為統(tǒng)一的基因名稱.

1.2.2 腸結核靶點篩選: Genecards數(shù)據(jù)庫是一個提供基因組、蛋白質組、轉錄、遺傳和功能方面的所有已知人類基因的平臺.在Genecards數(shù)據(jù)庫中以關鍵詞“intestinal tuberculosis”進行搜索,收集腸結核相關的疾病靶點.

1.2.3 “成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的構建: 將Genecards數(shù)據(jù)庫中檢索到的腸結核靶點與附子理中丸的活性成分作用靶點通過Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取交集,得到重疊的基因靶點,視為藥物潛在作用于腸結核的靶點.最后,在Cytoscape 3.9.1中構建“藥物-活性成分-重疊靶點-疾病”網(wǎng)絡圖.

1.2.4 蛋白質互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡的構建: 為了確定附子理中丸的潛在作用于腸結核的靶點以及它們之間的相互作用,將選擇的靶點導入到STRING網(wǎng)絡平臺(https://cn.string-db.org/)中,構建蛋白質-PPI網(wǎng)絡.蛋白質類型設置為“Homo sapiens”,置信度設置為中等(0.400).利用CytoNCA插件進行網(wǎng)絡拓撲學分析,并根據(jù)連接度(degree)大小對潛在作用靶點排序,篩選出degree值前10的靶點作為附子理中丸治療于腸結核的核心靶點,并構建核心靶點關系圖.

1.2.5 生物學功能富集分析: 為了進一步探索篩選出來的藥物潛在作用靶點的相關生物學功能及功能通路,使用R4.1.2軟件中的“clusterProfiler”程序包對潛在作用靶點進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析和基因本體論(Gene Ontology,GO)分析,其中GO分析包括生物過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)分析.以P＜0.05為標準,由小到大排序選擇P值前30的KEGG功能通路和GO分析中前10的MF、CC、BP過程,然后使用“ggplot2”程序包進行可視化分析.

統(tǒng)計學處理采用R4.1.2軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析組間差異,組間兩兩比較用最小顯著性差異法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 附子理中丸藥物活性成分及靶點的獲取 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中經(jīng)OB及DL值篩選并去除沒有對應靶點的活性成分,最終共納入108種藥物活性成分,包括附子5種,黨參14種,白術3種,干姜4種,甘草85種.值得注意的是,谷甾醇(sitosterol)同時存在于附子、干姜和甘草中,7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)在黨參和甘草中也均存在.最后從TCMSP及Drugbank數(shù)據(jù)庫中獲取上述活性成分的相關靶蛋白質,經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫轉換為基因名,最終獲得附子理中丸的藥物作用靶點一共254個.

2.2 腸結核相關靶點的獲取 從Genecards數(shù)據(jù)庫中以“intestinal tuberculosis”為關鍵詞直接獲取腸結核相關疾病靶基因一共2579個.然后利用Venny 2.1.0在線網(wǎng)站取附子理中丸的藥物作用靶點與腸結核疾病靶點的重疊部分基因,如圖1所示.最終獲得134個重疊基因,并被視作附子理中丸治療腸結核的潛在作用靶點.

圖1 附子理中丸活性成分與腸結核相關靶點的韋恩圖.

2.3 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的構建 為了探索附子理中丸的活性成分、腸結核與潛在作用靶點的作用關系,通過Ctoscape軟件進行了“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡的可視化分析.如圖2所示.通過Network Analyer計算,一共有248個節(jié)點,1041條邊,節(jié)點平均連接性為8.218,網(wǎng)絡密度為0.017,說明了附子理中丸各成分對腸結核治療是一個復雜的聯(lián)合作用機制.

2.4 PPI網(wǎng)絡及核心靶點網(wǎng)絡的構建 附子理中丸潛在作用于腸結核的134個靶點構成的PPI網(wǎng)絡如圖3所示,去除一個與其他的靶點均為構成聯(lián)系的基因(MT-ND6),一共有133個節(jié)點,5334條邊.Network Analyer計算得出節(jié)點平均連接性、聚類系數(shù)和平均節(jié)點degree值分別為40.105、0.666、39.8.degree值反映了每個節(jié)點在網(wǎng)絡中與其他節(jié)點的關聯(lián)程度,一定程度上代表了節(jié)點在整個網(wǎng)絡的重要性.圖3中,顏色越紅,大小越大的節(jié)點代表節(jié)點的degree值越大,其中degree≥100的節(jié)點有49個.圖4A展示了degree值前30的靶點.最后選取degree值前10的靶點作為附子理中丸作用于腸結核的核心靶點,包括AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、IL1B、JUN、CASP3、PTGS2、PPARG、MAPK3.圖4B展示了10個核心靶點的蛋白質互作關系.

圖3 附子理中丸-腸結核-潛在作用靶點(交集基因)蛋白互作網(wǎng)絡.

圖4 附子理中丸-腸結核-潛在作用靶點degree值分析. A: Degree值前30的潛在作用靶點;B 核心靶點(degree值前10)的蛋白互作網(wǎng)絡圖.

2.5 GO和KEGG富集分析 GO和KEGG富集分析用于探索附子理中丸對腸結核的潛在生物學作用機制.以P＜0.05為標準篩選出了GO及KEGG分析細胞成分或生物學過程的結果,并以P值由低到高進行排序.圖5分別展示了GO分析中P值前10的BP、CC、MF結果.可以發(fā)現(xiàn)生物過程主要包括細胞氧化應激、活性氧調節(jié)與異物刺激反應等,細胞成分主要包括膜筏、膜微域、轉錄調節(jié)復合體等,分子功能主要包括細胞因子活性、結合細胞因子、結合轉錄因子等.如圖6所示,KEGG富集結果提示了附子理中丸可能作用于腸結核的具體生物學通路.P值前30的KEGG富集分析條目主要涵蓋了白細胞介素(interleukin,IL)-17信號通路、氧化應激、TNF信號通路等.同時,如圖7所示,通過R 4.1.2軟件可視化進一步分析了IL-17信號通路的靶點調節(jié)關系,可以發(fā)現(xiàn)IL-17參與了多條CD4+T細胞的細胞因子相關的免疫調節(jié).

圖5 GO功能分析.A: 直方圖;B: 氣泡圖.BP: 生物過程;CC: 細胞成分;MF: 分子功能;GO: 基因本體論.

圖6 KEGG富集分析.A: 直方圖;B: 氣泡圖.KEGG: 京都基因和基因組百科全書.

圖7 IL-17信號通路圖.紅色的基因是本研究涉及到的靶點.IL-17: 白細胞介素17.

3 討論

中藥成分繁多,藥物作用機制復雜,為了更好提高中藥的疾病療效,藥物的生物學作用機制研究極其重要.本研究基于網(wǎng)絡藥理學探索了附子理中丸治療腸結核的作用機制和生物學過程.篩選了來源于開放數(shù)據(jù)庫中的藥物作用于腸結核的潛在作用靶點.通過構建PPI網(wǎng)絡及拓撲學分析,明確了10種附子理中丸治療腸結核的核心靶點,并分析了靶點間的作用關系.最后通過GO及KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)了附子理中丸可能治療腸結核的多個生物學過程和功能通路,證明了附子理中丸治療腸結核是有明確的生物學調控機制.

254個藥物作用靶點和2579個疾病相關靶基因篩選的134個重疊基因是附子理中丸治療腸結核的潛在作用靶點.最終根據(jù)PPI分析的degree值前10的潛在作用靶點,可被認為是附子理中丸作用于腸結核的核心靶點,包括AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、IL1B、JUN、CASP3、PTGS2、PPARG、MAPK3.了解其參與的生物學過程對于腸結核治療作用機制具有重要意義.作為degree值最高的靶點基因AKT1,既往研究表明結核分枝桿菌的Rv1987蛋白可通過激活PI3K/AKT1/mTOR信號通路誘導巨噬細胞M2極化從而降低巨噬細胞的殺菌能力[10].IL-6、IL1B參與了結核病的機體自身免疫調節(jié)[11-13].同時有研究表明IL-6、JUN和TP53與轉錄因子一起可以調節(jié)免疫反應,其功能主要包括細胞外區(qū)域活化和感染過程中的蛋白質結合[14].VEGFA被證明與肺外結核細菌傳播密切相關.CASP3與細胞凋亡密切相關,有報道也指出在結核患者血清中CASP3高表達以及參與組織炎癥反應的調節(jié)[15,16].PTGS2又名環(huán)氧合酶2,目前也有不少研究報道了輔助環(huán)氧合酶2抑制劑治療結核病效果良好[17,18],其中雷公藤甲素被證明能夠促進細胞因子IL-6的表達,但降低了結核感染的巨噬細胞中PTGS2的表達[19].傳統(tǒng)的抗結核藥物利福平能夠減少mRNA和蛋白質水平上對PPARG的誘導[20].同時,既往的報道亦有指出在由于MAPK1/3信號通路的缺陷,IL17A無法增強自噬從而加重結核感染炎癥反應[21].上述結論均說明了從附子理中丸潛在作用靶點篩選出的核心靶點均在腸結核的炎癥或免疫調節(jié)上有著重要作用,可以成為未來精準基因治療的重要研究目標.

在GO和KEGG富集分析探索附子理中丸可能參與腸結核功能調節(jié)的通路研究中,最終發(fā)現(xiàn)多個與腸結核治療相關的生物過程.其中多條GO分析條目均指出藥物參與的生物過程可能與細胞氧化及活性氧相關,分子功能與細胞因子的免疫調控作用密切相關.既往的研究也指出活性氧在調控結核病發(fā)病機制中起著重要作用.巨噬細胞激活可產(chǎn)生活性氧直接殺死駐留的細菌[22].也有研究證明了氧化應激參與結核炎癥反應調控的作用[23,24].KEGG富集分析指出了多條生物學通路,其中也包括了細胞氧化應激通路,證實了附子理中丸通過氧化應激通路調節(jié)結核炎癥反應從而治療腸結核的作用.另外,也有大量的靶點富集于IL-17信號通路,以前的研究也證明了IL-17可以增強細胞自噬來控制結核桿菌的炎癥反應[21].另外也有相關研究證明了IL-17相關通路與腸粘膜的免疫機制相關[24].在KEGG可視化IL-17相關通路圖中也發(fā)現(xiàn)了IL-17可以介導CD4+T細胞參與多條信號通路,聯(lián)合IL-6、PTGS2等核心靶點發(fā)揮免疫調節(jié)作用.所以上述結果均說明了附子理中丸治療腸結核的作用機制與氧化應激、細胞因子參與的免疫調節(jié)相關.

4 結論

綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡藥理學研究了以附子、黨參、白術、干姜、甘草為主要成分的附子理中丸治療腸結核的生物學調控機制.篩選出了藥物潛在治療作用的靶點,并通過PPI分析選出了10個核心作用靶點.既往的研究證明核心靶點均在腸結核的炎癥或免疫調節(jié)上有著重要作用,最后通過功能富集分析證明了附子理中丸通過細胞氧化及細胞因子介導的免疫調節(jié)發(fā)揮了治療腸結核的作用,并發(fā)現(xiàn)了IL-17信號通路在治療上的重要價值.因此本研究證明了附子理中丸在治療腸結核中具有明確的炎癥或免疫功能調控作用,為日后的進一步臨床或基礎研究奠定了理論基礎.

文章亮點

實驗背景

腸結核是一種常見肺外結核病.臨床上腸結核的治療效果不佳,長期使用抗結核化療藥物可引發(fā)藥物不良反應.隨著中醫(yī)治療的發(fā)展,越來越多的中藥方劑在治療腸結核上展現(xiàn)出了較好的療效.附子理中丸是一種經(jīng)典的中藥方劑,了解其治療腸結核的作用機制有利于中醫(yī)治療腸結核的發(fā)展.

實驗動機

探索附子理中丸治療腸結核的作用機制,利于臨床應用.

實驗目標

利用網(wǎng)絡藥理學研究附子理中丸治療腸結核的作用機制.

實驗方法

使用TCMSP及Drugbank數(shù)據(jù)庫獲取附子理中丸中有效成分和作用靶蛋白質.利用Genecards數(shù)據(jù)庫收集腸結核相關的疾病靶點.對腸結核靶點與附子理中丸的活性成分作用靶點取交集,得到重疊的基因靶點,視為藥物潛在作用于腸結核的靶點.將篩選出的靶點導入STRING網(wǎng)絡平臺中,構建蛋白質-蛋白質互作網(wǎng)絡,并進行網(wǎng)絡拓撲學分析.篩選出的連接度(degree)值前10的靶點可被視作附子理中丸治療于腸結核的核心靶點.對潛在作用靶點進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析和基因本體論(Gene Ontology,GO)分析探索附子理中丸治療腸結核的潛在生物學機制.

實驗結果

本研究共獲取了108種藥物活性成分,254個藥物作用靶點和2579個疾病相關靶基因.最終篩選出的附子理中丸在腸結核治療中的10個核心作用靶點,包括AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、IL1B、JUN、CASP3、PTGS2、PPARG、MAPK3.GO分析和KEGG富集分析展示的生物學過程主要包括細胞氧化應激、活性氧調節(jié)與異物刺激反應等免疫調節(jié)過程,參與的生物學通路有白細胞介素(interleukin,IL)-17信號通路、氧化應激、TNF信號通路等.所有的結果均證明附子理中丸治療腸結核的作用機制均與炎癥或免疫調節(jié)有關.

實驗結論

通過網(wǎng)絡藥理學綜合分析,發(fā)現(xiàn)了附子理中丸在腸結核治療中發(fā)揮作用的10個關鍵基因,并在后續(xù)分析中發(fā)現(xiàn)了附子理中丸通過細胞氧化及細胞因子介導的免疫調節(jié)發(fā)揮了治療腸結核的作用,其中IL-17信號通路、氧化應激通路在未來的研究中值得進一步探索.

展望前景

本研究基于網(wǎng)絡藥理學分析了附子理中丸治療腸結核的作用機制,篩選了藥物核心治療靶點,提供了附子理中丸治療腸結核的生物學證據(jù).為未來進一步的細胞學或者動物模型驗證藥物生物學功能奠定了基礎.