徐菁昱, 劉艷芬, 陳紹紅,劉 鈾

(1.廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088)

中國是世界上養(yǎng)羊數(shù)量最多的國家,羊肉總產(chǎn)量居世界首位[1]。近年來,隨著規(guī)?；B(yǎng)羊業(yè)的快速發(fā)展,傳染病尤其是病毒性傳染病成為制約中國養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的重要因素[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,嚴(yán)重危害山羊健康的疾病多達(dá)54種,傳染病占64.8%,其中病毒性傳染病占31.4%,且多種病原體混合感染的情況較為普遍[3]。因此,通過疫苗接種控制傳染病暴發(fā)流行的同時(shí),積極研究開發(fā)廣譜、高效、安全的抗病毒制劑對(duì)于山羊病毒性傳染病的防治有著十分現(xiàn)實(shí)的意義。

審美趣味的改變制約了水墨動(dòng)畫的進(jìn)一步發(fā)展。上世紀(jì)80年代以后，西方審美標(biāo)準(zhǔn)的盛行改變了動(dòng)畫受眾的審美趣味，繼而影響了國產(chǎn)動(dòng)畫的創(chuàng)作風(fēng)格，水墨動(dòng)畫隨即成為過眼煙云。隨著社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步，在高科技迅速發(fā)展的時(shí)代，中國的日新月異，各種先進(jìn)的動(dòng)畫技術(shù)以及西方審美思想的影響，從制作技術(shù)、審美趣味到藝術(shù)風(fēng)格上，中國的動(dòng)畫片逐漸被“西化”，喪失了本民族的特色和優(yōu)勢(shì)，外來動(dòng)畫風(fēng)格成為動(dòng)畫創(chuàng)作的主要風(fēng)格。

干擾素(interferon,IFN)是在病毒或其他抗原刺激下由白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌的一類糖蛋白[4],具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性[5-6],其中α-干擾素的抗病毒活性最強(qiáng)[7]。采用體外培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞、病毒或絲裂原誘導(dǎo)是制備天然干擾素的常規(guī)方法,但干擾素產(chǎn)量低,純化不易,且生產(chǎn)成本較高,極大地限制了干擾素的臨床應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組干擾素是解決這一難題的有效途徑。目前,重組α-干擾素制劑已在醫(yī)學(xué)臨床中得到廣泛應(yīng)用,在人類病毒性疾病的預(yù)防和治療中發(fā)揮了重要作用[8]。近年來,重組干擾素已應(yīng)用于犬、貓、豬、雞等病毒性傳染病的預(yù)防和治療[9]。目前,有關(guān)雷州山羊α-干擾素基因的遺傳變異、重組山羊α-干擾素的抗病毒活性的報(bào)道較少,市場亦無商品化山羊干擾素產(chǎn)品。

本研究通過克隆雷州山羊α-干擾素基因,分析其遺傳變異,將其成熟肽編碼序列導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá),制備重組α-干擾素成熟肽并檢測其抗PPRV和GPV的活性,旨在為山羊病毒性傳染病的防治提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

雷州山羊來自廣東海洋大學(xué)雷州山羊保種場;質(zhì)粒pET-32a(+)、大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α和BL21(DE3)、Vero細(xì)胞、LDG-2細(xì)胞、小反芻獸疫病毒疫苗株Nigeria 75/1(Peste des petits ruminants virus,PPRV)、山羊痘病毒疫苗株AV41(Goat pox virus,GPV)均由廣東海洋大學(xué)生化中心保存。

雷州山羊α-干擾素基因與豬(NM_214393)、人(NM_024013)和鼠(NM_010502)的核苷酸序列同源性較低,分別為81.6%、77.8%和70.0%,氨基酸序列同源性分別為67.9%、61.6%和 55.3%(表1),說明與反芻動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的動(dòng)物種屬之間α-干擾素基因序列存在較大差異。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中山羊IFN-α基因序列(登錄號(hào):FJ959074)設(shè)計(jì)引物,F1:5′-ATGGCCCCAGCCTGGTCCTTA-3′,R1:5′-TCAGTCCTTCCTCCTGAATCTCTCC-3′用于擴(kuò)增α-干擾素全基因;F2:5′-CATGCCATGGCAGGCTGCCACCTGCCTCACATCCA-3′(NcoⅠ),R2:5′-CCCAAGCTTTCAGTCCTTCCTCCTGAAT CT-3′(HindⅢ)用于擴(kuò)增α-干擾素成熟肽編碼序列。引物由上海生工生物工程股份有限公司 合成。

1.3 山羊α-干擾素全基因的克隆

利用DNA凝膠回收試劑盒純化目的基因片段后,與pMD19-T載體于16 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆作增菌培養(yǎng),以菌液為模板,按上述條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。陽性轉(zhuǎn)化子用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒,分別用HindⅢ和HindⅢ+BamH Ⅰ 酶切消化,消化產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖電泳鑒定。經(jīng)PCR和酶切鑒定的重組質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司測定目的基因核苷酸序列。重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-IFN-α。

在25 μL反應(yīng)體系中加入RNA模板5 μL、dNTP(10 mmol/L)1 μL、Oligo dT 1 μL、5×RT Buffer 5 μL、Rnase Inhibitor 0.5 μL、M-MLV RT 1 μL、DEPC水11.5 μL,采用反轉(zhuǎn)錄制備α-干擾素全基因cDNA。反應(yīng)條件為: 65 ℃ 5 min,42 ℃ 50 min,70 ℃ 5 min。在20 μL反應(yīng)體系中加入cDNA 5 μL,F1/R1各1 μL,dNTP 0.4 μL,Taq酶0.2 μL,10×Buffer 2 μL,ddH2O 10.4 μL,采用PCR方法擴(kuò)增山羊IFN-α全基因。反應(yīng)條件為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 40 s, 56 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,32 個(gè)循環(huán),72 ℃ 延伸 10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳 檢測。

無菌采集健康雷州山羊靜脈血,用外周血淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞,按2×106mL-1接入細(xì)胞培養(yǎng)瓶,加入終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的植物血凝素(PHA),于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后,3 500 r/min離心收集細(xì)胞,采用Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA,瓊脂糖電泳檢測RNA完整性,紫外吸收法測定RNA含量。

1.4 山羊α-干擾素表達(dá)載體的構(gòu)建

采用微量細(xì)胞病變抑制法檢測重組山羊α-干擾素的抗病毒活性[13]。將Vero細(xì)胞和LDG-2細(xì)胞分別接種96孔板,待細(xì)胞長至單層,試驗(yàn)組細(xì)胞分別加入用維持液進(jìn)行4倍倍比稀釋的重組山羊α-干擾素100 μL,每個(gè)稀釋度8個(gè)重復(fù),細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組分別加入100 μL維持液,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h后,試驗(yàn)組和病毒對(duì)照組的Vero細(xì)胞按100 μL/孔分別加入100TCID50的PPRV懸液,試驗(yàn)組和病毒對(duì)照組LDG-2細(xì)胞則按100 μL/孔分別加入100TCID50的GPV懸液。每12 h觀察細(xì)胞病變情況,待病毒對(duì)照組出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變,將試驗(yàn)組中抑制50%細(xì)胞病變的干擾素最高稀釋度確定為1個(gè)干擾素活性單位。

1.5 重組山羊α-干擾素基因的原核表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化

——近期摩根士丹利發(fā)布了一份報(bào)告，揭示了澳大利亞葡萄酒出口中國的強(qiáng)勁勢(shì)頭。但報(bào)告也發(fā)現(xiàn)，雖然越來越多的澳大利亞葡萄酒出口到中國，但按價(jià)值計(jì)算，出口到中國的高檔葡萄酒數(shù)量仍然占比較低。同時(shí)，一些小酒廠的葡萄酒質(zhì)量上乘，但價(jià)格并不低。且中間環(huán)節(jié)層層累加，到中國消費(fèi)者手中時(shí)價(jià)格畸高。

薛宇航：這篇作文寫完后，我自己讀了兩遍，感覺還不錯(cuò)，嚴(yán)老師也表揚(yáng)了我，說寫得不錯(cuò)?？催^兩位“小編輯”的修改之后，我覺得他們改得真好，我的這篇作文，果然還有很大的提升空間?？磥恚院笪覍懲曜魑?，也要注意多修改了。

1.6 重組山羊α-干擾素融合蛋白的分離與純化

根據(jù)“1.5”的檢測結(jié)果,用優(yōu)化后的條件誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。破碎細(xì)胞后收集沉淀,獲得包涵體。用2 mol/L尿素洗滌、8 mol/L尿素溶解包涵體后,稀釋變性液至尿素終濃度為4 mol/L后置于透析袋中,分別用3、2、1、0.5 mol/L尿素梯度透析復(fù)性[11-12]。復(fù)性蛋白用Ni-NAT親和層析柱純化,用10K超濾管濃縮目的蛋白,并以PBS緩沖液洗脫。所得蛋白質(zhì)樣品經(jīng)Western-blot鑒定、BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度后,用 0.22 μm濾膜過濾除菌分裝,-80 ℃保存,備用。

1.7 重組山羊 α-干擾素的抗病毒活性測定

以pMD19-T-IFN-α質(zhì)粒為模板、F2/R2為引物擴(kuò)增山羊α-干擾素成熟肽編碼序列,擴(kuò)增產(chǎn)物和pET-32a(+)分別用NcoⅠ、NcoⅠ+HindⅢ限制性內(nèi)切酶消化,消化產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖電泳分離,經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒純化后的目的基因和載體用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒參照“1.3”中的方法進(jìn)行PCR和酶切鑒定,重組質(zhì)粒命名為pET-mIFN-α。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊α-干擾素全基因的克隆與序列分析

以pMD19-T-IFN-α為模板、F2/R2為引物擴(kuò)增獲得大小約為500 bp的特異性擴(kuò)增片段。重組質(zhì)粒pET-mIFN-α經(jīng)NcoⅠ酶切消化得到大小約6 400 bp的DNA片段、經(jīng)NcoⅠ+HindⅢ酶切消化得到大小約為5 900 bp的載體片段和500 bp的目的片段,與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。

M.DL5000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.山羊α-干擾素基因的擴(kuò)增產(chǎn)物;2.HindⅢ 酶切產(chǎn)物;3.BamH I+HindⅢ酶切產(chǎn)物

測序結(jié)果表明,雷州山羊α-干擾素基因全長為570 bp,編碼189個(gè)氨基酸。Dnastar(Version 7.1)分析結(jié)果顯示,雷州山羊α-干擾素基因與GenBank 上發(fā)表的山羊(NM_001285704)、林麝(MW394237)、彎角大羚羊(XM_040238322)、黃牛(NM_001172041)、瘤牛(HM853483)和綿羊(XM_004004404)的核苷酸序列同源性較高,分別為99.8%、95.6%、96.8%、94.7%、94.7%和96.8%,其氨基酸同源性分別為100%、92.6%、94.7%、92.1%、93.2%和93.7%,提示反芻動(dòng)物α-干擾素基因的核苷酸和氨基酸序列高度保守。

外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司;RPMI 1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;植物血凝素(PHA)購自上海源葉生物科技有限公司;Trizol RNA提取試劑購自Invitrogen公司;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自 Promega公司;pMD19-T、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、NcoⅠ,DNA片段凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;TaqDNA聚合酶購自北京鼎國生物公司;PMSF購自北京蘭杰柯科技有限公司;BCA蛋白測定試劑盒購自中國上海博彩生物科技有限公司;HRP標(biāo)記的馬抗小鼠IgG購自美國Cell Signaling Technology;Ni-NAT親和層析樹脂購自GE Healthcaer公司;10K超濾管購自Millipor公司。

表1 α-干擾素基因核苷酸與氨基酸序列同源性比較

氨基酸序列分析結(jié)果表明,雷州山羊α-干擾素信號(hào)肽潛在裂解位點(diǎn)位于N末端22～23個(gè)氨基酸,其成熟肽由167個(gè)氨基酸組成,其中無N-糖基化位點(diǎn),有4個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn),分別為第48位(S)、第92位(S)、第140位(S)和第151位(T),4個(gè)半胱氨酸殘基分別位于第24、52、122、162位,與其他反芻動(dòng)物α-干擾素的一級(jí)結(jié)構(gòu)相同(圖2)。雷州山羊和其他反芻動(dòng)物的α-干擾素成熟肽在26～185位氨基酸均含有保守的結(jié)構(gòu)域,雷州山羊、彎角大羚羊和綿羊α-干擾素成熟肽在第48、140、151位均有潛在O-糖基化位點(diǎn),瘤牛α-干擾素成熟肽在第48和140位也有潛在O-糖基化位點(diǎn),瘤牛和綿羊α-干擾素成熟肽在第84位均有潛在O-糖基化位點(diǎn),但均無潛在N-糖基化位點(diǎn),且與豬、人和鼠的潛在O-糖基化位點(diǎn)截然不同;包括雷州山羊在內(nèi)的反芻動(dòng)物與豬、人和鼠α-干擾素成熟肽均含有4個(gè)位點(diǎn)相同的半胱氨酸殘基。

2.2 山羊α-干擾素成熟肽擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建

通過RT-PCR方法擴(kuò)增的雷州山羊α-干擾素全基因大小約570 bp,與預(yù)期結(jié)果一致。重組質(zhì)粒pMD19-T-IFN-α經(jīng)HindⅢ 酶切消化得到大小約3 200 bp的DNA片段,經(jīng)BamH Ⅰ+HindⅢ酶切消化得到大小分別為2 700 bp的載體片段和570 bp的目的片段,與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。

2.3 重組山羊α-干擾素的表達(dá)、純化及鑒定

通過比較不同表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)表達(dá)溫度對(duì)重組α-干擾素成熟肽表達(dá)量的影響,確定最佳表達(dá)條件為37 ℃、IPTG終濃度0.5 mmol/L、誘導(dǎo)表達(dá)6 h,此時(shí)重組蛋白表達(dá)量最高,且主要以包涵體形式存在,其分子質(zhì)量約32 ku,與預(yù)期結(jié)果一致(圖4)。Western-blot 檢測結(jié)果顯示,重組菌BL-pET-32a(+)和BL-pET-32a-mIFN-α的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物均能與6×His抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),其分子質(zhì)量分別為19 ku和32 ku,與預(yù)期結(jié)果相符(圖5)。

用重組質(zhì)粒pET-mIFN-α轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,獲得重組菌BL-pET-mIFN-α,于 37 ℃、210 r/min培養(yǎng)至OD600nm約0.6～1.0,加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L,繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)6 h,收集菌體用滅菌三蒸水重懸,反復(fù)凍融3 次,加入DNase Ⅰ 置于37 ℃至菌液不再粘稠, 4 ℃、12 000 r/min離心15 min,分別收集上清和沉淀,用12% SDS-PAGE 凝膠電泳檢測;分別于25、30、37 ℃以IPTG終濃度為0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L分別誘導(dǎo)0、1、2、4、6 h,用12% SDS-PAGE 凝膠電泳分析重組蛋白的可溶性,以優(yōu)化表達(dá)條件[10]。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.誘導(dǎo)表達(dá)6 h的BL-pET-mIFN-α重組菌裂解產(chǎn)物;2.未誘導(dǎo)的BL-pET-mIFN-α重組菌裂解產(chǎn)物;3.BL-pET-32a(+)重組菌裂解產(chǎn)物;4.BL21(DE3)細(xì)菌裂解產(chǎn)物

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.BL-pET-32a(+)細(xì)菌裂解產(chǎn)物;2.純化的rG-mIFN-α

2.4 重組山羊α-干擾素抗病毒活性測定

采用微量細(xì)胞病變抑制法檢測重組山羊 α-干擾素的抗PPRV和GPV活性。對(duì)照組細(xì)胞大小形態(tài)正常,貼壁良好;病毒對(duì)照組細(xì)胞在PPRV或GPV感染后,逐漸出現(xiàn)細(xì)胞變圓、融合和壞死脫落現(xiàn)象;經(jīng) rG-mIFN-α處理的細(xì)胞,僅見少量細(xì)胞融合和脫落,且隨著rG-mIFN-α終濃度增加,細(xì)胞病變程度越輕微。由此可見,重組山羊α-干擾素成熟肽能以劑量依賴方式顯著抑制PPRV和GPV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變(圖6)。rG-mIFN-α抗PPRV和GPV活性分別為1.024×104U/mL和8.67×103U/mL,比活力分別為 1.6×104U/mg和1.35×104U/mg。說明重組山羊α-干擾素成熟肽具有較強(qiáng)的抗PPRV和抗GPV活性。

A.Vero細(xì)胞對(duì)照;B.rG-mIFN-α處理的PPRV感染Vero細(xì)胞;C.PPRV感染Vero細(xì)胞;D.LDG-2細(xì)胞對(duì)照;E.rG-mIFN-α處理的GPV感染LDG-2細(xì)胞;F.GPV感染LDG-2細(xì)胞

3 討 論

本研究證實(shí),雷州山羊IFN-α基因由570個(gè)核苷酸組成,編碼189個(gè)氨基酸,與Genbank報(bào)道的其他山羊品種的α-干擾素核苷酸與氨基酸序列同源性高達(dá)99.8%和100%,僅存在1個(gè)核苷酸位點(diǎn)的同義突變;與綿羊、彎角大羚羊、林麝、瘤牛等反芻動(dòng)物的 α-干擾素氨基酸序列都有較高同源性,與豬、人、小鼠的同源性較低,提示反芻動(dòng)物的α-干擾素氨基酸序列高度保守,且親緣關(guān)系較近的動(dòng)物干擾素同源性也較高。

我恨恨地把窗戶玻璃打破了，爬了出去。月亮很亮，我踩著自己的影子晃悠在扒鍋街，我去找劉佳，扒鍋街的人我最惦記的就是他了，我只親了他一次，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠哩。

第三，游客對(duì)長江三峽地域文化認(rèn)知過程具有選擇性。出游前，游客通過信息刺激產(chǎn)生初始認(rèn)知；出游過程中，游客在個(gè)體已有知識(shí)和體驗(yàn)的影響下，產(chǎn)生對(duì)信息的選擇性“接觸-注意-理解-保持”[33]86過程；出游后，游客形成的認(rèn)知印象以概念網(wǎng)絡(luò)的形式進(jìn)行儲(chǔ)存，反映了部分的目的地文化。

IFN-α的N-末端有22個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽,其切割位點(diǎn)位于第22位(L)和23位(G)之間,氨基酸序列分析結(jié)果表明,反芻動(dòng)物α-干擾素信號(hào)肽的胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)均具有共同基序(motif),即MAPAWS和SCNAICS;除彎角大羚羊外,跨膜區(qū)則含有數(shù)量相同的疏水氨基酸—亮氨酸(L);除綿羊與瘤牛外,大多數(shù)反芻動(dòng)物的α-干擾素信號(hào)肽裂解位點(diǎn)序列均為第22位(L)-第23位(G),提示反芻動(dòng)物α-干擾素的易位、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)肽切除及分泌機(jī)制基本相同。雷州山羊和其他反芻動(dòng)物α-干擾素成熟肽在26～185位氨基酸均含有保守的結(jié)構(gòu)域,其中山羊、彎角大羚羊和綿羊α-干擾素成熟肽在第48、140、151位氨基酸均有潛在O-糖基化位點(diǎn),瘤牛和綿羊α-干擾素成熟肽的糖基化位點(diǎn)則位于第48、84、140氨基酸,且與豬、人和鼠的潛在O-糖基化位點(diǎn)截然不同,目前尚不清楚這些糖基化位點(diǎn)的細(xì)微差別對(duì)反芻動(dòng)物α-干擾素高級(jí)結(jié)構(gòu)和抗病毒活性的影響。

在這一段簡短的語言描述里，作者綜合運(yùn)用了多種修辭方法：運(yùn)用比喻的修辭，在把“廣場”比作“露天公寓”的過程中，形象地再現(xiàn)了蘇比生活的貧窮；運(yùn)用擬人修辭，通過“打招呼”這一動(dòng)詞性的短語，把北風(fēng)預(yù)示的寒冷以及這些寒冷給予像蘇比一樣窮人的警告，以一種幽默的方式體現(xiàn)在語言描寫之中；運(yùn)用借代，作者把像蘇比一樣的廣場流浪漢們，形象地稱之為“房客們”。從而在幽默之中表達(dá)著一絲諷刺。

原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡便、重組蛋白表達(dá)量高、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)勢(shì)。郝飛等[14]成功克隆山羊IFN-τ基因并進(jìn)行原核表達(dá),發(fā)現(xiàn)重組山羊IFN-τ能有效抑制水泡性口炎病毒及山羊副流感病毒3型在宿主細(xì)胞中的增殖。Jacobe等[15]在大腸桿菌中表達(dá)了綿羊IFN-γ基因,并測得融合蛋效價(jià)為3.2×105U/mg。本研究結(jié)果表明,山羊α-干擾素能在大腸桿菌中高效表達(dá),表達(dá)量可達(dá)1.84×103mg/L,但重組山羊α-干擾素多以包涵體形式存在。通過優(yōu)化表達(dá)條件如調(diào)整重組菌密度、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)劑終濃度等仍未能實(shí)現(xiàn)重組山羊α-干擾素的可溶性表達(dá)。采用常規(guī)方法對(duì)包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性處理,并通過超濾工藝大大縮短了重組蛋白的濃縮時(shí)間,獲得的高純度重組山羊α-干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒活性,其抗PPRV和GPV效價(jià)分別達(dá)到1.6×104U/mg和1.35×104U/mg。值得指出的是,在原核細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白無法進(jìn)行糖基化修飾,可能對(duì)重組蛋白的折疊、抗原表位形成、電荷性質(zhì)、熱穩(wěn)定性及其生物學(xué)功能產(chǎn)生顯著影響[16]。李丹等[17]利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出羊α干擾素,抗PPRV活性為6.5×105U/mL;于力等[18]利用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)山羊α干擾素,抗病毒活性為5.62×109U/mg。考慮到真核表達(dá)系統(tǒng)制備重組蛋白的周期長、成本高、表達(dá)量較低等因素,原核表達(dá)系統(tǒng)仍是生產(chǎn)重組蛋白的重要手段。未來將通過選擇適宜的分泌型表達(dá)載體和分子伴侶以增加重組蛋白的可溶性表達(dá),簡化重組蛋 白的分離純化,進(jìn)一步提高重組蛋白的生物學(xué)活性。