聶鵬成,楊若蘭,袁 紹,白 欣,王菲菲,尚素琴

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院,蘭州 730070)

二斑葉螨(TetranychusurticaeKoch)作為一種世界性害螨,寄主植物超過1 000種,包括農(nóng)作物、蔬菜、果樹、林木、花卉、雜草及藥材等[1]。二斑葉螨的取食活動會導致作物質(zhì)量降低,嚴重時致使作物減產(chǎn)甚至絕收,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失,但因其體型小、發(fā)育歷期短、短期內(nèi)易爆發(fā)、擴展速度快、寄主廣泛,易產(chǎn)生抗性等特點[2],防治極其困難。

目前,二斑葉螨的防治主要依靠化學藥劑,但由于新型殺螨劑更新慢或者普及度較差,以及藥劑使用不科學,二斑葉螨對許多化學藥劑產(chǎn)生較強的抗性[3]。害螨對化學藥劑產(chǎn)生抗性的機制包括忌避、代謝、儲存、排出和降低敏感度等[4],在代謝抗性中,主要依賴羧酸酯酶(carboxylesterase CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase GSTs)、多功能氧化酶(multifunctional oxidase MFO)[5],其中CarE能與進入螨體內(nèi)的殺螨劑迅速結(jié)合并將其降解,使殺螨劑失去原有作用;GSTs能與殺螨劑中具有毒理作用的親電基團結(jié)合并將其排出體外;MFO負責各類氧化代謝作用,可通過脫甲基作用代謝殺蟲劑,參與多種殺螨劑的代謝分解[6]。當害螨遭受化學藥劑脅迫時,會提高解毒酶的活性,或者增強代謝能力以減小化學藥劑對自身帶來的損害[7]。

田間施藥后,由于時間的延長和個體接受到的劑量不同,部分害螨會接觸到藥劑亞致死劑量,亞致死劑量是指不導致昆蟲死亡但可以影響昆蟲正?；顒踊蛏硇袨?甚至導致種群增長率升高或降低的劑量[8],亞致死劑量還會對害螨體內(nèi)解毒酶系的活性產(chǎn)生影響,而解毒酶系活性的增強與減弱關(guān)乎害螨代謝化學藥劑的能力,其中解毒酶系活性的增強是害螨產(chǎn)生代謝抗性的根本原因[9],因此,殺螨劑不同亞致死劑量與處理時間的長短對害螨體內(nèi)解毒酶活性的影響是亟需探究的一個問題。

乙唑螨腈屬新型高效殺螨劑,與現(xiàn)有殺螨劑無交互抗性,有良好的速效性與持效性,對蜜蜂、魚、鳥、蠶等非靶標生物均表現(xiàn)低毒。對害螨包括卵在內(nèi)的各個時期均有較好防效[10],且短時間內(nèi)對種群抗性增長無顯著影響[11]。對常見害螨的防治效果及對植物與天敵的安全性優(yōu)于市面常見殺螨劑,如丁氟螨酯、聯(lián)苯菊酯、螺螨酯、乙唑螨和噠螨靈等,但當前的研究主要集中在防效等方面,對于進入二斑葉螨體內(nèi)的代謝機制尚無報道[12-16]。

本試驗測定并分析乙唑螨腈亞致死劑量LC10和LC30對二斑葉螨體內(nèi)3種解毒酶的比活力、米氏常數(shù)(Km)和最大反應速率(Vmax)隨時間變化的情況,旨在從生理水平揭示二斑葉螨對乙唑螨腈的代謝抗性機理,并以此為乙唑螨腈的安全、合理使用及二斑葉螨的防治與抗藥性治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試蟲源:二斑葉螨源自長期室內(nèi)飼養(yǎng)的敏感種群,飼養(yǎng)條件為:溫度(25±1)℃,相對濕度(60±5)%,光周期L∶D=16 h∶8 h。在不接觸任何化學藥劑的情況下培養(yǎng)多代后,取雌成螨備用。寄主植物選擇室內(nèi)盆栽1周左右的豇豆(Vignaunguiculata(Linn.)Walp)幼苗。

供試藥劑與試劑:30%乙唑螨腈懸浮劑(沈陽中化農(nóng)藥化工研發(fā)有限公司),考馬斯亮藍 G-250,≥99%α-萘酚(1-naphthol),還原性谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH),>98%還原型輔 酶Ⅰ(NADPH,北京索萊寶科技有限公司),固藍B鹽(上海源葉生物科技有限公司),毒扁豆堿(甘肅金博研生物科技有限公司),牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),≥99% 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB),十二烷基磺酸鈉(sodium laurylsulfonate,SDS,上海中秦化學試劑有限公司), α-乙酸萘酯,≥99.5%乙二胺四乙酸(EDTA,天津市光復科技發(fā)展有限公司),≥99.5%對硝基苯酚(德州科析化工產(chǎn)品有限公司),甲醇溶液(西安化學試劑廠),對硝基苯甲醚(安慶圣陽化學有限公司)。

供試儀器: S·HH·W21·420S 型電熱恒溫水浴鍋,H1850R 型高速冰凍離心,ELX800UV 酶標儀,AR224CN 電子天平,UPD-I-20T 超純水器,RXZ智能型光照培養(yǎng)箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙唑螨腈對二斑葉螨的室內(nèi)毒力測定 采用葉片浸漬法測定乙唑螨腈對二斑葉螨的毒力。選取直徑為9.5 cm,高為1.0 cm的培養(yǎng)皿,將直徑為9 cm的圓海綿放入培養(yǎng)皿,然后將直徑9 cm濾紙平鋪于海綿表面,加水至海綿與濾紙充分浸濕并有余水。取新鮮的豇豆葉片,置于培養(yǎng)皿中,使葉背朝上葉面緊貼濾紙,將葉緣和葉柄用完全浸水的脫脂棉覆蓋。每片葉片接雌成螨30頭左右,置于養(yǎng)蟲室中30～60 min后,在雙目解剖鏡下觀察并剔除死亡(觸之不動者視為死亡)與不活潑的個體,記載實際的螨頭數(shù),作為供試 基數(shù)。

將乙唑螨腈懸浮劑稀釋為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg·L-15個不同濃度的藥液,并采用相同溶劑配比的甲醇水溶液作為對照。將帶有雌成螨的葉片完全浸入配置好的藥劑并輕輕搖動 5 s后取出,用吸水紙快速吸干多余的藥液,最后將葉片平放回培養(yǎng)皿,重新用浸水脫脂棉包圍葉緣和葉柄。每個濃度設3個重復。48 h后,記錄螨的死亡數(shù)。以校正死亡率為基礎擬合毒力回歸方程,并由此計算出其亞致死濃度LC10和LC30。

1.2.2 亞致死劑量濃度處理 在溫度(25± 1)℃、相對濕度(60±5)%、光周期L∶D= 16 h∶8 h的人工氣候箱里使用盆栽豇豆繁殖二斑葉螨,待二斑葉螨繁殖2～3代后備用。將乙唑螨腈LC10和LC30分別配置成1.5 L藥液,對照為相同溶劑配比的甲醇水溶液,將帶有二斑葉螨的葉片浸漬5 s,置于光照培養(yǎng)箱,分別于6、12、24、36、48、60 h挑取150頭雌成螨至1.5 mL離心管,用液氮冷凍后放入-80 ℃冰箱,備用。采用相同配比的甲醇水溶液作為對照組。每個處理在各時間點重復3次。

1.2.3 酶源的制備及蛋白含量測定 將收集的試蟲分別用1.5 mL預冷的66 mmol·L-1(pH 7.0)、0.04 mol·L-1(pH 7.0)、0.1 mol·L-1(pH 7.8)PBS緩沖液勻漿,4 ℃下12 000g離心15 min,取上清液即為GSTs、CarE、MFO酶液, 4 ℃保存,備用。參照Bradford[17]考馬斯亮藍 G-250法測定酶源蛋白含量。

1.2.4 二斑葉螨解毒酶比活力的測定 CarE比活力測定采用何恒果[18]的方法。以α-乙酸萘酯作為反應底物,在30 ℃下經(jīng)酯酶水解反應10 min后,加入顯色劑(1%固蘭B水溶液∶5%十二烷基磺酸鈉=2∶5),用酶標儀測600 nm處OD值。然后根據(jù)α-萘酚標準曲線和酶源蛋白含量,將OD值換算成酶比活力(μmol·μg-1·min-1)。

GSTs比活力測定采用何恒果[18]、Clark等[19]的方法。37 ℃條件下,以CDNB為底物,經(jīng)GSTs作用與GSH反應,用酶標儀在340 nm處以30 s為間隔測定5 min內(nèi)OD值,參照Habig等[20]方法計算GSTs比活力(μmol·μg-1·min-1)。

MFO比活力測定采用Kim等[21]、何恒果[18]的方法。以對硝基苯甲醚為底物,氧和 NADPH 作電子供體,37 ℃下水浴反應30 min,經(jīng)MFO催化發(fā)生氧脫甲基反應生成對硝基苯酚,用1 mol·L-1鹽酸終止反應。然后用氯仿和0.5 mol·L-1NaOH溶液萃取,用酶標儀在400 nm處測OD值。最后將OD值按照對硝基苯酚標準曲線和酶源蛋白含量換算成酶比活力(μmol·μg-1·min-1)。

酶動力學常數(shù)測定參照文獻[22],將CDNB稀釋成0.75、1.5、3、6、12、24 mmol·L-1作為GST的底物,將α-乙酸萘酯(含毒扁豆堿)稀釋成0.075、0.15、0.3、0.6、1.2 mmol·L-15個濃度作為CarE底物,將對硝基苯甲醚稀釋成3.144、4.192、5.240、6.288、7.336、8.384 mmol·L-1作為MFO底物,酶活性測定的方法同上,以Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法原理為基礎,利用 Excel線性回歸分析計算出Km和Vmax。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對試驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2013和SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析,采用Duncan氏新復極差法進行顯著性差異檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞致死濃度的確定

乙唑螨腈處理二斑葉螨48 h后,毒力回歸方程為y=0.99+1.11x,R=0.995,其中x代表劑量對數(shù),y代表死亡百分率,LC50為0.127 mg·L-1,由此計算得到LC40、LC30、LC20和LC10分別為0.075、0.043、0.022和0.009 mg·L-1。并選擇LC30、LC10做為亞致死濃度。

2.2 解毒酶比活力

2.2.1 羧酸酯酶(CarE)比活力 如圖1所示,二斑葉螨雌成螨經(jīng)乙唑螨腈亞致死劑量LC10和LC30處理后,其體內(nèi)的羧酸酯酶比活力較對照組都有顯著提高(P<0.05),二者均在6～12 h降低,12～24 h上升至最大值,此時LC10和LC30分別是對照的1.46和1.85倍,在24～36 h快速降低,在36～60 h緩慢降低的趨勢,且LC10處理組羧酸酯酶比活力顯著低于LC30處理組(P< 0.05)。對照組羧酸酯酶比活力則在6～24 h緩慢上升,24～36 h緩慢下降,36～60 h再次緩慢上升至最大值。LC10處理CarE比活力較對照在各時間點分別增長49.03%、20.18%、45.66%、24.50%、9.52%、2.97%,LC30分別增長 87.41%、37.02%、84.72%、35.30%、20.61%、11.43%,這說明乙唑螨腈亞致死濃度對羧酸酯酶的比活力均有影響,且不同的濃度和處理時間對羧酸酯酶的比活力產(chǎn)生的影響會有差異。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤。不同大小寫字母表示同一時間不同處理或同一處理不同時間解毒酶比活力經(jīng)Duncan氏新復極差法檢驗在 P<0.05 水平差異顯著。下同

2.2.2 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)比活力 如圖2所示,經(jīng)乙唑螨腈亞致死劑量LC10和LC30處理后,LC30處理組GSTs活性在6～12 h升高至最大值,是對照的1.24倍,在12～48 h逐漸降低至與6 h無顯著差異(P>0.05),最后在48～60 h再次升高;而LC10比活力則在6～24 h降至最低且低于對照,24～36 h升高至最大值,此時為對照的1.26倍,然后在36～48 h降低,最后在 48～60 h再次升高。LC10處理組GSTs比活力在12 h、24 h時低于對照組,GSTs處于抑制狀態(tài),其他時間點LC10、LC30處理組的比活力較對照組有顯著升高(P<0.05),且除36 h外,LC30處理組GSTs比活力都顯著高于LC10(P< 0.05)。LC10處理GSTs比活力較對照在各時間點分別增長18.70%、-7.39%、-3.53%、25.95%、13.23%、6.72%,LC30分別增長 22.79%、24.24%、35.67%、18.12%、18.30%、15.27%,這說明乙唑螨腈對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶比活力的誘導作用存在濃度和時間效應。

圖2 乙唑螨腈亞致死劑量下二斑葉螨雌成螨體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)比活力

2.2.3 多功能氧化酶(MFO)比活力 由圖3可知,經(jīng)乙唑螨腈亞致死劑量LC10、LC30處理后,二斑葉螨體內(nèi)MFO比活力顯著高于對照組(P<0.05)。LC30處理組除24 h低于LC10處理組外,其他時間都顯著高于LC10(P<0.05),且變化趨勢與對照組相似,呈現(xiàn)出 6～12 h上升至最大值,此時LC30為對照的1.52倍,在12～36 h下降至與6 h無顯著差異,然后在36～48 h再次上升,最后在48～60 h下降的趨勢。LC10處理組MFO比活力在6～24 h上升至最大值,此時為對照的1.61倍,在24～36 h下降,然后在36～48 h再次上升,最后在48～60 h下降。LC10處理MFO比活力較對照在各時間點分別增長 8.63%、8.43%、61.31%、14.35%、13.22%、9.66%,LC30分別增長33.05%、52.12%、45.68%、31.82%、33.53%、14.23%,說明乙唑螨腈的濃度和處理時間不同,對多功能氧化酶比活力的影響也不同。

圖3 乙唑螨腈亞致死劑量下二斑葉螨雌成螨體內(nèi)多功能氧化酶(MFO)比活力

2.3 解毒酶動力學常數(shù)

2.3.1 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)動力學常數(shù) 二斑葉螨雌成螨經(jīng)乙唑螨腈亞致死劑量處理后體內(nèi)GST的Km和Vmax的變化如表1所示。除12、24和48 h時LC10與對照無顯著差異外(P>0.05),LC10與LC30的Km均顯著高于對照組(P<0.05),處理組Km除36 h外其他時間點無顯著差異,且LC30顯著高于LC10(P<0.05);LC10組的Vmax除12 h、36 h時與對照無顯著差異(P>0.05),24 h時顯著高于對照(P<0.05)外,其他時間點對照都顯著高于LC10處理組(P<0.05)。LC30處理Vmax在6、12、24、48和 60 h顯著低于對照(P<0.05),而24 h與36 h時與對照無顯著差異(P>0.05),且除36 h外的其他時間點都顯著低于LC10(P<0.05)。

表1 乙唑螨腈亞致死劑量對二斑葉螨GST的動力學常數(shù)

2.3.2 羧酸酯酶(CarE)動力學常數(shù) 二斑葉螨雌成螨經(jīng)乙唑螨腈亞致死劑量處理后,體內(nèi)CarE的Km和Vmax的變化如表2所示。LC10、LC30兩個處理的Km都顯著低于對照(P<0.05),另外,LC30除6、48和60 h與LC10無顯著差異外,其余時間點都顯著低于LC10;LC10處理的Vmax于6、36和60 h時顯著高于對照(P<0.05),其他時間點與對照無顯著差異。LC30處理的Vmax在各個時間點都顯著高于對照(P<0.05),且除6 h外的時間點都顯著高于LC10(P<0.05)。

表2 乙唑螨腈亞致死劑量對二斑葉螨CarE的動力學常數(shù)

2.3.3 多功能氧化酶(MFO)動力學常數(shù) 二斑葉螨雌成螨經(jīng)乙唑螨腈亞致死劑量處理后,體內(nèi)MFO的Km和Vmax的變化如表3所示。LC10處理的Km在24、36和48 h時顯著高于對照(P<0.05),其他時間點與對照無顯著差異。LC30處理的Km在各個時間點都顯著高于對照(P< 0.05),且除24 h與36 h外,顯著高于LC10(P<0.05);LC10與LC30處理的Vmax在各個時間點都顯著低于對照(P<0.05),且LC10在6、12和 48 h時顯著高于LC30(P<0.05),其他時間點二者無明顯差異。

表3 乙唑螨腈亞致死劑量對二斑葉螨MFO的動力學常數(shù)

3 結(jié)論與討論

羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)是害螨對殺螨劑產(chǎn)生代謝抗性的重要酶系[23]。本研究中乙唑螨腈亞致死劑量對二斑葉螨雌成螨體內(nèi)解毒酶有誘導作用,且具有時間效應和劑量效應,說明二斑葉螨會對進入其體內(nèi)的乙唑螨腈產(chǎn)生一定程度的應激反應,具體表現(xiàn)為通過提高解毒酶活力,加強對乙唑螨腈的降解和排出,從而提高二斑葉螨對乙唑螨腈的抗性。動力學研究中發(fā)現(xiàn)CarE在二斑葉螨代謝乙唑螨腈時起主導作用。

乙唑螨腈亞致死劑量處理二斑葉螨后,其體內(nèi)解毒酶比活力呈上升趨勢,這與金晶等[24]及Khan等[25]報道一致,即化學藥劑亞致死劑量會使害螨體內(nèi)的解毒酶活性提高,進一步導致害螨對化學藥劑產(chǎn)生抗藥性。也有研究發(fā)現(xiàn)殺螨劑亞致死劑量對害螨體內(nèi)解毒酶有抑制作用,如谷清義[26]報道3種藥劑的亞致死濃度LC10與LC20會抑制土耳其斯坦葉螨(TetranychusturkestaniUgarov et Nikolski)CarE的活性;胡琴[27]發(fā)現(xiàn),阿維菌素亞致死劑量會抑制巴氏新小綏螨體內(nèi)GSTs的活性,造成此差異的原因可能是殺螨劑的作用機理與方式的不同,另外同類或同一殺螨劑在個體攝入量、個體抗性強弱以及接觸藥劑時間長短的影響下,對解毒酶活性的影響亦會存在差異。

乙唑螨腈LC10和LC30處理二斑葉螨后,其體內(nèi)解毒酶比活力受到的誘導程度隨著處理時間的延長存在差異,說明乙唑螨腈亞致死劑量對二斑葉螨體內(nèi)的解毒酶比活力的誘導存在時間效應,這與汝陽等[28]及尚素琴等[9]報道一致。本試驗在個別時間點,出現(xiàn)對照組的比活力顯著高于LC10或者LC10顯著高于LC30的情況,可能是乙唑螨腈亞致死劑量對二斑葉螨某些生理活動,如取食、睡眠和排泄等造成影響,進而影響到解毒酶活性,至于二斑葉螨生理活動對其體內(nèi)解毒酶活性的影響有待進一步考究。

處理時間一致時,乙唑螨腈亞致死劑量LC10與LC30對解毒酶比活力的誘導程度顯著高于對照,且LC30顯著高于LC10,即存在劑量效應,這與汝陽等[28]發(fā)現(xiàn)阿維菌素和噠螨靈高濃度的亞致死劑量對巴氏新小綏滿GSTs的誘導作用顯著高于對照和低濃度處理組的結(jié)果一致;與胡琴[27]報道阿維菌素亞致死劑量對巴氏新小綏螨不同溫度品系的MFO與CarE活性的影響存在劑量效應的結(jié)果一致;劑量效應可能是二斑葉螨對不同藥劑濃度采取的一種生存對策[29]。

酶動力學常數(shù)Km、Vmax的值分別表示解毒酶和底物親和力的強弱與反應速度的快慢,常用來衡量解毒酶在昆蟲抗藥性中的量變與質(zhì)變。二斑葉螨雌成螨經(jīng)乙唑螨腈亞致死劑量LC10、LC30處理后,CarE的Km值與對照組相比皆減小,Vmax值皆增大,而GSTs和MFOs的Km值均增大,Vmax均減小,其中Km值與酶和底物的親和力成反比,Vmax值與反應速率成正比。結(jié)果表明CarE與底物的親和力與反應速率要大于GSTs和MFO,可推測出二斑葉螨在代謝乙唑螨腈時CarE起主導作用,這與常蕓等[30]的研究結(jié)論一致。也有部分研究報道起主導作用的解毒酶并非CarE[31],這是因為不同害蟲或害螨對不同藥劑的代謝機制不完全相同,具體的代謝機制可能與蟲體本身的生理狀態(tài)、藥劑類型以及藥劑作用時間有關(guān)。

實際生產(chǎn)中,將乙唑螨腈與阿維菌素、噠螨靈和螺螨酯等[26]抑制羧酸酯酶活性的藥劑混合使用,即可提高乙唑螨腈對二斑葉螨防治效果。但本研究僅探討乙唑螨腈亞致死劑量對二斑葉螨體內(nèi)解毒酶活性即酶動力學常數(shù)的影響,至于抗性種群以及二斑葉螨對乙唑螨腈的分子抗性機制有待進一步探究。