賈曉旭,唐修君,陸俊賢,樊艷鳳,顧 榮,馬尹鵬,黃勝海,葛慶聯(lián),高玉時(shí)

(江蘇省家禽科學(xué)研究所,江蘇揚(yáng)州 225125)

種質(zhì)資源是農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的“芯片”,是解決中國(guó)畜牧業(yè)種源“卡脖子”問題的物質(zhì)基礎(chǔ)。中國(guó)是世界上雞遺傳資源最豐富的國(guó)家之一,經(jīng)過國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)鑒定的地方雞品種已經(jīng)有116個(gè)。經(jīng)過中國(guó)勞動(dòng)人民長(zhǎng)期的人工選擇和馴養(yǎng),形成了以烏骨雞為代表的獨(dú)特的變異性狀和特有的種質(zhì)資源。400多年前明代醫(yī)藥家李時(shí)珍所著《本草綱目》一書中,就有烏骨雞的記載:“烏骨雞,有白毛烏骨者,黑毛烏骨者、斑毛烏骨者,有骨肉皆烏者、肉白烏骨者,但觀雞舌黑者,則骨肉俱烏、入藥更良”[1],對(duì)這些具有優(yōu)勢(shì)特色性狀的種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)是一項(xiàng)十分重要的工作。

目前對(duì)雞種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)的分子標(biāo)記很多,應(yīng)用較多的為全基因組水平的遺傳標(biāo)記[2]、微衛(wèi)星標(biāo)記[3]和線粒體DNA標(biāo)記[4]。雞線粒體基因組全長(zhǎng)約16 kp,具有進(jìn)化速率快、基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、缺少基因重組和母系遺傳等特點(diǎn),被廣泛用于研究種群的起源進(jìn)化、遺傳多樣性和品種鑒定等方面[5-8]。目前對(duì)雞線粒體DNA的研究多集中于線粒體控制區(qū)(D-loop區(qū))[9]、C氧化酶亞基I(cytochrome C oxidase subunit,COI)[10]、細(xì)胞色素b基因(cytochrome b,Cytb)[11]等,利用NADH脫氫酶基因研究雞遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較少。在NADH脫氫酶中,NADH 脫氫酶亞基6(NADH dehydrogenase subunit 6,ND6)基因具有序列片段短、進(jìn)化速率中等、不含影響測(cè)序的復(fù)雜結(jié)構(gòu)、含有高分辨率的系統(tǒng)發(fā)育信息等優(yōu)點(diǎn),適合研究物種的遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。目前,利用ND6基因?qū)χ袊?guó)烏骨雞的遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化的研究尚未見報(bào)道。本研究以中國(guó)烏骨雞地方品種(絲羽烏骨雞,東鄉(xiāng)綠殼蛋雞,金湖烏鳳雞,余干烏骨雞)和商業(yè)化烏骨雞品種(新興竹絲雞3號(hào)配套系,親本為絲羽骨雞和隱性白羽雞,以下簡(jiǎn)稱竹絲雞)為材料,以線粒體ND6基因全序列為分子標(biāo)記,評(píng)估其線粒體DNA的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,以期為中國(guó)烏骨雞品種的保護(hù)、選育及資源鑒定提供理論 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

絲羽烏骨雞群體1(n=30)、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞(n=30)和金湖烏鳳雞(n=30)樣品來自國(guó)家級(jí)地方雞種基因庫(kù)(江蘇),絲羽烏骨雞群體2(n=42)樣品來自江西省泰和縣泰和雞原種場(chǎng)、余干烏骨雞樣品(n=36)來自余干縣畜禽良種場(chǎng),竹絲雞樣品(n=30)來自太倉(cāng)溫氏畜牧有限公司。所有采樣品種內(nèi)個(gè)體間沒有直接的親緣關(guān)系。用血液DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取基因組DNA,-80 ℃保存,備用。

1.2 試驗(yàn)方法

PCR擴(kuò)增和測(cè)序所用引物相同,正向引物:5′-CCCACAATCGGAACACTA-3′;反向:5′-TCTAACCAAGCGGGAATA-3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL,模板DNA(100～200 ng)2 μL, 2×PCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)25 μL,10 μmol/L上下游引物各 1 μL,滅菌水21 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,運(yùn)行35個(gè)循環(huán);再72 ℃延伸7 min;最后4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),確認(rèn)擴(kuò)增片段與目的片段一致后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用DnaSP 5.10.1軟件統(tǒng)計(jì)核苷酸多樣性、單倍型多樣性、平均核苷酸差異、變異位點(diǎn)數(shù)、單一突變位點(diǎn)數(shù)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)和單倍型數(shù)[12]。用MEGA 7.0軟件統(tǒng)計(jì)序列的平均堿基組成、品種內(nèi)和品種間的遺傳距離,采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。采用Network 10.2.0軟件繪制Median-joining單倍型網(wǎng)絡(luò)圖[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 線粒體 ND6基因序列變異分析

PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為732 bp,減掉兩端非ND6基因序列區(qū)域片段,成功獲得197條完整的線粒體ND6基因序列,長(zhǎng)度全部為522 bp,沒有發(fā)現(xiàn)插入或缺失。堿基T、C、A和G的平均比例分別是10.27%、38.77%、41.50%和9.46%, A+T的平均含量為51.77%,略高于G+C的含量48.23%,表現(xiàn)出一定的AT堿基偏好性,與鳥類線粒體DNA堿基組成的特征相符。

利用DnaSP 5.10.1軟件對(duì)197條序列進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析,共檢測(cè)到8處多態(tài)位點(diǎn)(表1),占核苷酸序列總長(zhǎng)度的1.53%(8/522),其中2個(gè)單一突變位點(diǎn)位于204、467位,6個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)位于64、70、178、253、403和418位。所檢測(cè)到的8處多態(tài)位點(diǎn)均為轉(zhuǎn)換,其中A/G之間轉(zhuǎn)換4 次,T/C之間轉(zhuǎn)換4 次。

表1 基于 ND6基因序列變異信息的烏骨雞單倍型分類

2.2 線粒體 ND6基因單倍型多樣性分析

基于197條烏骨雞序列發(fā)現(xiàn)的8個(gè)多態(tài)位點(diǎn),共界定8種單倍型,命名為Hap1～Hap8。各單倍型的數(shù)量及在品種間的分布見表1和表2。其中單倍型Hap1出現(xiàn)頻率最高,共68次;其次是單倍型Hap6,為58次;然后是單倍型Hap4為54次。Hap1、Hap2、Hap4和Hap6為共享單倍型,其中Hap4和Hap6在所有群體都有檢測(cè)到;Hap1除絲羽烏骨雞2個(gè)群體,其他品種均能檢測(cè)到;Hap2除絲羽烏骨雞群體1和竹絲雞,其他群體均能檢測(cè)到。Hap3、Hap5、Hap7和Hap8為獨(dú)立單倍型,Hap3只分布于余干烏骨雞,Hap5只分布于東鄉(xiāng)綠殼蛋雞,Hap7和Hap8分別只分布于絲羽烏骨雞群體1和余干烏骨雞。

表2 6個(gè)烏骨雞群體單倍型分布

2.3 不同品種遺傳多樣性和距離分析

6個(gè)烏骨雞群體遺傳多樣性見表3?？傮w單倍型多樣性為0.720±0.012,最高的為東鄉(xiāng)綠殼蛋雞為0.766±0.042,最低的竹絲雞為0.191±0.093。總體核苷酸多樣性為0.002 91± 0.000 92,東鄉(xiāng)綠殼蛋雞核苷酸多樣性最高為 0.003 83±0.001 08,竹絲雞最低為0.000 85±0.000 84。平均核苷酸差異為1.518,余干烏骨雞平均核苷酸差異最高為1.998,竹絲雞最低為 0.444。

表3 6個(gè)烏骨雞群體的遺傳多樣性

基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算6個(gè)群體烏骨雞的遺傳距離見表4,可以看出6個(gè)群體品種內(nèi)遺傳距離為0.000 86～0.003 87,竹絲雞最低,東鄉(xiāng)綠殼蛋雞最高。品種間遺傳距離為0.000 10～0.003 29。竹絲雞與2個(gè)絲羽烏骨雞群體之間的遺傳距離較遠(yuǎn),雙參數(shù)距離分別為0.003 29和 0.001 57;余干烏骨雞與金湖烏鳳雞的遺傳距離最近,雙參數(shù)距離值為0.000 10。

表4 基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算的6個(gè)烏骨雞群體品種內(nèi)和品種間平均遺傳距離

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

用Network 10.2.0構(gòu)建6 個(gè)烏骨雞群體的中介網(wǎng)絡(luò)圖,如圖1所示,6 個(gè)烏骨雞群體以Hap6為中心呈星狀發(fā)散分布,沒有按雞體型外貌或地理來源的不同進(jìn)行分類,只是在單倍型分布和比例存在差異。絲羽烏骨雞群體1包含3種單倍型,Hap4單倍型在該雞群體中占優(yōu)勢(shì);絲羽烏骨雞群體2有3種單倍型,Hap6單倍型在該群體中占優(yōu)勢(shì);東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、金湖烏鳳雞、余干烏骨雞和竹絲雞分別有5、4、6和3 種單倍型,優(yōu)勢(shì)單倍型都為Hap1。采用NJ法構(gòu)建6 個(gè)群體的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),發(fā)育樹分成2 個(gè)大枝,絲羽烏骨雞群體1和絲羽烏骨雞群體2聚為一支,東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、金湖烏鳳雞、余干烏骨雞和竹絲雞聚成一支。

不同顏色表示不同群體

圖2 基于mtDNA ND6基因采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

5個(gè)品種烏骨雞線粒體ND6基因序列的堿基T、C、A和G的平均比例分別是10.27%、38.77%、41.50%和9.46%,并且G含量最低,顯示出較明顯的堿基偏倚,這是由于蛋白質(zhì)編碼基因的核苷酸突變?cè)诿艽a子第3位點(diǎn)上受到的自然選擇壓力較小所致,證明密碼子第3位點(diǎn)能夠更清晰地表明線粒體基因組核苷酸組成的不均一性[15]。序列變異一般認(rèn)為是生物適應(yīng)環(huán)境變化的結(jié)果,是產(chǎn)生生物多樣性的根本來源,本研究發(fā)現(xiàn)烏骨雞mtDNAND6基因序列長(zhǎng)度為522 bp,發(fā)現(xiàn)的8處多態(tài)位點(diǎn)為64～467 bp,具有較高的突變率,可作為雞遺傳多樣性和起源進(jìn)化研究的分子標(biāo)記。

核苷酸多樣性和單倍型多樣性是衡量群體遺傳多樣性高低的兩個(gè)重要指標(biāo),數(shù)值越大,具有較大的適應(yīng)能力、生長(zhǎng)能力和進(jìn)化潛力,更容易開拓新環(huán)境[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)除5個(gè)烏骨雞品種除東鄉(xiāng)綠殼蛋雞和余干烏骨雞具有很高的遺傳多樣性以外,其他品種均處于較低水平。絲羽烏骨雞群體2(樣本來自原產(chǎn)地群體)的遺傳多樣性大于絲羽烏骨雞群體1(樣本來自基因庫(kù)保種群體),并且在單倍型分布比例上存在差異,可能與保種地和原產(chǎn)地環(huán)境差異有關(guān),提示保種過程中要定期與原產(chǎn)地群體進(jìn)行基因交流[17]。竹絲雞作為商業(yè)化品種,單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別只有0.191和0.000 85,品種內(nèi)遺傳距離為0.00 86,均低于其他烏骨雞地方品種。這種現(xiàn)象說明品種培育過程中,為了提高生產(chǎn)性能進(jìn)行高強(qiáng)度人工選擇會(huì)使群體的遺傳多樣性大大降低。

絲羽烏骨雞已經(jīng)有數(shù)百年的繁衍歷史,曾作為珍貴貢品上供朝庭,是中國(guó)最古老的雞品種之一。絲羽烏骨雞外貌與其他雞種有明顯的不同,標(biāo)準(zhǔn)的絲羽烏骨雞具有“十全”特征:桑葚冠、纓頭、胡須、綠耳、絲羽、毛腳、五爪、烏皮、烏肉和烏骨。同時(shí)絲羽烏骨雞具有性情溫馴、適應(yīng)性強(qiáng)、外形美觀、肉質(zhì)鮮嫩、藥用功能,是藥、肉、蛋、觀賞兼用型多用途雞種[1]。同中國(guó)其他地方雞品種一樣,絲羽烏骨雞生產(chǎn)性能不高,通過本品種選育很難有大幅度提升。竹絲雞是在絲羽烏骨雞基礎(chǔ)上培育而成。竹絲雞和絲羽烏骨雞雖然體型外貌相似,但生長(zhǎng)速度和繁殖性能都得到大幅度提升,最終產(chǎn)品的價(jià)格也要便宜很多。本研究表明竹絲雞與兩個(gè)絲羽烏骨雞群體之間的母系遺傳距離較遠(yuǎn),雙參數(shù)距離值分別為0.003 29和0.001 57,與竹絲雞父本來自絲羽烏骨雞,母本來自隱性白羽肉雞培育過程相符。同時(shí)可基于二者單倍型的不同,進(jìn)行絲羽烏骨雞和竹絲雞產(chǎn)品甄別,保證優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)。

線粒體作為細(xì)胞器位于細(xì)胞核外,線粒體DNA的遺傳信息是通過卵細(xì)胞傳遞給下一代,同時(shí)線粒體DNA變異具有累積效應(yīng),來自同一母系的單倍型會(huì)聚類在一起,稱為線粒體單倍型類群。本研究中6個(gè)烏骨雞群體以Hap6為中心呈星狀發(fā)散分布,沒有像D-loop區(qū)序列一樣形成多個(gè)單倍型類群,可能與ND6基因進(jìn)化速率低于 D-loop區(qū)有關(guān),但過高的進(jìn)化速率會(huì)產(chǎn)生重復(fù)突變,從而干擾系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建,特別是在種間及以上的系統(tǒng)發(fā)育分析中不能準(zhǔn)確地反映各個(gè)支系的關(guān)系[5]。雞的線粒體基因組長(zhǎng)度一般為 16 783～16 787 bp,除了線粒體D-loop區(qū),還包含13個(gè)編碼蛋白基因、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA),包含更多的遺傳信息[18],因此本研究認(rèn)為利用線粒體基因組或幾個(gè)不同區(qū)域的序列組合能夠更為全面準(zhǔn)確地掌握雞的母系起源情況。

4 結(jié) 論

烏骨雞線粒體ND6基因多態(tài)信息含量豐富,可作為遺傳多樣性和起源進(jìn)化的研究分子標(biāo)記。東鄉(xiāng)綠殼蛋雞和余干烏骨雞具有豐富的遺傳多樣性,絲羽烏骨雞和金湖烏鳳雞的遺傳多樣性相對(duì)較低,商業(yè)化品種竹絲雞的遺傳多樣性處于極低水平。可以利用竹絲雞與絲羽烏骨雞母系來源的不同,開發(fā)線粒體分子標(biāo)記區(qū)分竹絲雞和絲羽烏骨雞。