田慧敏,王秀艷

(赤峰學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古赤峰 024000)

光柄菇科Pluteaceae隸屬于擔(dān)子菌門Basidiomycota、傘菌目Agaricales,1972年由Kotlába建立[1]。該科主要鑒別特征為菌褶離生,肉粉色或粉褐色;子實(shí)層菌髓為逆兩側(cè)型;孢子無色,光滑,非擬淀粉反應(yīng),成堆時(shí)粉紅色,肉桂粉色;菌柄與菌蓋容易分離,有菌托或菌環(huán),或兩者均無[2]。根據(jù)《菌物詞典》第10版分類系統(tǒng),光柄菇科包括光柄菇屬PluteusFr.、小包腳菇屬VovariellaSpeg.和矮菇屬Chamaeota(W.G.Smith)Earle 3個(gè)屬,其中前兩個(gè)屬是光柄菇屬的主要類群,大約有350多種[3]。2011年Justo等[4]基于光柄菇科形態(tài)學(xué)分類和分子系統(tǒng)發(fā)育提出將小包腳菇屬Volvariella中菌蓋皮層呈凝膠狀、平均擔(dān)孢子長度≥11 μm 的種類歸為 一個(gè)新屬托光柄菇屬VolvopluteusVizzini,隸屬于光柄菇科,目前根據(jù)真菌索引統(tǒng)計(jì),托光柄菇屬包括9個(gè)種和變種。光柄菇科包括4個(gè)屬,該科的種很多為世界分布種,多生于腐木或林地腐殖質(zhì)上,早春至晚秋季節(jié)大量發(fā)生,該科許多種都是食用菌,如較常見的灰光柄菇(P.cervinus)、網(wǎng)頂光柄菇(P.umbrosus)、獅黃光柄菇(P.leoninus)和草菇(Volvariellavolvacea)等都是營養(yǎng)豐富,肉厚鮮美的食用菌[5],而有的種亦具有藥用價(jià)值,如鼠灰光柄菇具有抗糖尿病和抗氧化作用。近期研究發(fā)現(xiàn)P.cubensis具有降解除草劑的作用[6-7]。但是個(gè)別種具毒性,如柳生光柄菇(P.salicinus)和皺皮光柄菇(P.phlebophorus)分別具神經(jīng)性和損壞消化系統(tǒng)的毒性[8-9]。然而光柄菇科種間形態(tài)特征非常相似,差別不明顯,且在不同環(huán)境條件中同種子實(shí)體大小、顏色、附屬物等都有差異,包腳菇屬Vovariella和托光柄菇屬Volvopluteus兩屬有的種與鵝膏屬Amanita很相似,形態(tài)學(xué)鑒定有時(shí)會(huì)發(fā)生誤判的現(xiàn)象,基于rDNA-ITS區(qū)域的PCR擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)如ITS、nLSU和SSU應(yīng)用于光柄菇科真菌鑒定和親緣關(guān)系分析研究提升了該科真菌鑒定效率和準(zhǔn)確度[10-12]。目前,中國已報(bào)道的光柄菇屬真菌50種,小包腳菇屬真菌16種[13],加之饒固等[14]報(bào)道的托光柄菇屬——新記錄種,共67種,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于實(shí)際分布,而國內(nèi)關(guān)于光柄菇科的分類鑒定相關(guān)報(bào)道較少,筆者采用形態(tài)學(xué)和ITS序列測(cè)序鑒定相結(jié)合的方法對(duì)3個(gè)光柄菇科標(biāo)本進(jìn)行分類鑒定,以期明確其分類地位,對(duì)光柄菇科真菌資源分布與生物多樣性保護(hù)及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

標(biāo)本CFSZ10115、CFSZ10295于2013-08-12,CFSZ11537于2016-08-11采自內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市巴林右旗賽罕烏拉國家級(jí)自然保護(hù)區(qū),地理坐標(biāo):東經(jīng)118°18′～118°55′,北緯43°59′～44°27′。拍攝生境照片后,晾干、編號(hào),帶回實(shí)驗(yàn)室超低溫冷凍處理,室溫保存于赤峰學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院菌物標(biāo)本室。

1.2 形態(tài)鑒定

形態(tài)學(xué)特征鑒定方法主要參考文獻(xiàn)[15],野外采集后用游標(biāo)卡尺測(cè)量新鮮子實(shí)體的菌蓋直徑、菌柄直徑和長度;觀察和記錄菌蓋、菌柄和菌褶的形狀、顏色及其表面是否具附屬物等,觀察和記錄菌褶著生方式、是否有短菌褶、受傷后子實(shí)體顏色是否變化,描述菌肉顏色、味道和氣味等。子實(shí)體個(gè)數(shù)以2～5為準(zhǔn)。取干燥子實(shí)體菌蓋和菌柄表皮、菌褶制成臨時(shí)裝片觀察菌蓋和菌柄皮層(皮層菌絲、囊狀體)和子實(shí)層顯微結(jié)構(gòu)(擔(dān)子、擔(dān)孢子、褶側(cè)囊體、褶緣囊體),用雙目生物顯微鏡(奧特B203LED,愛迪泰克科技有限公司)在40倍鏡下觀察擔(dān)孢子、囊狀體、擔(dān)子,菌蓋和菌柄表皮囊狀體、菌絲等各微觀結(jié)構(gòu)的顏色變化,擔(dān)孢子隨機(jī)測(cè)量30個(gè),大小用長寬范圍表示,小梗不計(jì)入測(cè)量值內(nèi),并計(jì)算孢子平均長度(avl)、平均寬度(avw)和長寬比(Q值),Q1=長寬比最小值-長寬比最大值,Q2=Q±SD(標(biāo)準(zhǔn)差),菌絲、囊狀體、擔(dān)子等測(cè)量15～20個(gè)長和寬,以長范圍×寬范圍表示,其中菌絲則只測(cè)量寬度,寬度以最寬處為準(zhǔn)。再將梅爾澤試劑(Melzer’s reagent,2.5%碘化鉀、1.25%碘和50%為氯醛)加入到浮載劑中顯色,用雙目生物顯微鏡觀察孢子顏色有無變化,變藍(lán)說明含有淀粉質(zhì)。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

取子實(shí)體干品一小部分菌蓋(含菌褶)用研缽研磨后,稱取30 mg粉末,用DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)提取基因組DNA。每份標(biāo)本取不同的子實(shí)體提取2份DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)正向引物和反向引物為ITS1/ITS4引物[16]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Takara膠純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)純化回收后委托上海生工生物科技有限公司完成測(cè)序,所測(cè)序列均保存至GenBank數(shù)據(jù)庫(MG367239、MG367240和MG367242)中。將已測(cè)得的ITS序列提交GenBank檢索相似序列,用MEGA7.0.26軟件中的Alignment程序?qū)z索的相似序列和標(biāo)本序列進(jìn)行多重對(duì)位排比,并用Analysis程序用Kimura 2-parameter模式計(jì)算遺傳距離,Bootstrap循環(huán) 1 000次,采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

2.1.1 羽狀光柄菇PluteusdianaePilát 子實(shí)體小。菌蓋直徑3～4.5 cm,扁半球形,中央稍凸起,灰色、灰粉色、灰白色或淺褐色,干后白色,表面具平伏的淺色纖毛(圖1-A);菌肉白色,極薄;菌褶粉紅色,離生,稍密,不等長。菌柄3～6 cm×0.2～0.7 cm,長圓柱形,漸變中空,基部稍膨大,灰白色,基部灰褐色,有縱條紋。

A.子實(shí)體;B.擔(dān)孢子; C.褶側(cè)囊體;D.擔(dān)子;E.褶緣囊體;F.菌蓋菌絲;G.柄囊體;標(biāo)尺(B～G)=20 μm

孢子7.2～8.8(～9.6)μm×4.8～7.4 μm,avl×avw=8.6 μm×6.6 μm,Q1=(1.0～)1.21～1.36(～1.42),Q2=1.24±0.16,近球形或?qū)挋E圓形,無色,光滑,非淀粉質(zhì)(圖1-B);擔(dān)子19.2～33.6(～38.2)μm×7～9 μm,近長橢圓形或短棒狀,無色,光滑,薄壁,基部未見到鎖狀聯(lián)合(圖1-D);褶側(cè)囊體43.2～74.5 μm×15～24 μm,豐富,近似棒狀或梭形直至瓶狀,無色透明,在Melzer氏試劑中呈現(xiàn)金黃色(圖1-C);褶緣囊狀體35～45(～60)μm×10～19 μm,叢生,近棒狀或囊泡狀,壁薄,光滑,無色近透明,無內(nèi)含物(圖1-E);菌蓋表皮皮層菌絲形狀不規(guī)則、不勻稱,直徑5.52～10.7 μm,位于菌絲的末端細(xì)胞的形狀變化較大,圓筒形、棒狀或紡錘形,60～178 μm×10～22.8 μm,未見鎖狀聯(lián)合(圖1-F)。菌柄表皮層菌絲平行排列整齊,無色近透明,柄囊體圓柱形或棒狀,35～73 μm× 10～18 μm(圖 1-G)。

研究標(biāo)本:中國內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗,賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū),闊葉林倒木上單生,2013年8月12日,標(biāo)本號(hào)為CFSZ10115。

2.1.2 北方光柄菇PluteusleucoborealisJusto 子實(shí)體小,菌蓋直徑2.8～3.2 cm,半球形,白色表面有褐色鱗片,中部具明顯纖毛,表皮開裂翹起成纖毛狀鱗片,近皺(圖2-A)。菌褶白色,離生,邊緣鈍圓,寬約5～7 mm。菌肉白色,薄,傷不變色,氣味和味道未記錄。菌褶離生,初白色,漸粉色,腹鼓狀,不等長,寬0.4～0.7 cm,邊緣平滑。菌柄圓柱狀,3.3 cm×0.4～0.6 cm,白色或灰白色,表面有縱條紋,具褐色鱗片(圖2-B)。

擔(dān)孢子6.72～8.4 μm×4.8～6 μm, avl×avw=7.6 μm×5.5 μm, Q1= 1.14～1.36,Q2=1.19±0.16,光滑,近球形,卵圓形或?qū)挋E圓形,無色,非淀粉質(zhì)(圖2-D)。擔(dān)子22～34 μm× 7.5～11 μm,棒狀或?qū)挋E圓形,具4個(gè)孢子,壁薄,光滑,無色透明或具褐色染粒(圖2-C)。褶側(cè)囊體50～86.6 μm×16～22.8 μm,棒狀或瓶形,頂端著生2～4個(gè)角,無色光滑,厚壁,少數(shù)頂端鈍圓后的(圖2-E),擔(dān)子和褶側(cè)囊體在Melzer氏試劑中均呈現(xiàn)金黃色(圖2-F)。褶緣囊狀體豐富,42～68 μm × 12～18 μm,棒狀至狹長棒狀,稀狹長囊泡狀,壁薄,無色近透明。菌蓋皮層菌絲呈束狀排列,近圓筒狀,薄壁,頂端鈍圓或尖細(xì),具隔膜,頂端細(xì)胞30～60 μm×6～10 μm,鎖狀聯(lián)合未見(圖2-G),菌柄表皮菌絲束狀,近圓筒狀,粗 4～20 μm,末端鈍或稍尖,壁薄,無色或具褐色染色質(zhì)。

研究標(biāo)本:中國內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗,賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū),樺樹倒木上單生,2013 年 8月 13 日,標(biāo)本號(hào)為CFSZ10295。

2.1.3 密執(zhí)安托光柄菇Volvopluteusmichiganensis(A.H.Sm.)Justo &Minnis 菌蓋直徑4.2～6.3 cm,幼時(shí)呈斗笠狀,成熟后逐漸平展,中央鈍凸,白色或灰白色,表面覆蓋中央發(fā)出的放射狀褐色纖毛,中央色深呈黑褐色,向邊緣漸淺,蓋緣不平滑,有不同程度的裂紋(圖3-A);菌肉薄,白色,無特殊氣味;菌褶初白色后呈肉粉色或灰粉色,密,離生,不等長,有從蓋緣發(fā)出的短菌褶(圖3-B);菌柄長 5～9 cm× 0.5～1.2 cm,白色至米白色或淺灰黃色,纖維脆骨質(zhì),中空至實(shí)心,向下漸粗,柄上有白色絨毛,基部更密。菌托白色,苞片狀,寬1～2 cm(圖3-B)。

擔(dān)孢子10～13.2(～14.4.0)μm × 6.2～7.4(～8.4)μm,avl×avw=12.6 μm×7.4 μm,Q1=1.42～1.89,Q2=1.64±0.14,橢圓形至長橢圓形,淺褐色,有的中央具一大油滴(圖3-C);擔(dān)子 30～52 μm×12～15 μm,棒狀或倒梨形,具4小梗,較細(xì),無色透明,有內(nèi)含物(圖3-E)。褶側(cè)囊體48～102 μm×16～25 μm,紡錘形或燒瓶形,透明,薄壁(圖3-D);褶緣囊體42～62 μm× 18～25 μm,紡錘形、棒狀或者狹橢圓形,透明, 薄壁(圖3-F)。菌蓋表皮層由無色菌絲和膠狀菌絲組成,無色菌絲直徑3～10 μm,菌絲圓柱形,無色,壁薄,有隔膜;膠狀菌絲直徑6～13 μm,分枝(圖3-G)。菌柄表皮菌絲排列整齊,圓柱形,無色或帶有褐色素,細(xì)胞壁薄而光滑。柄囊體22～100 μm×11～18 μm, 圓柱形或紡錘形;菌托主要由致密的不規(guī)則圓柱形菌絲組成,3～18 μm(圖3-H)。在所有結(jié)構(gòu)中未見鎖狀聯(lián)合。研究標(biāo)本:中國內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗,賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū),闊葉林地上單生,2016年 8月 11日,標(biāo)本號(hào)為CFSZ11537。

2.2 rDNA-ITS測(cè)序鑒定

2.2.1 供試樣品測(cè)序比對(duì)結(jié)果 對(duì)3份標(biāo)本所測(cè)得的ITS序列,通過NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫使用BLAST檢索獲得36個(gè)序列與供試樣品具有較高相似度,物種名稱、登錄號(hào)和來源如表1。

表1 與供試光柄菇科3個(gè)樣品ITS序列相似的序列

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹 對(duì)所測(cè)樣品的ITS序列及其相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明:ITS序列聚為三大分支,分別為光柄菇屬Pluteus光柄菇組sectionPluteus、托光柄菇屬(Volvopluteus)和光柄菇屬Pluteus硬毛皮層組 sectionHispidoderma;一側(cè)支主要為光柄菇組sectionPluteus的種,包括羽狀光柄菇P.dianae、粉褶光柄菇P.plautus、粒蓋光柄菇P.granulatus、褪色光柄菇P.decoloratus、絨蓋光柄菇P.velutinus;羽狀光柄菇P.dianae位于第一側(cè)支,與粉褶光柄菇P.plautus聚在一起;第二側(cè)支托光柄菇屬(Volvopluteus)包括密執(zhí)安托光柄菇V.michiganensis、黏托光柄菇V.gloiocephalus、東方托光柄菇V.earlei、梅德爾托光柄菇V.media和庫克托光柄菇V.cooke,密執(zhí)安托光柄菇V.michiganensis位于第二側(cè)支;第三側(cè)支為光柄菇屬Pluteus硬毛皮層組sectionHispidoderma的種,包括北方光柄菇P.leucoborealis、白光柄菇P.pellitus、帽狀光柄菇P.petasatus;灰光柄菇P.cervinus;北方光柄菇P.leucoborealis位于第三側(cè)支(圖4)。

圖4 采用最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

中國已報(bào)道的托光柄菇屬(Volvopluteus)僅有兩個(gè)種,即密執(zhí)安托光柄菇V.michiganensis與黏蓋托光柄菇V.gloiocephalus,黏蓋托光柄菇V.gloiocephalus最初在小包腳菇屬(Volvariella)[25],Justo等[4]通過多基因(nSSU+ITS+nLSU)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,將Volvariellagloiocephalus轉(zhuǎn)為Volvopluteusgloiocephalu,該種在中國分布較廣。本研究標(biāo)本(CFSZ11537和CFSZ 11660)與之明顯不同,根據(jù)Justo等[4]描述密執(zhí)安托光柄菇V.michiganensis區(qū)別于其他種的特征為擔(dān)孢子平均長度小于12.5 μm,菌蓋邊緣有裂紋;饒固等[14]描述的本種菇菌蓋邊緣也存在裂紋或者條紋,本研究標(biāo)本菌蓋邊緣也具裂紋,但是裂紋較淺,可能與生境和生長周期有關(guān),擔(dān)孢子平均長稍大(12.58 μm),與測(cè)量誤差存在一定的關(guān)系。分子數(shù)據(jù)顯示本研究標(biāo)本與密執(zhí)安托光柄菇V.michiganensis相似度均在99%以上,與其他種的相似度都在94%以下。在中國主要分布于吉林省延邊市,采集時(shí)間在2019年7月,2020年12月提交ITS序列,在Genbank登記(MW242665)[14],本研究標(biāo)本采集時(shí)間和Genbank登記時(shí)間都先于饒固等[14]報(bào)道的新記 錄種。

羽狀光柄菇PluteusdianaePilát最早在捷克被采集到,隨后是丹麥、俄羅斯和土耳其等少數(shù)區(qū)域有報(bào)道[19],中國未有該種報(bào)道,為中國新記錄種。北方光柄菇P.leucoborealisJusto最早報(bào)道于俄羅斯西伯利亞地區(qū),在中國分布很少,僅見于西藏昌都市[13],密執(zhí)安托光柄菇V.michiganensis僅在吉林省有研究報(bào)道,二者均為內(nèi)蒙古新記錄種,由于其出現(xiàn)頻率較低,認(rèn)為二者均為偶見種。本研究結(jié)果擴(kuò)大了它們?cè)谥袊牡乩矸植挤秶?為今后科研工作者分類鑒定該科物種提供依據(jù),對(duì)光柄菇科真菌的分布及資源現(xiàn)狀做了有益補(bǔ)充,也為菌物資源生物多樣性研究和食用菌開發(fā)提供了依據(jù)。