于海波,張東鎖,高連亮,董 慧,郭 媛,胡勝武

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西楊凌 712100)

十字花科蕓薹屬包含許多重要的油料、蔬菜和飼用植物[1]。該屬植物包含6個(gè)重要的栽培種,其中3個(gè)二倍體基本種白菜(BrassicarapaL.)、甘藍(lán)(B.oleracea)、黑芥(B.nigra),以及這3個(gè)二倍體之間相互兩兩雜交后染色體加倍得到的3個(gè)四倍體復(fù)合種,甘藍(lán)型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.juncea)、埃塞俄比亞芥(B.carinata),它們之間的遺傳關(guān)系可以用著名的禹氏三角來表示。

植物遺傳信息由細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)基因組(線粒體、葉綠體基因組)組成,線粒體基因與細(xì)胞核基因之間相互交流,影響植物一些重要性狀的表達(dá),例如雄性不育、抗病性、種子發(fā)育等[2-4]。目前,蕓薹屬禹氏三角的6個(gè)栽培種甘藍(lán)型油菜[5]、芥菜型油菜[6]、埃塞俄比亞芥[6]、白菜[6-7]、甘藍(lán)[6,8]、黑芥[9]的線粒體DNA已完成測(cè)序。而且,蕓薹屬植物中一些重要的細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料,例如polCMS[10],hauCMS[11],oguCMS[12]以及BVRC-CMS96[13]的線粒體DNA也成功測(cè)序。基于線粒體DNA基因組上的細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因序列或者染色體結(jié)構(gòu)變異(例如InDel、SSR等),前人開發(fā)出了鑒定細(xì)胞質(zhì)類型的分子標(biāo)記,并對(duì)甘藍(lán)型油菜[14-15]、白菜型油菜[16]、芥菜型油菜[17]的細(xì)胞質(zhì)類型(線粒體類型)進(jìn)行了鑒定。研究結(jié)果表明,甘藍(lán)型油菜、芥菜型油菜、甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)存在豐富的種間[18-19],或者種內(nèi)多樣性[14,20-21]。梁龍兵等[19]利用線粒體及葉綠體特異SSR標(biāo)記,對(duì)甘藍(lán)型油菜等6個(gè)蕓薹屬栽培種進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)5對(duì)特異性引物能較好地鑒別蕓薹屬栽培種。

蕓薹屬植物細(xì)胞質(zhì)多樣性的研究,對(duì)其起源進(jìn)化和遺傳育種具有非常重要的意義。因此,本研究利用33份蕓薹屬植物材料,其中20份甘藍(lán)型油菜、2份芥菜型油菜、2份埃塞俄比亞芥、3份甘藍(lán)、2份白菜、2份黑芥,以及1份蕓芥和1份板藍(lán)根作為對(duì)照,利用文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)胞質(zhì)分子標(biāo)記對(duì)參試材料進(jìn)行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)前人報(bào)道的引物具有新的利用價(jià)值。研究結(jié)果將對(duì)蕓薹屬植物種質(zhì)資源的保護(hù)、挖掘與育種利用具有重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材 料

參試材料為33份蕓薹屬植物材料,其中包括20份甘藍(lán)型油菜(B.napus)、2份芥菜型油菜(B.juncea)、2份埃塞俄比亞芥(B.carinata)、3份甘藍(lán)(B.oleracea)、2份白菜(B.rapa)、2份黑芥(B.nigra),以及1份蕓芥(Erucasativa)和 1份板藍(lán)根(Isatisindigotica)作為對(duì)照(表1)。上述材料均由西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜研究中心提供,于2020年9月下旬種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)曹新莊試驗(yàn)地(N 34.30°,E 108.10°),常規(guī)田間管理。

表1 供試材料信息

本研究所用引物及信息見表2,來源于前人文獻(xiàn)報(bào)道[9,14,17,22]。上述引物均由擎科試劑公司(西安,中國)進(jìn)行合成,ddH2O稀釋至工作液(10 μmol/L),4 ℃保存,備用。

表2 引物信息

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 每份材料于幼苗期(2～3葉)隨機(jī)選取15株,采取整株幼嫩葉片混樣0.3 g,利用改良的CTAB法[23]進(jìn)行總DNA的提取。DNA沉淀用50 μL ddH2O溶解,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA質(zhì)量,并用分光光度計(jì)(BioTek Instruments,美國)檢測(cè)濃度,用ddH2O稀釋至40 ng/μL的工作濃度。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系及產(chǎn)物的檢測(cè) 參試材料細(xì)胞質(zhì)類型鑒定的一步多重PCR方法如Zhao等[14]的報(bào)道。Indel-F/R、rsp3F/R-1和mtSSR2-F/R引物PCR反應(yīng)體系均為20 μL,其中包括40 ng/μL DNA模板1.5 μL,2× Es Taq PCR Mix 10 mL(康為,北京),正向、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL,6.9 μL ddH2O,擴(kuò)增程序參照Shu等[22]的報(bào)道。

PCR反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在120～140 V電壓下電泳30～40 min,電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)(勤翔,中國)觀察并拍照記錄。

1.2.3 DNA膠回收測(cè)序及序列比對(duì) 根據(jù)DNA膠回收試劑盒(全式金,北京)說明書步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收,由擎科試劑公司(西安)完成測(cè)序,測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN 8.0軟件比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 參試材料的一步多重PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用Zhao等[14]發(fā)明的一步多重PCR方法,對(duì)參試材料進(jìn)行擴(kuò)增鑒定。結(jié)果(圖1)表明,在20份甘藍(lán)型油菜中,有10份材料為nap細(xì)胞質(zhì)類型,6份為pol類型,4份為cam類型。2份芥菜型油菜為cam類型,2份白菜為cam類型。該方法還在參試其他材料中也擴(kuò)增出特異的條帶類型,在甘藍(lán)材料中擴(kuò)增出500 bp和1 000 bp左右的特異帶型,將其命名為Bol-type;在2份黑芥材料中擴(kuò)增出了2種不同的帶型,分別命名為Bni-typeⅠ和Bni-typeⅡ,在2份埃塞俄比亞芥材料中,擴(kuò)增出的帶型與Bni-typeⅠ相似;在1份板藍(lán)根中擴(kuò)增的帶型與Bni-typeⅠ相似,命名為Bni-typelike;在蕓芥中擴(kuò)增出750 bp和 1 200 bp左右的特異帶型,將其命名為Esa-type(圖1,表1)。

M表示Marker,nap,pol,ogu, IP-ogu和cam分別表示nap,pol,ogu,IP-ogu和cam細(xì)胞質(zhì)材料,編號(hào)1～33代表的材料信息同 表1

2.2 Indel-F/R引物擴(kuò)增結(jié)果

利用Indel-F/R標(biāo)記[18]對(duì)參試植物材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果(圖2)表明,在17份參試材料中擴(kuò)增出3種不同大小的片段(分別是251 bp,282 bp和344 bp)。在2份芥菜型油菜材料中,一份材料(No.2)擴(kuò)增出282 bp條帶,而另一份材料(No.3)擴(kuò)增出251 bp條帶;在3份甘藍(lán)材料中擴(kuò)增出282 bp條帶;在2份白菜、2份埃塞俄比亞芥、2份黑芥、1份蕓芥和1份板藍(lán)根材料中均擴(kuò)增出251 bp條帶。在4份甘藍(lán)型油菜材料中,有1份pol細(xì)胞質(zhì)類型材料(No.4)和1份cam細(xì)胞質(zhì)類型材料(No.7)中擴(kuò)增出251 bp條帶,而2份nap細(xì)胞質(zhì)材料(No.5,No.6)卻擴(kuò)增出344 bp條帶(圖2,表1)。

M.Marker;編號(hào)1～17.材料信息同表1

再利用該引物對(duì)16份不同細(xì)胞質(zhì)類型的甘藍(lán)型油菜,其中有8份nap材料,5份pol材料和3份cam材料(圖3,表1),進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,在參試8份nap材料(No.18～25)中均擴(kuò)增出344 bp條帶,而在3份cam材料(No.26～28)和5份pol材料(No.29～33)中均擴(kuò)增出251 bp條帶(圖3)。

M.Marker,編號(hào)18～33.材料信息同表1

為明確Indel-F/R引物在不同細(xì)胞質(zhì)甘藍(lán)型油菜擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列,對(duì)上述nap、pol和cam細(xì)胞質(zhì)甘藍(lán)型油菜PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果用軟件DNAMAN進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果(圖4)表明,Indel-F/R引物在nap類型材料中擴(kuò)增產(chǎn)物大小為344 bp,在pol和cam類型中擴(kuò)增產(chǎn)物大小為251 bp。在pol和cam類型中擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸相似性為100%;nap類型擴(kuò)增產(chǎn)物與上述2種細(xì)胞質(zhì)類型(pol和cam)相比,多了一個(gè)長度為93 bp的DNA序列的插入(圖4)。綜上,該93 bp的InDel標(biāo)記可以用作鑒定甘藍(lán)型油菜(蕓薹屬植物)nap細(xì)胞質(zhì)的特異分子標(biāo)記。

紅框中核苷酸序列為nap細(xì)胞質(zhì)特有

2.3 rsp3F/R-1標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

利用rsp3F/R-1標(biāo)記對(duì)參試材料進(jìn)行擴(kuò)增分析,結(jié)果(圖5)表明,該標(biāo)記在參試材料中擴(kuò)增出兩種不同大小的片段(222 bp和255 bp)。在2份黑芥材料中(No.14,15)中,1份材料(No.14)擴(kuò)增出為255 bp的條帶,而在另1份材料(No.15)中,擴(kuò)增出為222 bp的條帶;在2份埃塞俄比亞芥中(No.12,13)均擴(kuò)增出222 bp條帶;在參試甘藍(lán)型油菜、芥菜型油菜、白菜、甘藍(lán)、蕓芥和板藍(lán)根材料中,均擴(kuò)增出255 bp的條帶。結(jié)果說明,該標(biāo)記可以用以區(qū)分埃塞俄比亞芥、黑芥和其他蕓薹屬植物。

M.Marker;編號(hào)1～17.材料信息同表1

2.4 引物mtSSR2-F/R擴(kuò)增結(jié)果

利用mtSSR2-F/R對(duì)參試材料進(jìn)行擴(kuò)增分析,結(jié)果(圖6)表明,該引物在2份埃塞俄比亞芥(No.12,13)、2份黑芥(No.14,15)中均擴(kuò)增出大小為420 bp的條帶,在參試甘藍(lán)型油菜、芥菜型油菜、白菜、甘藍(lán)、蕓芥和板藍(lán)根材料中,均擴(kuò)增出471 bp的條帶。結(jié)果說明,該標(biāo)記也可以區(qū)分埃塞俄比亞芥、黑芥和其他蕓薹屬植物。

M.Marker;編號(hào)1～17.材料信息同表1

3 討 論

十字花科蕓薹屬植物包含許多重要的油料、蔬菜和飼用作物,細(xì)胞質(zhì)類型的分析對(duì)其起源進(jìn)化和遺傳育種具有非常重要的意義。本研究利用已報(bào)道的細(xì)胞質(zhì)特異分子標(biāo)記對(duì)33份蕓薹屬植物進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析,研究結(jié)果表明,筆者前期開發(fā)的一步多重PCR技術(shù)[14]不僅能夠在一次PCR反應(yīng)中鑒定pol、ogu、IP-ogu、nap、cam等5種不同油菜細(xì)胞質(zhì)類型,同時(shí)發(fā)現(xiàn)該方法在埃塞俄比亞芥、黑芥、甘藍(lán)、蕓芥和板藍(lán)根中擴(kuò)增出特異的條帶,可以用來鑒定埃塞俄比亞芥、黑芥、甘藍(lán)、蕓芥和板藍(lán)根等物種的細(xì)胞質(zhì)類型。引物Indel-F/R在nap細(xì)胞質(zhì)甘藍(lán)型油菜材料中擴(kuò)增出一個(gè)長度為344 bp的特異條帶,在pol和cam細(xì)胞質(zhì)材料中擴(kuò)增產(chǎn)物長度為251 bp的條帶;序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該引物在nap細(xì)胞質(zhì)材料中擴(kuò)增產(chǎn)物多一個(gè)長度為93 bp的插入片段,該InDel標(biāo)記可鑒別甘藍(lán)型油菜的nap細(xì)胞質(zhì)。引物mtSSR2-F/R和rsp3F/R-1也在參試蕓薹屬植物擴(kuò)增中表現(xiàn)出多態(tài)性,可用作區(qū)分埃塞俄比亞芥、黑芥細(xì)胞質(zhì)類型的分子標(biāo)記。研究結(jié)果對(duì)蕓薹屬植物種質(zhì)資源的鑒定、保護(hù)及育種利用具有重要的參考價(jià)值。

Kang等[17]利用全基因組測(cè)序及重測(cè)序的方法,基于全球480份不同類型芥菜類植物(B.juncea)的細(xì)胞核及細(xì)胞器(線粒體及葉綠體)基因組的系統(tǒng)發(fā)育,對(duì)芥菜類植物的起源、馴化和多樣性進(jìn)行了探究。他們基于線粒體DNA基因組的重測(cè)序結(jié)果,開發(fā)了1對(duì)引物Indel-F/R,該引物能在參試芥菜材料中擴(kuò)增出2種條帶(125 bp和156 bp)。本研究中,筆者利用該Indel-F/R引物,也在參試的2種芥菜型油菜中擴(kuò)增出了2種不同大小條帶(251 bp和282 bp),它們之間也相差31 bp,然而其片段大小與Kang等[17]研究結(jié)果不同,其原因還需進(jìn)一步探究。更為有價(jià)值的是,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該Indel-F/R引物在甘藍(lán)型油菜nap細(xì)胞質(zhì)材料中,能夠特異地?cái)U(kuò)增出大小為344 bp的條帶;經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn),與pol和cam細(xì)胞質(zhì)類型材料的擴(kuò)增產(chǎn)物比較,nap類型材料的擴(kuò)增產(chǎn)物多了一個(gè)長度為93 bp的DNA插入片段。因此,該93 bp的InDel標(biāo)記,可以用作鑒定甘藍(lán)型油菜nap細(xì)胞質(zhì)的特異分子標(biāo)記。目前,對(duì)nap細(xì)胞質(zhì)的鑒定主要根據(jù)napCMS特異基因orf222判斷[15],本研究開發(fā)的該93 bp的InDel標(biāo)記豐富了nap細(xì)胞質(zhì)的鑒定方法。

前人研究結(jié)果表明,黑芥是埃塞俄比亞芥的母本親本種[24]。Yamagishi等[9]完成了黑芥的線粒體基因組測(cè)序,通過比較黑芥和埃塞俄比亞芥[7]的線粒體基因組,發(fā)現(xiàn)在線粒體基因組的53個(gè)基因中,二者僅有1個(gè)基因(rps3)存在序列差異;基于該基因第二外顯子上的一個(gè)InDel序列,開發(fā)了rsp3F/R-1引物。本研究利用該引物對(duì)2份黑芥材料進(jìn)行分析,結(jié)果其中1份材料擴(kuò)增出255 bp的條帶,而另1份材料擴(kuò)增出222 bp的條帶,而2份埃塞俄比亞芥擴(kuò)增出222 bp的條帶。本研究結(jié)果與Yamagishi等[9]一致,支持黑芥是埃塞俄比亞芥的母本親本種的觀點(diǎn)。同時(shí),在利用一步多重PCR鑒定參試材料細(xì)胞質(zhì)類型時(shí),發(fā)現(xiàn)2份黑芥的擴(kuò)增結(jié)果存在差異,表明兩份黑芥的線粒體基因組存在一定的多態(tài)性,可以利用親本種黑芥來拓寬埃塞俄比亞芥的細(xì)胞質(zhì)遺傳多樣性。

前人在菜花(B.oleraceavar.italica)細(xì)胞質(zhì)類型鑒定研究中,從21對(duì)線粒體SSR(mtSSR)引物和32對(duì)葉綠體SSR(cpSSR)引物中,篩選到1對(duì)SSR引物(mtSSR2-F/R),可以將菜花雄蕊心皮化細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料和正常細(xì)胞質(zhì)材料鑒別開來;序列分析發(fā)現(xiàn),mtSSR2-F/R開放閱讀框比正常材料缺少51 bp,該開放閱讀框位于蕓薹屬植物線粒體基因組orf125與orf108之間,與蘿卜(Raphanussativus)和埃塞俄比亞芥(B.carinata)具有高度同源性[22]。本研究中,筆者利用該對(duì)引物對(duì)參試材料進(jìn)行擴(kuò)增分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該引物在2份埃塞俄比亞芥和2份黑芥中擴(kuò)增出大小為420 bp的條帶,而在參試的甘藍(lán)型油菜、芥菜型油菜、白菜、甘藍(lán)、蕓芥和板藍(lán)根材料中,均擴(kuò)增出471 bp的條帶,該標(biāo)記可以區(qū)分埃塞俄比亞芥、黑芥和其他蕓薹屬植物。本研究結(jié)果不僅支持Shu等[22]研究結(jié)果,而且豐富了前人內(nèi)容。

總之,本研究以33份蕓薹屬植物為材料,發(fā)現(xiàn)前人報(bào)道的細(xì)胞質(zhì)特異分子標(biāo)記具有新的利用價(jià)值,研究結(jié)果對(duì)蕓薹屬植物的起源進(jìn)化研究和遺傳育種具有重要的參考價(jià)值。