劉 巍,王 華,楊若蘭,劉 露,張梓涵,秦虎強,黃麗麗

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué),旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室,陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院,陜西楊凌 712100;3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

獼猴桃(Actinidiachinensis)營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟價值高,已發(fā)展為陜西、四川、貴州等省區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展和鄉(xiāng)村振興的重要支柱產(chǎn)業(yè)[1]。然而,由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae,Psa)引致的細菌性潰瘍病(Kiwifruit Bacterial Canker)是產(chǎn)業(yè)上的毀滅性病害,可導(dǎo)致葉斑、花腐、枝干流膿,死樹毀園嚴(yán)重。目前,該病害的防治主要依賴化學(xué)藥劑,致使病原菌對銅制劑抗藥性增加[2]。生防菌具有低毒、低殘留、環(huán)境友好和不易產(chǎn)生抗藥性等特點,對保護果品安全和生態(tài)環(huán)境安全具有重要作用,而用于防治獼猴桃潰瘍病且市場化的生物藥劑種類較少,亟待尋找或開發(fā)高效、安全的生物藥劑。

淡紫灰鏈霉菌StreptomyceslavendulaegCLA4菌株是西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院果樹病害病原生物學(xué)和綜合防治研究團隊從黃瓜葉片中分離得到的一株內(nèi)生菌,其對真菌、卵菌和細菌等多種病原微生物具有廣譜的抑菌作用[3]。gCLA4菌株發(fā)酵濾液對獼猴桃潰瘍病菌抑菌效果明顯,抑菌圈直徑可達到25.5 mm[4],田間對潰瘍病的治療效果達64.9%,明顯優(yōu)于化學(xué)藥劑施納寧。但是,gCLA4菌株對潰瘍病的田間預(yù)防效果、抑菌活性成分及其在田間防治獼猴桃潰瘍病的效果尚不明確。為此,本研究采用離體室內(nèi)藥效測定及田間藥效試驗對該生防菌對獼猴桃潰瘍病的預(yù)防效果進行評價;同時以“生物活性追蹤”[5]為指導(dǎo),采用離子交換樹脂吸附、凝膠柱層析等色譜手段對其拮抗Psa的成分進行分離純化,經(jīng)ESI-MS/MS多級質(zhì)譜及核磁共振波譜對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進行鑒定,以期明確鏈霉菌gCLA4發(fā)酵液對獼猴桃潰瘍病的預(yù)防效果及具有主要抑菌作用的化學(xué)成分,為進一步篩選獼猴桃細菌性潰瘍病的生物藥劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試菌株:淡紫灰鏈霉菌S.lavendulaegCLA4(gCLA4),獼猴桃潰瘍病菌Pseudomonassyringaepv.actinidiae(Psa)均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院果樹病害病原生物學(xué)及綜合防治實驗室分離和保存。

供試培養(yǎng)基:gCLA4 發(fā)酵培養(yǎng)基(大豆粉15 g,蔗糖5 g,可溶性淀粉5 g,NaCl 5 g,K2HPO40.5 g,CaCO32 g,蒸餾水1 L),LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g,酵母浸粉5 g,NaCl 5 g,蒸餾水1 L,固體培養(yǎng)基加瓊脂粉18 g),高氏一號培養(yǎng)基(可溶性淀粉20 g,KNO30.1 g,K2HPO40.05 g, MgSO4·7H2O 0.05 g,瓊脂粉18 g)。

對照生防菌劑:解淀粉芽孢桿菌Ba168 WP(Bacillusamyloliquefaciens)(有效活菌數(shù)>100億/g),楊凌綠都生物科技有限公司;枯草芽孢桿菌WP(Bacillussubtilis)(有效活菌數(shù)>100 億/g),美國拜沃股份有限公司。

對照生物農(nóng)藥:3%中生菌素WP,東莞市瑞德豐生物科技有限公司;中生菌素原藥,陜西麥可羅生物科技有限公司。

試劑:724型大孔弱酸性陽離子交換樹脂,CM-Sephadex-C25凝膠,Sephadex LH-20凝膠。

儀器:Finnegan LCQ Advantage MAX高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有ESI電離源和離子阱質(zhì)量分析器(HPLC-ESI-MS/MS),美國熱電公司;Bruker RPX 500 MHz 核磁共振波譜儀。

1.2 方 法

1.2.1 gCLA4發(fā)酵液的制備 將gCLA4菌株在高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d后,用直徑為5 mm的打孔器制成菌餅,將菌餅接入裝有80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,28 ℃,150 r/min培養(yǎng)3 d制成種子液。將種子液按照5%的接種量(體積比)接入裝有95 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,28 ℃,150 r/min培養(yǎng)7 d,即獲得發(fā)酵液。然后于4 ℃ 4 000 r/min離心5 min取上清液用于后續(xù)試驗。

1.2.2 離體枝條藥效試驗 設(shè)置5個處理。處理1:gCLA4發(fā)酵液稀釋10倍液;處理2:對照商品生防菌1“解淀粉芽孢桿菌Ba168 WP 50倍液”;處理3:對照商品生防菌2“枯草芽孢桿菌WP 50倍液”;處理4:商品生物農(nóng)藥“3%中生菌素WP 100倍液”,處理5:清水對照。每個處理設(shè)置10個枝條,試驗重復(fù)3次。

枝條處理方法:選用‘紅陽’品種健康植株的1～2 a生枝條,剪成20 cm左右的小段,用自來水清洗后,用0.5%的次氯酸鈉水溶液進行表面消毒,用無菌水沖洗后晾干。用熔融的石蠟將晾干的枝條的兩端密封,用小刀橫向切破韌皮部形成傷口,備用。用藥劑先噴淋枝條,置16 ℃培養(yǎng)箱,黑暗放置24 h后接種,將培養(yǎng)好的15 μL菌液(OD600 nm=0.1)滴在枝條傷口處,放入盛有少量無菌水的托盤中,置于培養(yǎng)箱(16 ℃,黑暗培養(yǎng)),20 d后統(tǒng)計枝條上的病斑長度,按照下面公式計算預(yù)防效果,并進行差異顯著性分析。

預(yù)防效果=(對照組病斑平均長度-處理組病斑平均長度)/對照組病斑平均長度×100%

1.2.3 田間藥效試驗 藥劑處理同“1.2.2”。選取4個樹齡5～8 a生‘紅陽’獼猴桃園,在每個果園隨機劃分5個小區(qū)即5個處理,每個處理50株,4個重復(fù),即每個處理調(diào)查200株。在秋季采果后至落葉前的關(guān)鍵時期,以每個處理對應(yīng)的藥劑及濃度進行淋干2次,兩次施藥間隔為10 d,在春季枝干潰瘍高發(fā)期(3月-4月)統(tǒng)計各處理枝干潰瘍發(fā)病株樹占處理總株數(shù)的百分比,并以此為枝干潰瘍發(fā)病率即病株率,按照下式計算不同藥劑的田間預(yù)防效果。

預(yù)防效果=(對照組發(fā)病率-處理組發(fā)病率)/對照組發(fā)病率×100%

1.2.4 抑菌活性化學(xué)物質(zhì)的分離與純化 用去離子水漂洗724弱酸型離子交換樹脂,將浮在水面上的樹脂去除;樹脂裝柱后用4～5倍柱體積的HCl溶液(1 mol/L)緩慢沖洗,并用去離子水沖洗至中性。將沖洗至中性的樹脂用4～5倍體積的NaOH溶液(1 mol/L)緩慢沖洗,然后再用去離子水沖洗至中性。

在發(fā)酵液中加入NaOH使其pH為8左右,之后將發(fā)酵液緩慢加入處理后的樹脂中動態(tài)吸附,調(diào)整流速為5 mL/min,實時檢測通過液的pH,當(dāng)通過液為堿性時停止上樣,然后用去離子水沖洗樹脂柱至通過液為無色。用4倍柱體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的HCl緩慢解析,每0.5個柱體積為1個餾分,按照解析順序標(biāo)記8個餾分,標(biāo)號 1～8,解析液用NaOH調(diào)至中性,將標(biāo)號為1、3、5、7和8的餾分,采用濾紙片擴散法,以Psa為靶標(biāo)進行生物活性測定。在直徑為6 mm的濾紙片上滴加5 μL待測餾分,將濾紙片晾干后放置在涂布好Psa的培養(yǎng)基中于28 ℃培養(yǎng)12 h,檢查抑菌圈直徑[6],獲得活性最好的餾分。

采用濕法上樣,梯度洗脫的方法進行C-25型凝膠柱層析。將離子交換柱解析液中活性最好的餾分濃縮之后上樣,上樣體積為柱體積的1/10,待樣品完全進入凝膠之后分別用0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.6 mol/L的NaCl溶液進行洗脫,得到不同餾分。將各餾分濃縮后用LH-20凝膠等度洗脫脫鹽并進一步純化后進行生物活性測定。

1.2.5 抑菌活性化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定與抑菌活性測試 采用ESI-MS/MS多級質(zhì)譜以及13C NMR對活性餾分進行結(jié)構(gòu)鑒定。

采用濾紙片擴散法[6]測定活性物質(zhì)的抑菌活性。在直徑為6 mm的濾紙片上滴加待測物,其中鏈霉菌gCLA4發(fā)酵液為離心后的上清液,活性物質(zhì)濃度為1 mg/mL,中生菌素原藥按照有效成分配為1 mg/mL,以硫酸鏈霉素為陽性對照,蒸餾水為陰性對照。濾紙片載藥量為5 μL,將濾紙片晾干后放置在涂布好Psa的培養(yǎng)基中于 28 ℃培養(yǎng)12 h,采用十字交叉法測量抑菌圈直徑并進行記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈霉菌gCLA4對獼猴桃潰瘍病的預(yù)防效果

離體枝條試驗結(jié)果表明,鏈霉菌gCLA4對獼猴桃潰瘍病的預(yù)防效果顯著。gCLA4發(fā)酵液稀釋10倍涂抹枝條,在施藥48 h后接種Psa的預(yù)防效果為83.43%,顯著優(yōu)于解淀粉芽孢桿菌Ba168 WP 50倍液(對照生防菌劑A)的75.28%和枯草芽孢桿菌WP 50倍液(對照生防菌劑B)的70.20%;略低于3%中生菌素WP 100倍液(對照生物農(nóng)藥)的84.43%,但鏈霉菌gCLA4發(fā)酵液的預(yù)防效果與3%中生菌素?zé)o顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 鏈霉菌gCLA4對獼猴桃潰瘍病的預(yù)防效果

3月下旬對秋季施藥后獼猴桃潰瘍病發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果表明,施用鏈霉菌gCLA4發(fā)酵液的10倍稀釋液對獼猴桃潰瘍病的預(yù)防效果為 71.07%,優(yōu)于生防藥劑解淀粉芽孢桿菌Ba168 WP 50倍液(對照生防菌劑A)的61.64%和枯草芽孢桿菌WP 50倍液(對照生防菌劑B)的 68.24%;低于對照藥劑3%中生菌素WP 100倍液(生物農(nóng)藥)的76.73%,田間預(yù)防效果顯著(表1)。

2.2 鏈霉菌gCLA4活性成分的分離與鑒定

2.2.1 724弱酸型離子交換樹脂解析液的各餾分活性測試 以Psa菌株為靶標(biāo),活性測定結(jié)果表明(表2和圖1),發(fā)酵液中的活性成分主要集中在餾分3和餾分5,其中餾分5的活性最強,其抑菌圈直徑可達20 mm?？梢?發(fā)酵液中的活性成分可以被724型離子交換樹脂吸附并解析,由此可以推測活性成分為水溶性弱堿性化合物。

A.陽離子交換柱解析液抑菌效果(餾分5);B.CK;C.凝膠柱解析液抑菌效果(NaCl為1 mol/L);D.CK

表2 離子交換樹脂解析液對Psa的抑制作用

2.2.2 凝膠柱層析的各餾分活性測試 將經(jīng)過凝膠柱層析的各餾分以Psa菌株為靶標(biāo)做生物活性測定結(jié)果表明(表3,圖1),在洗脫液中NaCl的濃度為0.7 mol/L時可以將活性成分少量洗脫,當(dāng)洗脫液中NaCl的濃度為1 mol/L時可以將大部分活性成分洗脫。其中在洗脫液濃度為1 mol/L時,其對Psa的抑菌活性最強,抑菌圈直徑為26 mm。

表3 C-25型凝膠柱解析液各餾分對Psa的抑制作用

2.2.3 抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定 經(jīng)多次層析后,發(fā)現(xiàn)“2.2.2”中活性最強的餾分(解析液中NaCl濃度為1 mol/L)為純化后的化合物。經(jīng)ESI-MS/MS多級質(zhì)譜分析得到[M+H]+m/z: 503.257 0,對其進行二級質(zhì)譜分析,得到m/z:333.176 0、316.148 5、254.149 2、171.087 2等準(zhǔn)分子離子(圖2-A)。將該餾份進行濃縮后凍干,用D2H溶解后進行13C NMR分析,碳譜數(shù)據(jù)為:13C NMR(126 MHz,D2O)δ171.95、169.80、162.56、157.76、78.68、73.42、69.92、66.40、60.79、60.22、54.31、49.18、48.85、48.25、38.93、36.17、28.98、22.85(圖2-B)。經(jīng)數(shù)據(jù)比對,和文獻[7]報道一致,故鑒定該化合物為鏈絲菌素F,化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3所示。

A.鏈絲菌素F的質(zhì)譜圖;B.鏈絲菌素F的13C NMR 圖(125 MHz,D2O)

圖3 鏈絲菌素F的結(jié)構(gòu)式

2.2.4 活性物質(zhì)皿內(nèi)抑菌活性測試 鏈霉菌gCLA4的活性物質(zhì)鏈絲菌素F、菌株的發(fā)酵濾液及中生菌素藥劑的皿內(nèi)抑菌試驗表明(圖4),三者的抑菌效果明顯。其中,鏈霉菌gCLA4發(fā)酵濾液的抑菌圈直徑達16.0 mm±0.1 mm,鏈絲菌素F及中生菌素原藥的抑菌效果更好,抑菌圈直徑分別為20.0 mm±0.2 mm和22.0 mm± 0.2 mm。

A.鏈絲菌素F;B.發(fā)酵液;C.中生菌素原藥;D.CK

3 討 論

生防菌對病原菌具有競爭抑制作用,誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性,促進植物生長,調(diào)控微生態(tài)以及對病原菌的直接拮抗作用[8-9]。特別是植物內(nèi)生菌作為新的微生物資源,無論是植物病害的生物防治方面還是篩選新型殺菌劑或藥物先導(dǎo)化合物應(yīng)用于植物病害的化學(xué)防治方面,均具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。然而,利用生防菌防治獼猴桃潰瘍病的報道較少,特別是植物內(nèi)生菌對獼猴桃潰瘍病的防治研究更少。目前,王芳等[10]研究了鏈霉菌屬SY-L12菌株,發(fā)現(xiàn)菌株培養(yǎng)24 h對Psa的抑制效果為94.0%;燕金宜[11]研究了內(nèi)生真菌J2對Psa的拮抗作用,發(fā)現(xiàn)其抑菌圈可達到15 mm,且具有較好的遺傳穩(wěn)定性;王忠忠[12]研究表明芽孢桿菌YNP-1發(fā)酵液對Psa的抑菌圈直徑可達24 mm。上述研究均為實驗室皿內(nèi)抑菌試驗,效果較好,尚缺乏獼猴桃潰瘍病田間防效評價。因此,亟需篩選獲得田間防效較好的生防菌株,為進一步開發(fā)生物藥劑奠定基礎(chǔ)。

鏈絲菌素(streptothricins)是最早發(fā)現(xiàn)的抗生素之一,為一類堿性的水溶性化合物,該類化合物有streptothricin A～F和X共7個組分,它們化學(xué)結(jié)構(gòu)極其相似,包含一分子的D-古洛糖胺,一分子鏈里定內(nèi)酰胺,以及不同數(shù)量的β-賴氨酸[13]。本試驗通過ESI-MS/MS多級質(zhì)譜分析得到[M+H]+m/z:503.257 0,將該離子進行二級質(zhì)譜分析,得到m/z:333.176 0、316.148 5、254.149 2、171.087 2等準(zhǔn)分子離子,這些準(zhǔn)分子離子是鏈絲菌素類化合物的特征性離子[14],進而通過13C NMR數(shù)據(jù)比對確定其主要的活性成分為鏈絲菌素F。據(jù)報道,鏈絲菌素F具有較好的抑菌活性,研究人員從秦嶺鏈霉菌中分離純化出鏈絲菌素類化合物,并篩選出鏈絲菌素D和F,兩者對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等抑菌活性最好[15],而對丁香假單胞桿菌特別是Psa的抑菌活性尚未見報道。此外,西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院果樹病害病原生物學(xué)和綜合防治研究團隊實驗室前期對鏈霉菌gCLA4菌株的基因組進行測序和基因功能預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其具有的NRPS型合成通路與鏈絲菌素的生物合成基因簇高度吻合[16],這也從分子生物學(xué)角度印證了鏈霉菌gCLA4的抑菌物質(zhì)為鏈絲菌素類化合物。

以鏈絲菌素為主要有效成分的中生菌素是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物防治研究所從淡紫灰鏈霉菌海南變種Streptomyceslavendulaevar.hainanensis開發(fā)出了擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的農(nóng)用抗生素。它具有較強的水溶性,可以通過抑制病原細菌蛋白質(zhì)肽鍵的合成、真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā),進而表現(xiàn)廣譜而良好的抑菌效果,可用于防治番茄青枯病、白菜軟腐病、甜瓜細菌性果斑病等細菌病害及草莓灰霉病、蘋果樹輪紋病等真菌病害[17]。鑒于鏈霉菌gCLA4對獼猴桃潰瘍病的預(yù)防效果顯著且抑菌物質(zhì)為鏈絲菌素類化合物,本研究團隊快速尋找到中生菌素作為預(yù)防獼猴桃潰瘍病的候選生物藥劑。后續(xù)研究表明,3%的中生菌素可濕性粉劑800倍液噴施對獼猴桃潰瘍病的防效為69.0%,是化學(xué)藥劑噻菌銅防效的2倍[18]。進而,秦虎強等[1]開發(fā)了中生菌素田間施用技術(shù),在明確 “花前花后”和“采果后至落葉前”關(guān)鍵施藥時期的基礎(chǔ)上,將中生菌素等抗生素類、芽孢桿菌類生防菌劑和銅制劑交替使用,對潰瘍病平均防效可達75%以上,既降低了化學(xué)農(nóng)藥污染及抗藥菌株出現(xiàn)的風(fēng)險,又保證了綠色果品安全,還改善了果園生態(tài)環(huán)境。

4 結(jié) 論

黃瓜內(nèi)生淡紫灰鏈霉菌gCLA4菌株對獼猴桃潰瘍病的防控效果顯著且穩(wěn)定,室內(nèi)和田間的防效分別為83.43%和71.07%。采用離子交換樹脂和凝膠層析等手段對鏈霉菌gCLA4中的主要活性物質(zhì)進行分離,經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振波譜技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)為鏈絲菌素F。