崔瑞媛,林金玉,徐世才,李伯遼

(1.陜西省紅棗重點實驗室,陜西延安 716000;2.延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西延安 716000)

昆蟲是變溫動物,對生物和非生物環(huán)境變化敏感,熱激蛋白(Heat shock protein,HSP)在昆蟲逆境響應(yīng)中起重要作用。在高溫和低溫等不利環(huán)境下,熱激蛋白參與多種生理過程[1],響應(yīng)溫度[2-4]、干旱[5]、饑餓[6]、殺蟲劑脅迫[7-8]等不同逆境。根據(jù)蛋白分子質(zhì)量大小和序列相似性,將熱激蛋白分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小熱激蛋白[9]。其中,HSP20蛋白分子質(zhì)量在15～42 ku,家族內(nèi)序列多樣性較高,但C端具有80～100個氨基酸組成、較為保守的α-晶體結(jié)構(gòu)域(α-crystallin domin,ACD)[10],是一類依賴于ATP的分子伴侶,通常在逆境下與蛋白質(zhì)結(jié)合抑制蛋白質(zhì)變性,保護(hù)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、維持正常功能[11]。

小菜蛾P(guān)lutellaxylostella是重要的十字花科蔬菜害蟲,世代周期短,繁殖迅速。該種無滯育現(xiàn)象[12]。對高溫和低溫適應(yīng)性較強(qiáng),在中國北方地區(qū)冬季該蟲可在設(shè)施蔬菜大棚中越冬。前人在小菜蛾中雖鑒定出一些Hsp20基因[13],但受當(dāng)時組學(xué)技術(shù)限制,未能探究序列在基因組中序列結(jié)構(gòu)和相對位置。本試驗首先從小菜蛾基因組中鑒定Hsp20家族基因,對Hsp20家族基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和基序進(jìn)行分析,在對照組、4齡幼蟲短期低溫處理、適應(yīng)后4齡幼蟲短期低溫處理的轉(zhuǎn)錄組中篩選差異表達(dá)的Hsp20家族基因,通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)比較目標(biāo)基因在不同低溫處理中的表達(dá)量,確定響應(yīng)零上低溫的Hsp20家族基因表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 小菜蛾基因組 Hsp20家族基因鑒定

小菜蛾基因組從NCBI Genome數(shù)據(jù)庫中下載(Assembly: GCA_905116875.1)[14]。為鑒定小菜蛾候選Hsp20家族基因,從Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中下載Hsp20的HMM文件,利用HMMER(v3.3)基于隱馬爾科夫模型(HMM)在基因組中對序列進(jìn)行搜索(P< 0.001),舍棄蛋白分子質(zhì)量在15～42 ku之外的Hsp20。

1.2 蛋白質(zhì)序列分析和結(jié)構(gòu)特征

利用R包Peptide(v 2.44)計算HSP20s蛋白分子質(zhì)量(mw)和理論等電點(pI)[15]。利用MEME軟件(v 5.3.3)分析保守motifs[16],TBtools(v 0.665)分析PxHsp20家族基因結(jié)構(gòu),進(jìn)行染色體定位[17]。

1.3 蟲源飼養(yǎng)及低溫處理

本試驗蟲源于2020年初采自延安市寶塔區(qū)正大宏綠化園林公司周邊蔬菜大棚(109°26′ E,36°38′ N),室內(nèi)用人工飼料繼代飼養(yǎng)[18]。蟲源飼養(yǎng)于人工氣候箱內(nèi),飼養(yǎng)條件:溫度(26±1)℃,相對濕度(55±10)%,光期∶暗期=12∶12。將產(chǎn)卵紙置于養(yǎng)蟲盒中,待卵孵化移至有飼料的養(yǎng)蟲盒;待幼蟲發(fā)育到試驗蟲態(tài)的前一齡期,單頭飼養(yǎng)于玻璃試管(直徑d=15 mm,高度h=10 cm),用棉花封口延緩飼料干燥;化蛹后將飼料倒出,以保持試管內(nèi)部干燥;成蟲羽化后成對收集至塑料杯(14 mL)中,扎孔后用保鮮膜覆蓋杯口,10%蜂蜜水喂養(yǎng),杯內(nèi)懸掛3 cm×4 cm長方形的摩擦塑料紙以收集蟲卵。

根據(jù)延安本地冬季夜間大棚夜間溫度,在4齡幼蟲設(shè)置8 ℃和4 ℃ 2個溫度,每個溫度設(shè)置24 h、48 h、96 h 3種低溫處理時長,直接低溫和前一齡期15 ℃適應(yīng)后低溫兩種處理方式,每一蟲態(tài)共設(shè)置2溫度×3處理時長×2處理方式,共12組處理以及對照,對照組為26 ℃恒溫。處理完成后立即用液氮殺死,將蟲體放置在-80 ℃冰箱中保存。

1.4 差異基因篩選和實時熒光定量PCR

使用DIAMOND[19]將小菜蛾4齡幼蟲短期低溫組(8 ℃ 24 h)、適應(yīng)后短期低溫組(3齡幼蟲15 ℃適應(yīng)后4齡幼蟲8 ℃ 24 h)以及對照組(26 ℃恒溫)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表)與鑒定到的PxHsp20s序列進(jìn)行比對(北京諾禾致源生物科技有限公司,Illumina HiSeq 2500平臺),利用R包DEseq2(v 3.14)對不同處理轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行差異表達(dá)分析[20],篩選差異表達(dá)的PxHsp20,標(biāo)準(zhǔn)為|log2Fold Change|>1且padj<0.01。PxHsp20家族基因轉(zhuǎn)錄本熱圖用R包pheatmap繪制(v 1.0.12)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小菜蛾 Hsp20家族基因鑒定及序列分析

利用HMM搜索從小菜蛾基因組中獲得18條Hsp20家族基因序列,其中1條(FUN_008335-T1,分子質(zhì)量65.1 ku)編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在15～42 ku之外,故在后續(xù)分析中舍棄。17個PxHsp20家族基因根據(jù)其在染色體中的位置命名。表1顯示基因的名稱、Gene ID、在染色體中的位置、開放閱讀框長度、內(nèi)含子數(shù)量、編碼的蛋白質(zhì)序列長度、相對分子質(zhì)量(mw)、等電點(pI)。PxHsp20家族基因編碼的蛋白質(zhì)序列最短為166個氨基酸(PxHsp20-15),最長為333個氨基酸(PxHsp20-2),分子質(zhì)量介于18.80～36.60 ku,等電點介于5.65(PxHsp20-1、PxHsp20-2)和8.05(PxHsp20-12、PxHsp20-15)。

表1 小菜蛾 PxHsp20家族基因的特征

通過PxHsp20scDNA與小菜蛾基因組序列比對,確定PxHsp20s的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。17個PxHsp20s中,只有PxHsp20-5(FUN_003617-T1)具有3個外顯子和2個內(nèi)含子,PxHsp20-2(FUN_018545-T1)和PxHsp20-6(FUN_008339-T1)具有2個外顯子,其余14個PxHsp20s均只有1個外顯子、無內(nèi)含子(圖1-C)。

A.系統(tǒng)發(fā)育樹;B.保守結(jié)構(gòu)域,不同顏色方框代表不同類型基序;C.基因結(jié)構(gòu),黃色方框代表外顯子,灰色橫線代表內(nèi)含子,淺綠色方框代表非編碼區(qū)。Motifs的詳細(xì)信息見表2

PxHsp20s基序模式如圖1-B所示,共存在8種保守基序。長度為8～88個氨基酸殘基。8種典型基序信息見表2。根據(jù)Pfam和CDD分析,Motif 1與保守的ACD結(jié)構(gòu)域(alpha crystallin domain)完全對應(yīng),Motif 6和Motif 8共同組成近似完整的ACD結(jié)構(gòu)域。PxHsp20-1、PxHsp20-2、PxHsp20-3、PxHsp20-5、PxHsp20-15由Motif 6和Motif 8組成ACD結(jié)構(gòu)域,其余12個PxHsp20s均由Motif 1組成ACD結(jié)構(gòu)域。小菜蛾17條PxHsp20s家族基因分布在5個染色體,其中11條分布在27號染色體,3條分布在5號染色體,PxHsp20-4、PxHsp20-5、PxHsp20-6分別分布在8號、13號、19號染色體。Hsp20家族內(nèi)17條基因無串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制事件(圖2)。

圖2 PxHsp20s基因染色體位置

表2 PxHSP20蛋白質(zhì)潛在基序

2.2 不同低溫處理對 PxHsp20-8表達(dá)量的影響

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的PxHsp20s,在對照組、8 ℃低溫24 h、15 ℃適應(yīng)后8 ℃低溫24 h處理的表達(dá)量熱圖如圖3所示,僅PxHsp20-8在4齡幼蟲不同低溫處理中呈現(xiàn)顯著差異。

CK.26 ℃恒溫對照;CS.4齡幼蟲8 ℃低溫24 h;CA.3齡幼蟲15 ℃適應(yīng)后4齡幼蟲8 ℃低溫24 h。同一行顏色代表歸一化的read counts結(jié)果

經(jīng)高斯分布的廣義線性模型分析(圖4),低溫處理溫度對PxHsp20-8表達(dá)量無顯著影響(t= 2.176,P=0.053 1),低溫前是否經(jīng)歷15 ℃適應(yīng)對表達(dá)量有極顯著影響(t=-2.752,P= 0.009 7),低溫處理時長對表達(dá)量無顯著影響(t=-0.403,P=0.689 4)。對各處理組表達(dá)量分別與對照組表達(dá)量進(jìn)行t檢驗,發(fā)現(xiàn)8CS2(上調(diào)3.15倍,t=8.48,P=0.013 4)、4CS2(上調(diào) 4.15倍,t= 40.21,P=0.000 3)、4CS3(上調(diào) 7.60倍,t=29.37,P=0.0010)顯著高于CK組,而8CA1(下調(diào)3.07倍,t=-6.627,P=0.021 7)、8CA2(下調(diào)8.31倍,t=-16.35,P=0.003 6)、8CA4(下調(diào)2.60倍,t=-6.627,P=0.021 6)顯著高于CK組。比較相同溫度持續(xù)相同時間不同處理條件下的PxHsp20-8相對表達(dá)量,8 ℃ 24 h、8 ℃ 48 h、4 ℃ 48 h、4 ℃ 96 h條件下4齡幼蟲直接低溫的相對表達(dá)量顯著高于適應(yīng)后低溫,分別上調(diào)3.03倍(t=-3.99,P=0.032 4)、2.37倍(t=-17.46,P<0.000 1)、4.31倍(t=-9.91,P=0.008 4)、4.71倍(t=-18.69,P=0.000 4)(圖4)。

CS.4齡幼蟲直接低溫;CA.3齡幼蟲15 ℃適應(yīng)后4齡幼蟲低溫。柱上*、**、***、****分別代表相應(yīng)CA和CS組基因相對表達(dá)量經(jīng)t檢驗后P<0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.000 1

3 討 論

前人研究認(rèn)為小熱激蛋白參與昆蟲的多種生理過程,典型的是昆蟲對于高溫和低溫的響應(yīng)[1]。

本研究從小菜蛾P(guān).xylostella染色體級基因組中鑒定出17個Hsp20家族基因[13],少于家蠶Bombyxmori(基因組登錄號:GCA_014905235.2)中的21個[22]和帝王蝶Danausplexippus(基因組登錄號:GCA_009731565.1)中的20個。17個PxHsp20s分布在5條染色體中,其中PxHsp20-7到PxHsp20-17共11個基因分布在27號染色體,這些空間位置較近的基因序列較相似,在進(jìn)化關(guān)系上也較近。PxHsp20-1和PxHsp20-2編碼的蛋白分子質(zhì)量分別為28.95 ku和36.60 ku,其他PxHsp20編碼的蛋白分子質(zhì)量較為接近,均在18 ku到24 ku之間。僅3個PxHsp20家族基因具有內(nèi)含子,缺少內(nèi)含子意味著RNA折疊加工迅速,可能與HSP20蛋白迅速響應(yīng)環(huán)境變化有關(guān)[23]。

小菜蛾4齡幼蟲經(jīng)8 ℃低溫短期低溫處理和適應(yīng)后8 ℃短期低溫處理后,僅PxHsp20-8表達(dá)量發(fā)生顯著變化。對4齡幼蟲進(jìn)行不同溫度和不同時長短時低溫處理。與對照組相比,大部分直接低溫處理引起PxHsp20-8上調(diào),而大部分適應(yīng)后低溫處理引起PxHsp20-8下調(diào)。短時低溫引起小熱激蛋白家族基因上調(diào)較為多見,但Hsp20家族與Hsp70和Hsp90家族相比保守性不高,高溫或低溫處理后Hsp20各成員表達(dá)變化較為多樣[24]。例如二化螟ChilosuppressalisCsHsp19.8、CsHsp21.7被高溫和低溫強(qiáng)烈誘導(dǎo),但在溫和低溫下表達(dá)量無顯著變化,CsHsp21.4和CsHsp21.7在高溫和低溫條件下無顯著變化,CsHsp21.5在-11 ℃脅迫 2 h后表達(dá)量上調(diào)10.75倍[23]。煙草甲LasiodermaserricorneLsHsp20.2、LsHsp20.3、LsHsp22.2在5 ℃處理2 h后表達(dá)量顯著上升,而LsHsp19.4與對照組相比無顯著變化[25]。草地貪夜蛾SpodopterafrugiperdaSfHsp20.1、SfsHsp19.3在4 ℃短時處理后不上調(diào),SfHsp21.3、SfHsp20、SfHsp29.4上調(diào),而這5個基因在42 ℃短時處理后均上調(diào)[4]。

本試驗中8 ℃ 24 h、8 ℃ 48 h、4 ℃ 48 h、4 ℃ 96 h低溫處理下,小菜蛾4齡幼蟲直接低溫組其PxHsp20-8表達(dá)量均顯著高于適應(yīng)后4齡幼蟲低溫組表達(dá)量。直接低溫和適應(yīng)后低溫條件下Hsp20基因表達(dá)量的比較研究相對較少。與從25 ℃直接轉(zhuǎn)移至0 ℃的鈴木氏果蠅Drosophilasuzukii相比,經(jīng)過10 ℃持續(xù)9 d適應(yīng)后鈴木氏果蠅的DsHsp60C、DsHsp27顯著下調(diào),而DsHsp22顯著上調(diào)[26]。

4 結(jié) 論

利用生物信息學(xué)分析從小菜蛾基因組中鑒定出17個Hsp20家族基因,分布在5個染色體。其中,PxHsp20-8表達(dá)量受低溫影響,溫和低溫直接處理小菜蛾4齡幼蟲引起PxHsp20-8上調(diào),3齡幼蟲15 ℃適應(yīng)后接4齡幼蟲溫和低溫引起PxHsp20-8下調(diào)。