包雪梅,宗 淵,胡 娜,劉寶龍,王洪倫

(1.中國科學院 藏藥研究重點實驗室 西北高原生物研究所,西寧 810008;2.青海師范大學,西寧 810008;3.中國科學院大學,北京 100049;4.青海省作物分子育種重點實驗室,西寧 810008)

西伯利亞白刺(NitrariasibiricaPall.)是蒺藜科白刺屬植物[1],是一種生長在沙漠、鹽堿地的灌木,在中國主要分布于甘肅、青海、內(nèi)蒙古等地,具有較強的耐鹽性及環(huán)境適應(yīng)性[2],可用于減少土壤鹽漬化及防風固沙[3]。白刺果實含有黃酮、苯丙素、生物堿、多糖等化學成分,花青素被認為是白刺的主要化學成分之一。白刺果實的藥理活性已被廣泛研究,其具有抗氧化[4]、抗炎[5]、神經(jīng)保護[6]、降血脂[7]等藥理活性。

花青素和原花青素是兩類廣泛存在于高等植物中的類黃酮次生代謝產(chǎn)物,廣泛存在于高等植物的各個組織器官內(nèi)?；ㄇ嗨厥且活愃苄远喾宇惿?主要存在于細胞液泡中,賦予植物花、莖、葉及果實等組織紅色、紫色和藍色[8]。原花青素由不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素聚合而成,又稱縮合鞣質(zhì),是一類廣泛存在于自然界中的黃烷-3-醇類化合物,在酸性條件下水解為單體,可轉(zhuǎn)化為有色花青苷[9]。按聚合度的大小,可分為低聚原花青素和高聚原花青素,可有效防止食草動物和害蟲啃食植物[10]?；ㄇ嗨睾驮ㄇ嗨鼐欣谥参锏钟珊?、低溫和紫外線等逆境,促進植物對環(huán)境的適應(yīng)性。藥理學研究表明,花青素和原花青素均是天然的抗氧化劑[11-12],同時,還具有抗炎[13-14]、抗阿爾茨海默癥[15-16]等藥理作用,在食品、農(nóng)業(yè)、制藥和化妝品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。

花青素和原花青素的生物合成都是通過苯丙烷途徑完成的[17-18]。其合成相關(guān)的早期合成基因(EBGs)和晚期合成基因(LBGs)均在矮牽牛[19]、擬南芥[20]、玉米[21]及其他物種中鑒定出來。這些結(jié)構(gòu)基因的表達受到MYB-bHLH-WD40(MBW)復(fù)合體的調(diào)控,MBW由轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH和WD40組成[22]。在擬南芥中,R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子AtPAP1、AtPAP2、AtMYB113、AtMYB114等與花青素合成相關(guān)[23],而AtTT2、AtMYB5則與原花青素合成相關(guān)[24]。香雪蘭(Freesiahybrida)FhMYB5在煙草和擬南芥中過表達,可顯著上調(diào)參與類黃酮合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達,促進花青素和原花青素的合成[18]。葡萄(Vitisvinife)轉(zhuǎn)錄因子VvMYB5b在葡萄果實發(fā)育中正向調(diào)控花青素和原花青素的的生物合成[25]。

課題組前期在西伯利亞白刺紅果和黑果果皮轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn),NsMYB5與FhMYB5和AtMYB5等與花青素和原花青素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子處于同一進化支,但其功能未知。本試驗對該基因進行了分離克隆、生物信息學分析及功能驗證,研究其對花青素和原花青素合成的調(diào)控作用,以期為西伯利亞白刺果實果皮呈色的分子機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.2 白刺果實RNA提取及cDNA制備

采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)(天根生化科技(北京)有限公司)對西伯利亞白刺紅果、黑果進行總RNA提取,用濃度測定儀Nanodro測定濃度,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKara)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3 PCR擴增

表1 引物名稱、序列及用途

1.4 生物信息學分析

通過MEGA 5.10用Neighbour-joining法構(gòu)建NsMYB5的系統(tǒng)進化樹。利用網(wǎng)站http://www.ebi.ac.uk/interpro分析結(jié)構(gòu)域,Vector NTI 10用于序列拼接和比對。

1.5 植物表達載體構(gòu)建

以Pc2300S為載體,使用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XbaⅠ構(gòu)建植物過表達載體Pc2300S:NsMYB5。利用液氮凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞LBA4404,在含有抗性(100 mg/L卡那霉素、100 mg/L利福平)的LB固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48 h后挑取單克隆,菌落PCR鑒定,挑取陽性單克隆在LB液體培養(yǎng)基(100 mg/L卡那霉素、100 mg/L利福平)中于28 ℃、200 r/min條件下?lián)u菌48 h,OD值為0.8時,采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草[26]。MS培養(yǎng)基為卡那霉素抗性(100 mg/L)。采用DNAsecure Plant Kit新型植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(天根生化科技(北京)有限公司)提取T0代轉(zhuǎn)基因煙草葉片DNA,利用引物MYB5-F、MYB5-R進行PCR擴增篩選植株,確定陽性植株。

1.6 花青素和原花青素含量測定

花青素含量測定[18]:分別取轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草不同組織,加入甲醇溶液(1% HCl),避光條件下提取24 h,在530、657 nm處測定提取溶液的吸光度值(A530、A657),根據(jù)公式Q=(A530-0.25×A657)/M(Q為花青素含量,M為稱取的煙草質(zhì)量)計算花青素含量,3次生物學重復(fù)。

用香草醛-鹽酸法測定原花青素含量:參考孫蕓等[27]的方法,并略作改進。準確稱取兒茶素2.0 mg,去離子水溶解并定容至25 mL,配制濃度為0.016、0.032、0.048、0.064、0.08 mg/mL的兒茶素標準溶液,取兒茶素標準溶液1 mL,依次加入6 mL香草醛甲醇溶液(0.04 g/mL,現(xiàn)配現(xiàn)用),濃HCl 3 mL,充分混勻后于30 ℃水浴鍋避光靜置10 min,在500 nm 處測定吸光值,以標準溶液濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線,回歸方程為Y=2.913 7X-0.007 6,R2=0.995 8。

分別取轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的根、莖、葉和花,加入20 mL 50%乙醇溶液,于50 ℃超聲處理20 min,將料液4 000 r/min離心 10 min后取上清,即得原花青素提取液。具體 測定方法同上。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010、SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析及作圖,3次生物學重復(fù),取平均值±標準差,采用單因素 ANOVA 分析,顯著性水平設(shè)為 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 NsMYB5的克隆與序列特征

根據(jù)前期獲得的西伯利亞白刺紅果果皮和黑果果皮的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出的序列Cluster-8422.761,在黑果果皮中上調(diào)表達,log2FoldChange值為8.323 4,在NCBI上blast后,命名為NsMYB5。從西伯利亞白刺紅果、黑果中克隆獲得NsMYB5,其開放閱讀框(ORF)均為840 bp(圖1),存在2個堿基差異,編碼279個氨基酸,僅有1個氨基酸差異。氨基酸序列比對結(jié)果表明,NsMYB5具有與FhMYB5、AtMYB5、VvMYBA1和VvMYBPA1高度同源的R2、R3保守結(jié)構(gòu)域,具有完整的SANT、MYB domain及HLH-MYB domain結(jié)構(gòu)域,屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子(圖2-A)。系統(tǒng)進化樹(圖2-B)顯示,NsMYB5與同時調(diào)控花青素和原花青素合成的FhMYB5同源性最高,與調(diào)控原花青素合成相關(guān)的AtMYB5次之。

M.Marker; R.以紅果cDNA為模板的PCR產(chǎn)物; B.以黑果cDNA為模板的PCR產(chǎn)物

A. NsMYB5與其他植物參與原花青素合成的 R2R3-MYB 的氨基酸序列比對分析;B. NsMYB5與其他植物參與原花青素合成的 R2R3-MYB 的系統(tǒng)進化樹分析

2.2 NsMYB5基因植物過表達載體構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和XbaⅠ雙酶切Pc2300S載體,回收載體片段與目的基因,回收產(chǎn)物用T4連接酶于4 ℃過夜連接,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞LBA4404,菌落PCR結(jié)果如圖3所示,條帶大小為840 bp,與目的基因大小一致,表明目的條帶成功連接至Pc2300S載體上,測序驗證后,與目的條帶序列一致。表明Pc2300S:NsMYB5植物過表達載體構(gòu)建成功。

2.3 NsMYB5轉(zhuǎn)基因煙草鑒定及表型觀察

對10株T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株,提取基因組DNA后進行目的基因的PCR鑒定,其中,有3株煙草擴增到特異性目的條帶,與陽性對照條帶大小一致。與野生型煙草(WT)相比,轉(zhuǎn)基因植株的葉片和莖上僅有少量花青素積累,而在花瓣和雄蕊上則有大量花青素積累,呈深紫色(圖4)。

圖4 野生型煙草(WT)和 NsMYB5轉(zhuǎn)基因煙草莖、葉、花和雄蕊對比

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草葉片花青素和原花青素含量分析

對野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的花青素與原花青素含量進行測定,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉、花中花青素與原花青素含量均高于野生型煙草,轉(zhuǎn)基因煙草花中花青素與原花青素含量均最高,其含量約為野生型煙草的1.89倍和2.29倍(圖5和圖6)。結(jié)果表明,NsMYB5在煙草中有效表達,促進了花青素和原花青素的積累,初步推斷NsMYB5基因可以正向調(diào)控花青素和原花青素的合成。

**表示差異顯著(P<0.05),下同

圖6 不同組織部位原花青素含量

3 討論與結(jié)論

對西伯利亞白刺紅果、黑果果皮轉(zhuǎn)錄組進行數(shù)據(jù)分析,篩選到2個MYB轉(zhuǎn)錄因子可能與白刺果實花青素合成相關(guān)。其中,Cluster-8422.10600,命名為NsMYB1,經(jīng)功能驗證,可以正向調(diào)控花青素生物合成,賦予煙草紫色表型。而Cluster-8422.21912在紅果果皮中的FPKM值為 0.75,黑果果皮中FPKM值為222.12,log2Fold Change為8.323 4,說明其在黑果果皮中特異表達,命名為NsMYB5,但其功能尚未確定。本研究對西伯利亞白刺果皮顏色的分子機制進行了研究,首次分離出一種與西伯利亞白刺果皮花青素和原花青素合成相關(guān)的NsMYB5轉(zhuǎn)錄因子,并進行了功能驗證。

NsMYB5具有完整的SANT、MYB domain及HLH-MYB domain結(jié)構(gòu)域,屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子,可與bHLH轉(zhuǎn)錄因子互作[28],其可能與bHLH形成復(fù)合體在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起作用,NsMYB5具有與FhMYB5相同的C1保守基序(Lx3GIDPxTHKPL)[18](圖2-A)。本研究從紅果、黑果中分離的NsMYB5均為840 bp,存在2個堿基差異,編碼279個氨基酸,兩者僅存在1個氨基酸差異,且該差異氨基酸不在R2、R3保守結(jié)構(gòu)域內(nèi),推斷兩者具有相同的功能。系統(tǒng)進化樹表明,NsMYB5與FhMYB5、AtMYB5具有較高的同源性(圖2-B),AtMYB5與原花青素合成相關(guān)[29],FhMYB5可同時調(diào)控花青素與原花青素的合成[18]?；诎被嵝蛄泻拖到y(tǒng)進化樹結(jié)果,初步推斷NsMYB5可能是具有同時正向調(diào)控花青素與原花青素合成功能的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄 因子。

雌雄蕊顏色與花色有一定的相關(guān)性,花色淺的品種,雌雄蕊顏色也較淺,花色深的品種,雌雄蕊顏色也相應(yīng)加深[30]。與其他物種中和花青素合成相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子相比,黑果枸杞LrAN2[31]、蘋果MdMYB3[32]、胡蘿卜DcMYB113[33]、番茄SlMYB75[34]等在煙草中過表達后,轉(zhuǎn)基因株系中所有組織器官上均有花青素積累。而FhMYB5過表達后會同時促進花青素和原花青素合成,花青素主要積累在花瓣和雄蕊上[18]。葡萄VvMYB5a和VvMYB5b能夠激活類黃酮途徑的多個結(jié)構(gòu)基因,VvMYB5b過表達會使類黃酮合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因表達上調(diào),并促進花青素和原花青素的積累[27]。NsMYB5過表達后,花青素則主要積累在花瓣和雄蕊上,呈現(xiàn)深紫色,而在莖和葉片上僅有少量花青素積累,局部呈淡紫色(圖4)。該結(jié)果與FhMYB5、VvMYB5a和VvMYB5b的煙草過表達結(jié)果相似,說明NsMYB5與FhMYB5、VvMYB5a和VvMYB5b具有相似的功能,由此可以證實NsMYB5與煙草配子中花青素生物合成密切相關(guān),而高花青素含量的白刺黑果果皮中FPKM值已證實NsMYB5存在特異表達,因此通過模式植物煙草的過量表達驗證工作能夠推測NsMYB5與白刺黑果果皮中花青素、原花青素生物合成密不可分。

本研究從西伯利亞白刺果實中分離出調(diào)控花青素和原花青素合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子NsMYB5的CDS序列,該序列具有保守的R2、R3結(jié)構(gòu)域,與已進行功能驗證的調(diào)控花青素和原花青素合成的FhMYB5具有高度同源性。NsMYB5過表達能夠賦予煙草花和雄蕊深紫色,而葉片和莖上僅有少量花青素積累,局部呈現(xiàn)淡紫色,在花中,花青素和原花青素含量也顯著升高(P<0.05)。綜上所述,NsMYB5在花青素和原花青素合成過程中起重要的正向調(diào)控作用。