沈躍鵬

（開(kāi)封市農(nóng)林科學(xué)研究院 河南 開(kāi)封 475004）

利用小麥成熟胚作為外植體， 進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)與再生分化， 對(duì)于建立小麥高效遺傳轉(zhuǎn)化體系具有十分重要的意義。 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中具有十分重要的作用。 長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和劑量進(jìn)行了較多研究，一般認(rèn)為2,4-D 是小麥組織培養(yǎng)中起主導(dǎo)作用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，是影響組織再分化的關(guān)鍵因素，常用劑量為0.2～2.0 mg/L。 目前，在多種植物的胚性愈傷組織誘導(dǎo)中， 不同研究者通過(guò)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入不同濃度的2,4-D（或配合其他激素），均成功地誘導(dǎo)出了胚性愈傷組織，如枇杷[1]、荔枝[2]、枸杞[3]等。 關(guān)于小麥組織培養(yǎng)方面的研究也較多，已篩選出了多種含2,4-D 的培養(yǎng)基和材料[4-5]，但關(guān)于3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸在植物愈傷組織誘導(dǎo)及再生效果方面的研究較少。 為建立小麥穩(wěn)定高效再生體系， 探索2,4-D和3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸對(duì)小麥成熟胚出愈率和胚性愈傷率的影響，2022 年本文作者以MS 為基本培養(yǎng)基分別添加脯胺酸、 水解酪蛋白和不同劑量的2,4-D 或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸，形成多種試驗(yàn)培養(yǎng)基，由此開(kāi)展了本次研究。

1 材料與方法

1.1 小麥成熟胚

試驗(yàn)選用開(kāi)麥18、開(kāi)麥20、開(kāi)麥22 等3 個(gè)小麥品種的成熟胚。

1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基

以MS 為基本培養(yǎng)基分別添加脯胺酸、水解酪蛋白和3 個(gè)劑量水平的2,4-D 或3, 6-二氯-2-甲氧基苯甲酸，形成S 和M2 類(lèi)8 種試驗(yàn)培養(yǎng)基（表1）。

表1 不同試驗(yàn)培養(yǎng)基的組成

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 出愈率的計(jì)算 分別取開(kāi)麥18、 開(kāi)麥20、開(kāi)麥22 等3 個(gè)品種大小一致的種子用75%的乙醇浸泡3～5 min， 然后用無(wú)菌水沖洗3～4 次， 用0.1%的HgCl2（W/W）消毒15～20 min，然后再用無(wú)菌水沖洗3～4 次，放入33℃的無(wú)菌水中浸泡3～5 h；用滅過(guò)菌的解剖刀剝出胚，盾片向上，分別置于8 種試驗(yàn)培養(yǎng)基上，在26℃暗室中培養(yǎng)。 3 個(gè)品種分別在每種培養(yǎng)基中重復(fù)培養(yǎng)3 次， 各重復(fù)均用40 粒成熟胚。 15 d后調(diào)查計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率，即出愈率。

1.3.2 胚性愈傷率的計(jì)算 把誘導(dǎo)15 d 的愈傷組織切分成兩半，接種于繼代培養(yǎng)基，采用16 h 光照、8 h黑暗光周期（光照度1 750～2 200 lx）。 在光下出現(xiàn)綠色的愈傷組織視為胚性愈傷組織。 培養(yǎng)20 d 時(shí)調(diào)查計(jì)算胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，即胚性愈傷率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析利用Excel 2010 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

培養(yǎng)基是植物成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其構(gòu)成顯著影響到愈傷組織的誘導(dǎo)效果（表2）。由表3、表4 可知，出愈率和胚性愈傷率在不同培養(yǎng)基間的差異和品種間的差異均達(dá)極顯著水平， 而培養(yǎng)基×品種的互作均未達(dá)到顯著水平。 可見(jiàn)，不同培養(yǎng)基對(duì)小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)存在極顯著差異， 不同品種小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)效果也存在極顯著的差異， 但培養(yǎng)基和品種對(duì)誘導(dǎo)效果的影響相對(duì)獨(dú)立。 為了解析培養(yǎng)基構(gòu)成對(duì)誘導(dǎo)效果的影響，設(shè)計(jì)一組正交比較（表5）方法，進(jìn)行單個(gè)自由度的方差分析。

表2 不同試驗(yàn)培養(yǎng)基的平均出愈率和平均胚性愈傷率

表3 不同試驗(yàn)培養(yǎng)基與各品種出愈率的方差分析

表4 不同培養(yǎng)基與各品種胚性愈傷率的方差分析

表5 試驗(yàn)培養(yǎng)基分組比較的正交系數(shù)和平均差數(shù)

2.1 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)小麥成熟胚愈傷組織出愈率的影響

由表2、表3 和表5 可知，①添加脯氨酸和水解酪蛋白對(duì)出愈率影響不顯著；②添加脯氨酸、水解酪蛋白時(shí)，含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類(lèi)培養(yǎng)基比含有2,4-D 的S 類(lèi)培養(yǎng)基的出愈率高3.89%，達(dá)到極顯著水平；③不加脯氨酸和水解酪蛋白時(shí)，M 類(lèi)培養(yǎng)基較S 類(lèi)培養(yǎng)基的出愈率高1.94%， 提高不顯著； ④對(duì)于M 類(lèi)培養(yǎng)基，3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸劑量為4 mg/L 的出愈率比2 mg/L 的高7.36%，達(dá)極顯著水平；2 mg/L 的出愈率比1 mg/L 的出愈率高4.72%，未達(dá)顯著水平；⑤對(duì)于S 類(lèi)培養(yǎng)基，2,4-D 劑量為4 mg/L 的出愈率比2 mg/L 的出愈率高9.86%，達(dá)極顯著水平， 2 mg/L 的出愈率比1 mg/L 的出愈率高5.28%， 達(dá)顯著水平。 由此可見(jiàn)， 添加脯氨酸和水解酪蛋白對(duì)小麥成熟胚愈傷組織的出愈率影響不顯著， 但添加脯氨酸和水解酪蛋白時(shí)使用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的出愈率極顯著高于使用2,4-D 的，在本試驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)，兩種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)小麥愈傷組織的出愈率的誘導(dǎo)效果均以高劑量為優(yōu)。

對(duì)8 種試驗(yàn)培養(yǎng)基的出愈率進(jìn)行多重比較（表6）表明，M4 培養(yǎng)基的出愈率最高，為88.89%，但與S4和M2 的出愈率86.67%和83.89%相比差異不顯著，而顯著高于M0， 極顯著地高于S0、S2、M1 和S1；S4培養(yǎng)基的出愈率與M2 和M0 差異不顯著，但顯著高于S0 和S2，極顯著高于M1 和S1；M2、M0、S0、S2 和M1 這5 種培養(yǎng)基的出愈率差異不顯著，但前四者均顯著或極顯著高于S1，而M1 和S1 差異不顯著。 由此可見(jiàn)，隨著生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑劑量水平的提高，出愈率增高；在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的劑量相同時(shí)，含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類(lèi)試驗(yàn)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果優(yōu)于含有2,4-D 的S 類(lèi)試驗(yàn)培養(yǎng)基。

表6 不同試驗(yàn)培養(yǎng)基的出愈率差異顯著性比較

2.2 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)小麥成熟胚愈傷組織胚性愈傷率的影響

由表2、表4 和表5 可知，①添加脯氨酸和水解酪蛋白的培養(yǎng)基的平均胚性愈傷率為13.19%， 比沒(méi)有添加脯氨酸和水解酪蛋白的增加了4.31%，達(dá)極顯著水平；②添加脯氨酸和水解酪蛋白時(shí)，含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類(lèi)培養(yǎng)基的胚性愈傷率比含有2,4-D 的S 類(lèi)培養(yǎng)基高1.76%， 達(dá)極顯著水平；③不添加脯氨酸和水解酪蛋白時(shí)，含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類(lèi)培養(yǎng)基與含有2,4-D 的S 類(lèi)培養(yǎng)基的平均胚性愈傷率分別為8.61%、9.17%，差異未達(dá)顯著水平；④對(duì)于含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類(lèi)培養(yǎng)基，3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸劑量為4 mg/L 的胚性愈傷率比1 mg/L 或2 mg/L 的低1.94%，接近顯著水平，2 mg/L 的胚性愈傷率比1 mg/L 的高2.22%，也接近顯著水平；⑤對(duì)于含有2,4-D 的S 類(lèi)基本培養(yǎng)基，2,4-D 劑量為4 mg/L 的胚性愈傷率比1 mg/L 或2 mg/L 的低0.97%，差異不顯著，2 mg/L 的胚性愈傷率比1 mg/L 的高2.51%，達(dá)顯著水平。 綜上所述，添加脯氨酸和水解酪蛋白可以極顯著提高胚性愈傷率，在此前提下，使用3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸顯著優(yōu)于使用2,4-D。 本試驗(yàn)表明，以MS 為基本培養(yǎng)基，附加脯氨酸和水解酪蛋白各500 mg/L 和2 mg/L的3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的胚性愈傷率最高。

對(duì)胚性愈傷率進(jìn)行多重比較（表7）表明，培養(yǎng)基M2、S2 和M1 的胚性愈傷率位居前3 位， 分別為15.83%、13.89%和13.61%， 三者間差異不顯著；S2、M1、M4、S4、S1 這5 個(gè)試驗(yàn)培養(yǎng)基的胚性愈傷率差異不顯著， 但前四者顯著或極顯著地高于S0 和M0；S1、S0 差異不顯著，但二者顯著高于M0。 由此可見(jiàn)，兩種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的劑量為2 mg/L 的試驗(yàn)培養(yǎng)基的胚性愈傷率高于其他劑量的試驗(yàn)培養(yǎng)基； 含有3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的M 類(lèi)試驗(yàn)培養(yǎng)基優(yōu)于含有2,4-D 的S 類(lèi)試驗(yàn)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加脯氨酸和水解酪蛋白可顯著提高胚性愈傷率。

表7 不同培養(yǎng)基的出愈率和胚性愈傷率差異顯著性比較

2.3 不同品種間的小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)效果

如上所述， 出愈率和胚性愈傷率的品種間差異均達(dá)極顯著水平，開(kāi)麥18、開(kāi)麥20、開(kāi)麥22 等3 個(gè)品種的愈傷組織出愈率分別為88.23%、80.63%、76.88%， 胚性愈傷率分別達(dá)到14.69%、11.25%和10.41%（表2）， 可見(jiàn)開(kāi)麥18 成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)效果最好。

3 討論與結(jié)論

培養(yǎng)基的成分是影響誘導(dǎo)率和愈傷組織質(zhì)量的主要因素之一，不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果有很大差異。出愈率低可以通過(guò)增加接種成熟胚量來(lái)彌補(bǔ)從而獲取大量的愈傷組織， 而愈傷組織質(zhì)量是決定高效培養(yǎng)體系的關(guān)鍵。 所以應(yīng)把胚性愈傷率作為衡量培養(yǎng)基好壞的重要指標(biāo)。

本研究以MS 為基本培養(yǎng)基，通過(guò)分別添加脯胺酸、 水解酪蛋白和不同劑量的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2,4-D 或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸，形成8 種試驗(yàn)培養(yǎng)基，研究開(kāi)麥18 等3 個(gè)品種成熟胚的出愈率和胚性愈傷率。 結(jié)果表明，出愈率和胚性愈傷率在不同培養(yǎng)基間的差異和品種間的差異均達(dá)極顯著水平，而培養(yǎng)基×品種的互作差異不顯著；在MS 基本培養(yǎng)基上添加脯氨酸和水解酪蛋白可極顯著地提高小麥成熟胚愈傷組織的胚性愈傷率，但對(duì)出愈率影響不顯著；在此基礎(chǔ)上， 添加3, 6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的出愈率和胚性愈傷率比2,4-D 分別高3.89%和4.31%，均達(dá)極顯著水平；對(duì)于出愈率以高劑量為佳，胚性愈傷率以2 mg/L 為宜。 由此可見(jiàn)，3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸對(duì)小麥成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)效果優(yōu)于2,4-D，且以劑量為2 mg/L 為宜； 脯氨酸和水解酪蛋白可顯著提高小麥成熟胚愈傷組織的胚性愈傷率， 對(duì)出愈率無(wú)顯著影響。這與付風(fēng)玲[6]等適量的L-脯氨酸和水解酪蛋白具有提高胚性愈傷率的作用的研究結(jié)果一致。綜合出愈率和胚性愈傷率試驗(yàn)結(jié)果表明，M2 培養(yǎng)基為小麥愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基。