牛荷

6月28日，基因編輯領域備受矚目的張鋒團隊在《自然》雜志發(fā)文稱，在真核生物中首次發(fā)現(xiàn)了“基因剪刀”。張鋒是美國麻省理工學院和哈佛大學博德研究所的核心成員之一，也是麻省理工學院麥戈文腦研究所的研究員。基因編輯可通過對基因組序列的精確修飾，為疾病治療提供新的精準療法。

張鋒團隊稱，研究人員在真核生物中發(fā)現(xiàn)了第一個RNA引導的DNA切割酶——Fanzor蛋白，該蛋白質在真核生物中普遍存在。真核生物包括真菌、植物和動物。這也意味著，RNA引導的DNA切割機制存在于所有生命體中。更重要的是，這一新“剪刀”可以被優(yōu)化，實現(xiàn)對人類基因組的編輯。

7月1日，美國國家科學院和工程院院士、哈佛醫(yī)學院遺傳學系教授喬治·丘奇接受《中國新聞周刊》采訪時表示，F(xiàn)anzor很難擊敗處于最好情況下的CRISPR/Cas9，后者基因編輯效率已經(jīng)接近100％。不過，當處于最糟糕細胞類型和基因組位點組合的情況下，F(xiàn)anzor存在擊敗CRISPR/Cas9的可能性。喬治·丘奇被譽為基因組學之父，獲2016年諾貝爾化學獎提名，曾是張鋒的博士后導師。

更多真核生物“基因剪刀”或被發(fā)現(xiàn)

如今最廣泛使用的“基因剪刀”CRISPR/Cas存在于原核生物中，原核生物主要指細菌。2012年，法國科學家埃馬紐爾·夏彭蒂耶和美國科學家詹妮弗·杜德納在《科學》雜志發(fā)文并首次指出，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體外能“定點”對DNA切割，CRISPR在活細胞中有修改基因的能力。此后，科學家們一直想知道真核生物中是否存在類似系統(tǒng)，這也推動了Fanzor系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物的一種天然免疫系統(tǒng)。某些細菌遭到病毒入侵后，能夠把病毒基因的一小段存儲到自身DNA里，這一存儲空間被稱為CRISPR。病毒再次入侵時，細菌能根據(jù)存寫的片段識別病毒，用“基因魔剪”將病毒的DNA切斷。CRISPR，即成簇規(guī)律間隔短回文重復序列。Cas蛋白是一種核酸內切酶，對目的基因進行剪切，如Cas9和Cas12。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是研究最深入、技術最成熟、應用最廣泛的類別。

2021年9月，張鋒團隊在《科學》雜志發(fā)表一項研究，重建了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的進化起源。該研究在細菌中鑒定出一類新的核酸酶，屬于RNA引導核酸酶，經(jīng)過設計，可用于在人類細胞中編輯基因。這類新的核酸酶被命名為“OMEGA”，這其中包括一種名為TnpB的核酸酶。該研究推測TnpB或是Cas12的祖先。

張鋒團隊6月28日最新的研究表明，TnpB也可能是真核蛋白Fanzor的祖先，推測Fanzor酶也可能具有基因編輯能力。早在2013年，發(fā)表在《移動DNA》上的一篇研究指出，這兩種蛋白有著某些共同點，并推測這些共同點對基因表達調控和天然化合物的合成，起至關重要的作用。

張鋒團隊的最新研究中，研究人員通過從真菌、藻類、變形蟲等不同物種中分離出Fanzor蛋白，觀察發(fā)現(xiàn)其與TnpB蛋白、Cas12有相似結構。研究人員認為，“緊湊的Fanzor系統(tǒng)”比CRISPR/Cas系統(tǒng)更容易用于特定細胞和組織。通過提高靶向效率，這些Fanzor系統(tǒng)可成為編輯人類基因組的工具。

上?？萍即髮W生命科學與技術學院教授、基因編輯中心主任陳佳告訴《中國新聞周刊》，這項研究發(fā)現(xiàn)了目前廣泛應用的CRISPR/Cas系統(tǒng)之外的一種新基因編輯系統(tǒng)。研究主要亮點在于，首次在真核生物中發(fā)現(xiàn)RNA介導的基因編輯系統(tǒng)，而真核細胞和人體細胞結構更接近。在陳佳看來，后續(xù)基因編輯的研究可能也會朝著這一方向開展。Fanzor屬于真核生物中第一代“剪刀”，后續(xù)二代、三代應該也會很快被開發(fā)出來。

“這項研究為基因編輯提供一種新的備選方案，是該領域一項重要進步?！比A中農大動物醫(yī)學院教授張安定告訴《中國新聞周刊》，2012年在細菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)具有里程碑意義，相當于找到了細菌防御系統(tǒng)和新型基因編輯工具，張鋒團隊在其中也作出重要貢獻。隨后他們開始尋找防御系統(tǒng)的源頭，現(xiàn)這一防御系統(tǒng)擴大到了真核生物，這是比較大的突破。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)起作用的部分包括Cas9和負責在基因組上精確定位的向導RNA。通俗講，Cas9和向導RNA就像一把“剪刀”和一把“尺子”，“尺子”負責在基因組上精準找到需要編輯的位置，“剪刀”對基因組剪切。完成目標基因的剪切編輯之后，“剪刀”和“尺子”都會被細胞完全清除掉。

任何一種基因編輯技術，靶位點的選擇都是首要問題。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，剪切點只有位于處于特定位置的PAM序列的上游，才能夠被準確識別和切割?！癈as酶切割DNA需要找到PAM序列，F(xiàn)anzor蛋白實現(xiàn)DNA切割，也需要找到一段特定的TAM序列。從這點來看，兩者比較相似，因為切割偏好的序列不同，也存在序列互補性。”陳佳說。

能替代CRISPR/Cas“魔剪”嗎？

前述最新研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)，在所檢測的4種Fanzor蛋白中，有3種蛋白對特定DNA序列編輯的效率達到11.8％。這一水平與早期版本CRISPR系統(tǒng)相當，但低于優(yōu)化過后的CRISPR系統(tǒng)。之后，通過工程化技術，研究人員在Fanzor蛋白中引入了特定突變，使其活性增加約10倍。

陳佳告訴《中國新聞周刊》，從2012年CRISPR系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)至今，全球很多實驗室在CRISPR/Cas系統(tǒng)的優(yōu)化和改造方面投入巨大。即便在這項工作中Fanzor的編輯效率較其初始狀態(tài)提高了10倍，但還是達不到CRISPR/Cas9目前的編輯效率。不過，F(xiàn)anzor有其自身優(yōu)勢，與CRISPR蛋白不同，F(xiàn)anzor本身源自真核系統(tǒng)，有可能在臨床治療中能避免非必要的免疫反應。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)較成熟，F(xiàn)anzor未來通過優(yōu)化，也可能實現(xiàn)更精準高效的切割。

與某些CRISPR系統(tǒng)和TnpB蛋白不同，研究人員觀察到，真菌衍生的Fanzor蛋白不表現(xiàn)出“附帶活性”。附帶活性是指當RNA引導的“剪刀”靶向切割DNA時，會同時降解鄰近的DNA或RNA。因此，F(xiàn)anzor蛋白被視為更具專一性。

近日，張鋒接受外媒采訪時表示，F(xiàn)anzor蛋白的尺寸較小，含有400～700個氨基酸不等。CRISPR中最常用的Cas9蛋白約含1000～1600個氨基酸?！熬庉嬈髟酱?，遞送到體內就越困難?！彼f。據(jù)2021年9月張鋒團隊在《科學》雜志的研究，被稱為“OMEGA”的一類核酸酶很小，約為Cas9的30％，它們可能更容易被遞送到細胞中。

張鋒。圖/博德研究所

在陳佳看來，很多基因編輯系統(tǒng)在實驗室水平效果不錯，但進展到人體臨床試驗水平，編輯效率不一定高，出現(xiàn)這種問題的主要原因在于遞送過程。在CRISPR系統(tǒng)對基因進行編輯時，需要通過載體將這些大蛋白遞送到體內準確位置才能發(fā)揮作用。相較Cas9，F(xiàn)anzor蛋白體積小，在遞送過程中更靈活、便利。

在張安定看來，選擇怎樣的基因編輯工具，取決于實際應用的目的，基因編輯效率和脫靶是重要的考慮因素。雖然CRISPR/Cas系統(tǒng)已被廣泛使用，但它并非“包打天下”，其在有些細胞中的效率并不高，且存在脫靶等安全隱患。Fanzor蛋白更小，可能在一定場景下使用時更有優(yōu)勢?！把芯恐袥]有提到Fanzor蛋白是否能避免潛在的脫靶等問題，但也可能和Cas一樣，需要通過后續(xù)研究進一步提高基因編輯活性和減少潛在脫靶等問題?！彼f。

“到目前為止，還沒有出現(xiàn)超越CRISPR的技術。Fanzor想在應用上取代CRISPR/Cas系統(tǒng)，還有很長的路要走?！敝袊r業(yè)大學生物學院教授陳其軍告訴《中國新聞周刊》，盡管Fanzor系統(tǒng)在基因治療上存在遞送藥物優(yōu)勢，但如果編輯效率不高，靶點受太多限制，在醫(yī)療上的應用也很難超越CRISPR/Cas。

Fanzor蛋白冷凍電鏡結構示意圖。圖/張鋒實驗室

目前尚無CRISPR基因療法獲批

CRISPR基因編輯技術，無疑是目前生物技術領域最具革命性的突破之一。2020年，夏彭蒂耶和杜德納因發(fā)現(xiàn)“基因剪刀”CRISPR/Cas9，共同獲得當年的諾貝爾化學獎，獲獎時距離這項技術被發(fā)明還不到10年。

張鋒無緣諾獎，卻贏了專利之爭。2013年年初，張鋒等人首次將CRISPR/Cas9技術成功應用于哺乳動物和人類細胞的基因編輯。同年，丘奇在《科學》雜志上發(fā)表的研究也顯示，CRISPR系統(tǒng)可用于人類細胞基因組編輯。

這些進展極大推動了CRISPR/Cas9技術的推廣和應用。自2013年起，張鋒和前述兩名諾獎獲得者均基于該技術創(chuàng)立了多家公司。此后，張鋒與杜德納和夏彭蒂耶等人著名的專利權之爭拉開序幕。

2022年2月，美國專利和商標局裁定，張鋒團隊擁有在真核細胞中使用CRISPR基因編輯技術的專利。這意味著，張鋒和他所在的博德研究所在美國擁有CRISPR/Cas9技術應用于所有真核生物的專利，包括植物、動物和人類。這是CRISPR技術商業(yè)化最為核心的專利之一。

近年來，科學家們在CRISPR/Cas9治療疾病領域持續(xù)探索。2020年，四川大學華西醫(yī)院腫瘤科盧鈾團隊在《自然-醫(yī)學》發(fā)布Ⅰ期臨床試驗結果，表明用使用CRISPR/Cas9技術治療難治性非小細胞肺癌患者安全可行。

在陳佳看來，目前基因編輯治療在地中海貧血癥、鐮刀貧血癥等血液類遺傳病治療領域走得靠前，國內外已有幾項關鍵性治療管線進入臨床階段。此外，通用型CAR-T聯(lián)合基因編輯療法，目前研究進展也比較快。

2022年3月17日，國家藥監(jiān)局藥品審評中心官網(wǎng)顯示，南京北恒生物科技有限公司自主研發(fā)的細胞注射液產(chǎn)品獲得國家藥監(jiān)局的臨床試驗默示許可。該產(chǎn)品屬于通用型CAR-T，用于治療成人復發(fā)或難治性B細胞急性淋巴細胞白血病，是國內首個基于CRISPR基因編輯技術的免疫細胞治療產(chǎn)品。

丘奇告訴《中國新聞周刊》，F(xiàn)anzor的商業(yè)前景和其他數(shù)百種內切酶相似。不過，F(xiàn)anzor距離真正商業(yè)化應用，似乎還有很遠。因為即便是已有不少臨床研究進展的CRISPR/Cas技術，目前獲批的相關基因療法數(shù)目仍為0。

“迄今為止，已獲美國食品和藥物管理局（FDA）批準的基因療法共有12種，均不涉及CRISPR?！鼻鹌姹硎荆@種情況將在2023年12月8日改變，目前有一種CRISPR相關的基因療法處于生物制劑許可申請（BLA）階段。一般藥物的Ⅲ期臨床試驗結束，被驗證安全性、有效性之后，可以正式向FDA提交BLA申請。

6月8日，美國食品和藥物管理局（FDA）宣布，接受名為exa-cel療法的生物制品許可申請。該療法由美國福泰制藥與瑞士基因編輯公司CRISPR Therapeutics合作開發(fā)，用于治療嚴重鐮狀細胞病和輸血依賴性β地中海貧血，能夠幫助患者有效擺脫輸血和血管阻塞危機。美國福泰制藥當日發(fā)表的新聞稿稱，“這種療法有望成為第一個獲得批準的CRISPR基因編輯療法?！盋RISPR Therapeutics的創(chuàng)始人正是2020年憑借CRISPR基因編輯獲得諾貝爾化學獎的夏彭蒂耶。

為何真正能走向獲批的CRISPR基因療法很少？丘奇解釋，CRISPR主要用于“減法”，即對目標基因完成剪切、編輯。他表示，一般遺傳性血管性水腫等顯性疾病可以通過減少突變等位基因來治療，但這種情況非常罕見。疾病治療時通常需要“加法”，比如，所有的衰老基因療法都是添加基因，很多情況下，疫苗制備要添加一個或多個外源基因。

“基因編輯的工具箱越大，可選方式越多，對科學研究和臨床治療的幫助就越大?！标惣驯硎尽Ｔ谒磥?，如果后續(xù)僅把Fanzor用作內切酶進行基因編輯治療，也會面臨和CRISPR/Cas9一樣的風險；如果將Fanzor作為平臺開發(fā)新型的堿基編輯器等，可能實現(xiàn)更安全的基因編輯治療。

堿基編輯系統(tǒng)可以實現(xiàn)單核苷酸精度的DNA或RNA編輯。6月27日，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞等發(fā)表在《細胞》雜志的一項研究，運用AI輔助結構預測，開發(fā)了一系列新型堿基編輯工具，在小鼠細胞系中成功獲得高達43.1％的編輯效率，解決了常規(guī)堿基編輯器過大而無法被遞送的難題。

在丘奇看來，基于Fanzor系統(tǒng)的基因編輯療法未來也可能會獲FDA批準上市。“但許多天然存在或人工合成的新RNA可編程系統(tǒng)占比不大，相對應地，簡單的添加性基因治療方法正在迅速發(fā)展?！鼻鹌姹硎尽?/p>