劉思桐，何平有*，邱貞娜，劉青濤，張小飛，吳雅清，郁宏偉，劉 浩

（1.瑞普保定生物藥業(yè)有限公司，河北保定 071000；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇南京 210014）

目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)獸用活疫苗產(chǎn)品的凍干保護(hù)劑主要成分為脫脂牛奶、蔗糖、明膠等，保護(hù)劑配制簡(jiǎn)便，溫度對(duì)抗原影響較大，在疫苗生產(chǎn)運(yùn)輸過程中難以持續(xù)保證達(dá)到疫苗所需冷鏈保存溫度，導(dǎo)致溫度升高，造成疫苗效力降低。應(yīng)用耐熱保護(hù)劑可降低活疫苗保存條件要求，從-15℃以下冷凍保存提升至2～8℃冷藏保存，國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)的獸用疫苗保護(hù)劑的研制相對(duì)滯后，使疫苗的長(zhǎng)期保存和遠(yuǎn)途運(yùn)輸受到限制[1-3]。

凍干活疫苗生產(chǎn)中抗原含量、耐熱保護(hù)劑配制、凍干曲線設(shè)計(jì)是凍干活疫苗成功的關(guān)鍵因素?，F(xiàn)有雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗37℃保存10d 抗原損失在0.5 個(gè)滴度以上，耐熱試驗(yàn)抗原損失較大[4]，不利于疫苗的長(zhǎng)期保存與運(yùn)輸?，F(xiàn)有凍干工藝凍干時(shí)長(zhǎng)45h，凍干能耗較大。為降低抗原損失及能耗，本次試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)6 組耐熱保護(hù)劑配方，篩選出對(duì)雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗病抗原保護(hù)效果最佳的耐熱保護(hù)劑配方，并對(duì)凍干曲線進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，獲得理想的凍干曲線，提高疫苗生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 制苗用毒液

雞新城疫La Sota 株雞胚液、雞傳染性支氣管炎病毒H120 株雞胚液，均由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司按照《獸用生物制品規(guī)程》 制備。

1.1.2 無特定病原雞胚

無特定病原種蛋購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。無特定病原雞胚由無特定病原種蛋自行孵化至適用日齡備用。

1.1.3 主要試劑

明膠、甘露醇、聚乙烯基吡咯烷酮購(gòu)自SIGMA；山梨醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、蔗糖均購(gòu)自北京益利；水解乳蛋白，購(gòu)自海克??；海藻糖，購(gòu)自南寧中諾生物科技有限公司；硫脲、半胱氨酸和維生素C 等購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器

東富龍冷凍真空干燥機(jī)，蘇凈安泰超凈工作臺(tái)，孵化器，漩渦振蕩器等。

1.2 方法

1.2.1 耐熱保護(hù)劑

（1）耐熱保護(hù)劑配制

參照文獻(xiàn)[5～7]，自行設(shè)計(jì)篩選出凍干保護(hù)效果較好的物質(zhì)，如蔗糖、海藻糖、甘露醇、聚乙烯基吡咯烷酮、山梨醇等，將上述幾種物質(zhì)通過正交設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行耐熱保護(hù)劑的組方。

組分A：明膠、磷酸二氫鉀、山梨醇等耐熱基質(zhì)按照配比去離子水溶解后高壓滅菌，共配制2 個(gè)組方。組分B：海藻糖、水解乳蛋白、維生素C 等適量去離子水溶解后過濾除菌，共配制3個(gè)組方。A、B 組方用前兩兩組合，共配制6 組配方，標(biāo)記為TR1～TR6。

（2）疫苗配制

將6 個(gè)組方分別與病毒混合液（新城疫La Sota 株∶傳染性支氣管炎H120 株=1∶0.4）按1∶1.4 比例混合均勻，定量分裝，真空冷凍干燥，制成疫苗，分別標(biāo)記為H1～H6。

（3）疫苗評(píng)價(jià)

按 《中華人民共和國(guó)獸藥典（2020 版）》 三部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行疫苗性狀檢查和病毒含量測(cè)定（包括凍干前、凍干后）。耐老化試驗(yàn)：取上述凍干疫苗3 瓶/ 樣品，置37℃放置10d，溶解后混合均勻進(jìn)行病毒含量測(cè)定。

1.2.2 凍干曲線優(yōu)化

（1）耐熱保護(hù)劑凍干參數(shù)測(cè)定

將篩選出的耐熱凍干保護(hù)劑與毒液按照1∶1.4 比例混合，測(cè)定混合液的共晶點(diǎn)和塌陷溫度。

共晶點(diǎn)檢測(cè)：將混合液以10℃/min 的速率由-50℃升溫至30℃，根據(jù)電阻和溫度曲線確定半成品疫苗的共晶點(diǎn)。

塌陷溫度檢測(cè)：混合液-55℃凍實(shí)后，真空度20Pa，以2℃/min 升溫。塌陷溫度為干燥、冷凍界面出現(xiàn)亮度變化時(shí)的溫度[9]。

（2）凍干曲線優(yōu)化

應(yīng)用優(yōu)選保護(hù)劑TR4 配制疫苗開展凍干試驗(yàn)，參照保護(hù)劑TR4 配制的半成品疫苗的共晶點(diǎn)和塌陷溫度，設(shè)計(jì)3 條凍干曲線，分別從預(yù)凍、一次干燥和二次干燥三個(gè)階段進(jìn)行凍干效果研究。并按照前述方法進(jìn)行疫苗性狀檢查、病毒含量測(cè)定（包括凍干前、凍干后）和耐老化試驗(yàn)測(cè)定。

凍干曲線1：疫苗常溫入箱，開啟凍干機(jī)進(jìn)入預(yù)凍階段，制品溫度到達(dá)-30℃保溫2h 確保制品全部?jī)鰧?shí)。2h 后抽真空升溫進(jìn)入一次干燥階段，20h 升溫至-10℃，維持8h，之后以2℃/h 升溫至6℃，繼續(xù)升溫至20℃保溫2h，二次干燥完成，壓塞出箱。

凍干曲線2：將凍干箱溫度最短時(shí)間降溫至-30℃后將分裝好的疫苗半成品快速入箱，制品溫度到達(dá)-30℃保溫2h 確保制品全部?jī)鰧?shí)。之后抽真空進(jìn)入一次干燥階段，8h 升溫至-8℃，維持6h，之后以2℃/h 升溫至8℃，繼續(xù)升溫至20℃保溫2h，二次干燥完成，壓塞出箱。

凍干曲線3：疫苗半成品常溫入箱，將板層溫度降至-5℃，維持1h，保證半成品表面形成薄層結(jié)晶，降低凍干箱壓力至0.2kPa，維持1h，之后降溫待凍干制品溫度達(dá)到-30℃保溫2h，2h 后抽真空升溫進(jìn)入一次干燥階段，8h 升溫至-8℃，維持6h，之后以2℃/h 升溫至8℃，繼續(xù)升溫至20℃保溫2h，壓塞出箱。

1.2.3 凍干曲線重復(fù)驗(yàn)證

取雞新城疫La Sota 株病毒液、雞傳染性支氣管炎病毒H120 株病毒液各3 批，按照1.2.1、1.2.2 試驗(yàn)方法優(yōu)選的保護(hù)劑配方TR4 和凍干曲線2 制備3 批疫苗，按照1.2.1（3）方法進(jìn)行疫苗性狀檢查、病毒含量測(cè)定（包括凍干前、凍干后）和耐老化試驗(yàn)測(cè)定，來驗(yàn)證優(yōu)選凍干工藝穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 不同保護(hù)劑配方疫苗評(píng)價(jià)結(jié)果

2.1.1 不同保護(hù)劑配方疫苗性狀檢測(cè)

從表1 看出H1～H6 疫苗凍干性狀均為海綿狀疏松團(tuán)塊，色澤均勻，易脫壁，加入稀釋液后H2～H6 疫苗迅速溶解，H1 疫苗溶解緩慢。

表1 疫苗性狀檢驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 不同保護(hù)劑配方疫苗病毒含量檢測(cè)及耐老化試驗(yàn)

從表2 可以看出不同保護(hù)劑配方疫苗，新城疫病毒效價(jià)為106.25-6.45EID50/ 羽份，其凍干損失為0.05～0.25 個(gè)滴度，雞傳染性支氣管炎病毒效價(jià)為104.24-4.5EID50/ 羽份，其凍干損失為0～0.26個(gè)滴度，從凍干損失上看H1～H6 疫苗均符合試驗(yàn)要求。

表2 病毒含量檢測(cè)及耐老化試驗(yàn)結(jié)果

由37℃10d 耐老化試驗(yàn)結(jié)果可以看出，H4疫苗耐老化試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果最優(yōu)，37℃放置10d，新城疫病毒效價(jià)損失0.16 個(gè)滴度，雞傳染性支氣管炎病毒效價(jià)損失0.22 個(gè)滴度。

由上述結(jié)果可知H4 疫苗耐老化試驗(yàn)抗原損失最小，故選用TR4 凍干保護(hù)劑配制疫苗進(jìn)行后續(xù)凍干曲線優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 凍干曲線優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 耐熱保護(hù)劑凍干參數(shù)測(cè)定結(jié)果

凍干參數(shù)測(cè)定為凍干曲線設(shè)計(jì)提供參考。凍干過程中預(yù)凍溫度須低于共晶點(diǎn)10℃左右，因此將預(yù)凍溫度設(shè)置為-30℃，且保持2h 以上，確保樣品凍實(shí)。原保護(hù)劑的塌陷溫度約為-22℃，由2.1 試驗(yàn)結(jié)果篩選出的TR4 凍干保護(hù)劑中添加海藻糖、聚乙烯基吡咯烷酮和甘露醇，由保護(hù)劑TR4 配制疫苗的塌陷溫度為-17.4℃，明顯提高制品的塌陷溫度，而一次干燥的效率與塌陷溫度呈正相關(guān)[9]，后續(xù)凍干曲線優(yōu)化試驗(yàn)可通過提升一次干燥溫度，縮短升溫時(shí)間從而提升一次干燥效率。

2.2.2 凍干曲線優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

從表3、4 可知，凍干曲線2 凍干時(shí)間最短，較凍干曲線1 縮短17h，較凍干曲線3 縮短2h，并且凍干性狀良好；凍干曲線3 疫苗產(chǎn)品性狀較差。凍干曲線2 疫苗雞新城疫病毒凍干損失0.14個(gè)滴度、雞傳染性支氣管炎病毒凍干損失0.24 個(gè)滴度，37℃放置10d 雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒效價(jià)損失均小于0.3 個(gè)滴度；從疫苗性狀、凍干時(shí)長(zhǎng)和病毒含量綜合比較分析TR4 疫苗優(yōu)選凍干曲線2。

表3 不同凍干曲線疫苗性狀檢驗(yàn)結(jié)果

表4 病毒含量及耐老化試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.3 凍干曲線重復(fù)驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果

由表5、6 可知，采用凍干保護(hù)劑TR4 和凍干曲線2 制備的3 批雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗性狀檢驗(yàn)均合格，疫苗凍干過程中，新城疫病毒效價(jià)損失均在0.19 個(gè)滴度以內(nèi)，雞傳染性支氣管炎病毒效價(jià)損失均在0.15 個(gè)滴度以內(nèi)。3 批疫苗37℃放置10d，雞新城疫、雞傳染性支氣管炎病毒效價(jià)損失均在0.3 個(gè)滴度以內(nèi)，證明該疫苗優(yōu)選凍干工藝穩(wěn)定。

表5 3 批疫苗凍干性狀檢驗(yàn)結(jié)果

表6 3 批疫苗病毒含量檢測(cè)及耐老化試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

應(yīng)用疫苗免疫預(yù)防是動(dòng)物疫病防控最有效的技術(shù)手段，選用合適的保護(hù)劑對(duì)疫苗的質(zhì)量及疫苗的運(yùn)輸保存提供了重要的保障[10]?，F(xiàn)有的雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗37℃保存10日抗原損失在1 個(gè)滴度以內(nèi)，抗原受溫度影響較大[4]，本次試驗(yàn)在原有基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展配方優(yōu)化，提升疫苗的穩(wěn)定性，同時(shí)開展凍干曲線優(yōu)化設(shè)計(jì)，降低生產(chǎn)能耗。

本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)了6 組不同的凍干保護(hù)劑配方，優(yōu)選的TR4 中含有海藻糖、聚乙烯基吡咯烷酮和甘露醇。海藻糖具有良好的抗冷凍脫水性能；聚乙烯基吡咯烷酮能提升玻璃轉(zhuǎn)化溫度并且抑蛋白變性，提高保護(hù)劑對(duì)病毒保護(hù)效果；甘露醇作為賦形劑，科學(xué)的用量能夠提升凍干毒液的塌陷溫度，使疫苗塌陷溫度由原保護(hù)劑-25.23℃提高至-17.41℃；制備的疫苗雞新城疫、雞傳染性支氣管炎凍干損失與耐老化試驗(yàn)損失均小于

0.3 個(gè)滴度，保護(hù)效果好。

優(yōu)選的凍干曲線2，預(yù)凍階段滿足制品溫度低于共晶點(diǎn)10℃左右，并且恒溫2h 保證制品完全凍實(shí)[11,12]；通過快速凍結(jié)制品縮短預(yù)凍時(shí)間，提高一次干燥溫度和干燥速率[13-15]，縮短一次干燥時(shí)間，將凍干時(shí)長(zhǎng)由45h 縮短至28h，總凍干時(shí)長(zhǎng)縮短了17h，并且保證了凍干效果。

用TR4 保護(hù)劑配制疫苗應(yīng)用凍干曲線2 凍干進(jìn)行了三次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，三次試驗(yàn)結(jié)果凍干性狀良好，雞新城疫、雞傳染性支氣管炎抗原損失與耐老化損失均小于0.3 個(gè)滴度，表明此次試驗(yàn)篩選出的凍干工藝安全穩(wěn)定可用于后續(xù)疫苗生產(chǎn)。

4 結(jié)論

本研究獲得雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)耐熱保護(hù)劑活疫苗的最佳凍干保護(hù)劑TR4，其凍干損失和耐熱損失均在0.3 個(gè)滴度以內(nèi)，有效保證疫苗質(zhì)量；本研究?jī)?yōu)選的雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)耐熱保護(hù)劑活疫苗最佳凍干曲線為凍干曲線2，在保證品質(zhì)的情況下凍干時(shí)長(zhǎng)較原凍干曲線減少17h，大大提高了生產(chǎn)效率。