彭正武 鄺國平 李植源 周小平 陳書揚 李振華 尹欣 馮少穎

(郴州市第一人民醫(yī)院,湖南 郴州 423000)

血管內皮生長因子(VEGF)在血管生長中起重要作用。 VEGF是迄今為止對內皮細胞最有效的選擇性促分裂原和血管生成因子,在血管生成過程中具有特異性刺激血管內皮細胞增殖的作用〔1〕。VEGF不僅是一種有效的血管生成和血管通透性誘導劑,而且還是一種內皮細胞特異性促分裂原,可促進內皮細胞增殖〔2〕。研究表明,多種生長因子參與了新血管的形成,包括表皮生長因子、腫瘤壞死因子-α、胰島素樣生長因子Ⅰ和Ⅱ及胰島素樣生長因子結合蛋白Ⅰ和Ⅱ。這些因子通過增強 VEGF及其受體分型(VEGFR1和VEGFR2)表達和產生來整體或部分調節(jié)新血管的形成〔3〕。本實驗研究血液和房水中VEGF、VEGFR1、VEGFR2和促紅細胞生成素(EPO)的表達水平。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年10月至2021年1月于郴州市第一人民醫(yī)院就診和住院的新生血管性青光眼(A組)、原發(fā)性青光眼(B組)、年齡相關性白內障患者(C組)各20例。納入標準:特殊眼科檢查:遠距和近距視力、裂隙燈顯微鏡、眼壓、眼底檢查、視野、光學相干斷層掃描(包括對診斷為青光眼患者的相關檢查)等。3組一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組血清及房水中VEGF、EPO水平比較

表1 3組一般資料

1.2樣本采集 (1)血清標本采集:早晨,空腹,采集立方靜脈血3～4 ml,置于試管中,低溫超速離心機分離,4 ℃離心。10 min(2 000 r/min)后,從試管中取出0.3～0.4 ml血清,置于無菌Ep管(0.5 ml)中,貼上序列號,-70 ℃超低濃度保存。(2)房水標本的采集:進入手術室后,患者平躺在手術臺上,清潔結膜囊,定期對布片消毒,選擇全身麻醉或球后麻醉。混合量為2%。將3.5 ml麻醉球注入利多卡因和 0.75% 丁哌卡因,戴上眼罩,用眼瞼擔架張開眼瞼。用帶有25號針頭的1 ml注射器從角膜緣作穿刺口進入前房,從正面取出0.15～0.20 ml的眼瞼角膜后,立即將其放入0.5 ml 無菌Ep管中,編號并存放在超低溫(-70 ℃)冰箱中。在收集房水樣本期間,必須小心不要損壞眼睛的虹膜、晶狀體或角膜內皮。

1.3VEGF水平檢測 (1)標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,在第一、第二孔中分別加標準品100 μl,然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50 μl,混勻;然后在第三和第四孔中先各取50 μl棄掉,再各取50 μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50 μl,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50 μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別取50 μl加到第九、第十孔中,再在第九、第十孔中分別加標準品稀釋液50 μl,混勻后從第九、第十孔中各取50 μl棄掉(稀釋后各孔加樣量均為50 μl,水平分別為900、600、300、150、75 pg/ml)。(2)加樣:分別設置待測的空白孔和樣孔。將待測樣品以1∶1的樣品比例加入含有待測稀釋劑的微量滴定板的待測樣品孔中,每孔加入25 μl。(3)溫育:將反應板的孔用玻璃紙膠帶封好后,在37 ℃恒溫烘箱中反應30 min。(4)配液:用蒸餾水將清洗液稀釋30倍,放置備用。(5)洗滌:小心撕下封口板上的透明膠紙,倒入液體,讓其旋干。將配制好的清洗液反復清洗5次,每次放置約30 s。(6)加酶:除空白孔外,每孔加酶標試劑50 μl。(7)溫育:將反應板的孔用玻璃紙膠帶封好后,在37 ℃恒溫烘箱中反應30 min。(8)洗滌:小心撕下封口板上的透明膠帶,倒入液體并甩干。將配制好的清洗液反復清洗5次,每次放置約30 s。(9)顯色:每孔加入顯色劑A和B 50 μl,輕輕搖晃混合,在37 ℃培養(yǎng)箱中避光反應15 min。(10)終止:每孔加入終止液50 μl,終止反應。此時,樣品將很快從藍色變?yōu)辄S色。(11)檢測:用酶標儀檢測450 nm處的吸光度(OD)值。

1.4EPO水平的檢測 (1)標準品稀釋加樣:將10孔標準品置于酶標包被板上,第1、2孔加入100 μl標準品,第1、2孔加入100 μl。加入50 μl 標準稀釋液并混合均勻。然后從第3和第4孔中取出50 μl并丟棄,將50 μl分別分入第5、第6、第5和第6孔。添加 50 μl 標準稀釋劑。攪拌均勻?；旌虾?分別從5和6孔中取出50 μl加入7和8孔中,然后從7和8孔中取出50 μl并先加入。將50 μl添加到孔9和10。將標準稀釋液分別放入第9、10孔,分別取第9、10孔50 μl,混勻棄去(稀釋后每孔體積為50 μl,濃度為36、24、12、6、3 IU/L)。(2)加樣:分別設置待測的空白孔和樣孔。在酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)包被板的進樣孔中加入20 μl樣品稀釋液,再加入30 μl樣品。將樣品稀釋劑和待測樣品分別以2∶3的比例加入樣品孔中。(3)孵育:將反應板的孔用玻璃紙膠帶封好后,在37 ℃恒溫烘箱中反應30 min。 (4)液體配制:用蒸餾水將清洗液稀釋30倍,放置備用。 (5)清洗:小心撕下封口板上的透明膠紙,倒入液體,讓其旋干。將配制好的清洗液反復清洗5次,每次放置約30 s。(6)加酶:除空白孔外,每孔加酶標試劑50 μl。(7)孵育:將反應板的孔用玻璃紙膠帶封好后,在37 ℃恒溫烘箱中反應30 min。(8)清洗:小心撕下封口板上的透明膠帶,倒入液體并甩干。將配制好的清洗液反復清洗5次,每次放置約30 s。(9)顯色:每孔加入顯色劑A和B 50 μl,輕輕搖晃混合,37 ℃避光反應15 min。(10)終止:每孔加入終止液50 μl,終止反應。此時,樣品將很快從藍色變?yōu)辄S色。 (11)檢測:用酶標儀檢測450 nm處OD值。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS14.0軟件進行單因素方差分析、配對樣本t檢驗、Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1繪制標準曲線 測量所有樣品OD值,并根據(jù)VEGF及EPO標準品含量和檢測到的相應OD450 nm值制作校準曲線。 見圖1、圖2。

圖1 VEGF標準曲線

圖2 EPO標準曲線

2.23組血清及房水中VEGF、EPO水平檢測 3組血清及房水中VEGF水平、房水中EPO水平差異有統(tǒng)計學意義,且A、B組以上各指標明顯高于C組(均P<0.001),3組血清EPO水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.33組血清VEGFR1、VEGFR2含量比較 A、B組血清VEGFR2含量均較C組明顯增加(均P<0.05);3組VEGFR1含量未見明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 3組血清VEGFR1、VEGFR2含量比較

2.4VEGF和EPO在新生血管性青光眼房水中相關性比較 在新生血管性青光眼房水中VEGF和EPO水平無明顯相關性(r=-0.182,P>0.05)。見圖3。

圖3 新生血管性青光眼組房水中VEGF和EPO的相關性

3 討 論

新生血管性青光眼是一種常見的繼發(fā)性青光眼,由虹膜表面和前房之間的角度處的新血管生長及小梁網(wǎng)附著在虹膜周圍組織上引起。眼壓升高。繼發(fā)性青光眼很常見〔4〕。新生血管性青光眼形成的病理過程是眼部缺血、缺氧或炎癥的反復刺激、前房和虹膜結締組織的生長及新血管的形成〔5〕。高血壓下視網(wǎng)膜缺血缺氧持續(xù)惡化,刺激新生血管形成,影響視神經和視覺功能,引起注意力不集中,嚴重影響生活質量〔6〕。該病常繼發(fā)于視網(wǎng)膜靜脈阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜缺血綜合征等疾病,其中新生血管性青光眼占增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變的1%～17%。主要原因是其與糖尿病視網(wǎng)膜病變有關〔7〕。血管性青光眼虹膜血管生成的病因尚不清楚,但多數(shù)學者認為是視網(wǎng)膜缺氧導致血管生成〔8〕。

在目前的研究中,新血管的形成和成熟是一個非常復雜的過程,需要調節(jié)多種不同的血管相關細胞因子。VEGF 及其受體參與血管生成的病理生理機制〔9〕。 研究表明,VEGF、VEGFR1和VEGFR2的共同特征是在催化結構域中存在酪氨酸激酶插入?yún)^(qū)。這種酪氨酸激酶的活性被受體-配體結合和受體自磷酸化激活。一個單元格中有許多單元格。酶和其他反應在細胞生長和分化中起重要作用,只有 VEGFR 參與內皮細胞增殖和血管生成〔10,11〕。本研究結果證實,房水中VEGF顯著增加在新生血管性青光眼產生機制中起著非常重要的作用〔12〕。生理條件下,VEGF、VEGFR1 和 VEGFR2 有助于維持血管完整性。缺血、缺氧等病理生理環(huán)境可能會迅速增加VEGF、VEGFR1和VEGFR2的表達,促進新血管的形成〔13〕。

目前的臨床應用和藥物研究表明,VEGF的抑制作用并不能完全阻止血管生成的過程,提示可能存在其他促進血管生成的因素〔14〕。VEGF、VEGFR1和VEGFR2是缺氧誘導血管生成的重要細胞因子。當身體缺氧時,身體不僅會激活低氧誘導因子(HIF)-1,還會上調VEGF基因的表達、EPO基因表達〔15〕。本研究結果說明,在青光眼發(fā)病后眼壓高的情況下,局部EPO水平升高可能與視盤灌注不足和組織缺血缺氧有關。視網(wǎng)膜局部組織中產生的EPO導致房水中EPO水平升高〔16〕。這一推理在缺血性誘導的視網(wǎng)膜新生血管形成的小鼠模型中得到證實。房水中EPO水平升高可能不是由于血-視網(wǎng)膜屏障的破壞,但不能排除可能存在其他控制眼中EPO水平的機制。近年來,對人體重要器官心臟和腎臟缺氧的研究表明,HIF-1在缺氧狀態(tài)下可以調節(jié)EPO、GAPDH、胰島素樣生長因子(IGF)-2等多個靶基因的表達。新生血管性青光眼房水中EPO水平升高可能與缺血缺氧眼組織視網(wǎng)膜中HIF-1表達升高有關。許多基因包括VEGF都參與了缺氧反應。酸性脫羧酶和糖酵解基因被誘導以增高局部EPO水平〔17〕。

后部或前部局部缺氧的廣泛受累是新生血管性青光眼的重要原因。研究表明,VEGF、VEGFR1、VEGFR2和EPO可能發(fā)揮更多作用,它在新生血管性青光眼形成的病理過程中起重要作用〔18〕。推測眼內VEGF、VEGFR1、VEGFR2、EPO升高可能與青光眼發(fā)病后組織缺血缺氧相關。高眼壓會產生局部組織,導致眼部缺血缺氧。缺氧是激活HIF-1的最重要因素。在缺氧誘導下,EPO是HIF-1識別的第一個靶點,血管生成的調控主要是由缺氧誘導的HIF-1過度表達引起的一系列變化〔19〕。研究表明,HIF-1可以直接調節(jié)VEGF、VEGFR1、VEGFR2和EPO表達。在缺血缺氧條件下,HIF-1容易被激活,分泌組織EPO增加,促進紅細胞分化成熟。同時,VEGF、VEGFR1和VEGFR2水平上調并促進形成〔20〕血管內皮組織。

綜上,血管性青光眼患者VEGF、VEGFR2和EPO局部水平升高,但EPO與虹膜血管生成無明顯相關性。