彭嘉屹,李堯,張孟雨,王清清,鐘青萍

(廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,廣東 廣州,510642)

乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外環(huán)境中或結(jié)合在菌體表面的一類糖類化合物[1]。乳酸菌產(chǎn)生的EPS能夠改變發(fā)酵產(chǎn)品的外觀、流變特性、質(zhì)地和口感,因此它們可作為增黏劑、穩(wěn)定劑、乳化劑或膠凝劑運(yùn)用到食品工業(yè)中,其還可作為生物絮凝劑、生物吸收劑、離子交換樹脂和重金屬去除劑用于化妝品、制藥行業(yè)和環(huán)境保護(hù)[2-3]。由于乳酸菌生產(chǎn)的生物聚合物不會(huì)對(duì)健康造成危害,通常被認(rèn)為是安全的[4]。越來越多的研究表明乳酸菌EPS在改善人類健康中具有多種功能作用,包括免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗氧化、抗?jié)?、預(yù)防病原菌的生物被膜黏附、降血糖、降膽固醇和抗高血壓等[5-8]。

航天誘變技術(shù)是利用搭載衛(wèi)星、火箭等返回式航天器將菌株搭載到宇宙空間中,使其在太空因子的作用下,如強(qiáng)輻射、微重力、高真空、交變磁場(chǎng)、超凈環(huán)境等來改變菌株自身的基因,使得菌株的遺傳性狀發(fā)生改變,從而獲得有益突變,再對(duì)其進(jìn)行深入研究,進(jìn)行新產(chǎn)品的開發(fā)利用[9]。近年來,我國利用航天誘變技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行誘變,得到了許多性狀優(yōu)良的菌株。因此,利用航天誘變技術(shù)獲得菌株新特性具備較高的可行性[10-11]。

前期實(shí)驗(yàn)中通過航天誘變篩選出一株具有較好活性的腸膜明串珠菌L21-49,基于此,本研究首先采用離子交換層析和分子篩層析對(duì)其產(chǎn)生的EPS進(jìn)行分離純化,然后采用凝膠滲透色譜、紅外光譜、液相色譜對(duì)純化后EPS組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析,并分析多糖對(duì)2種常見病原菌的抗生物被膜活性、體外抗氧化活性、對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。研究結(jié)果為擴(kuò)大乳酸菌的綜合利用,以及使其EPS成為一種多功能活性物質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸膜明串珠菌L21-49由本實(shí)驗(yàn)從經(jīng)航天誘變的腸膜明串珠菌L16的誘變菌株中分離、純化并經(jīng)16S rRNA鑒定,保藏于-80 ℃冰箱。

胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;DEAE-Sepharose Fast Flow、Sepharose CL-6B、透析袋、Tris,北京索萊寶科技有限公司;三氯乙酸,天津市福晨化學(xué)試劑有限公司;DPPH試劑、ABTS試劑,美國sigma公司;黃嘌呤氧化酶,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸(p-Nitrophenyl β-D-Glucuronide,pNPG),深圳文樂生物科技公司;α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶,上海吉至生化科技有限公司;其他試劑均為分析純。

YXQ-LS-50A 全自動(dòng)高壓滅菌鍋,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Scientz-12 N 冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;PL602-S電子分析天平,瑞士梅特勒-托利多公司;PHS-25 pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;1285生物安全柜,美國Thermo Electron公司;VersaMax 光柵型酶標(biāo)儀,美國Melecular Devices公司;Evolution 300 紫外可見分光光度計(jì)、Nicolet IS 50/6700傅里葉變換紅外光譜儀,美國ThermoFIsher Scientific公司;LC-20AD 高效液相色譜儀,日本島津公司;R1001-VN 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;150A恒溫培養(yǎng)箱,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;Agilent1260 凝膠滲透色譜,美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要培養(yǎng)基和溶液的配制

MRS培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0,牛肉膏5.0,酵母粉4.0,葡萄糖20.0,吐溫80 1.0 mL,磷酸氫二鉀1.52,乙酸鈉3.53,檸檬酸三銨2.0,硫酸鎂0.2,硫酸錳0.03,pH 6.0。121 ℃ 滅菌20 min。

LB 培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,pH 7.0。121 ℃滅菌20 min。

0.1 mol/L PBS溶液(pH=6.86):A液(0.2 mol/L Na2HPO4):稱取71.6 g Na2HPO4·12H2O溶于1 L水中;B液(0.2 mol/L NaH2PO4):稱取31.2 g NaH2PO4·2H2O溶于1 L水中。取49 mL A液和51 mL B液混合配成pH=7.4的緩沖液,取500 mL加超純水稀釋至1 000 mL。

ABTS陽離子工作液:7.4 mmol/L ABTS與等體積2.6 mmo/L K2S2O8混合后于黑暗條件下靜置12 h,使用前用pH 7.4的PBS稀釋,使其OD734nm值為0.7±0.2。

α-淀粉酶溶液、α-葡萄糖苷酶溶液:使用PBS緩沖鹽溶液將α-淀粉酶溶液、α-葡萄糖苷酶溶液分別配制成1 U/mL后避光保存于-20 ℃,使用前放置于40 ℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。

1.2.2 腸膜明串珠菌EPS的分離純化

1.2.2.1 EPS的提取

參考盧承蓉等[12]的方法并略作修改。將腸膜明串珠菌L21-49按3%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h,連續(xù)活化3次后,4 ℃、10 000 r/min離心10 min,棄菌體沉淀,取上清液加入80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸溶液,使溶液中三氯乙酸終質(zhì)量濃度為4 g/L,在4 ℃冰箱中靜置6～8 h后,4 ℃、10 000 r/min離心15 min,棄去蛋白質(zhì)沉淀,取上清液加入自身3倍體積的95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇,在4 ℃冰箱中靜置12～15 h后4 ℃、10 000 r/min離心15 min即得多糖沉淀。多糖加入去離子水溶解后移至透析袋(截留分子質(zhì)量8 000～14 000 Da)中,用去離子水透析3 h后換水,之后每隔8 h換一次水,持續(xù)2 d,收集透析液,真空冷凍干燥,即得到粗多糖。

1.2.2.2 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析

參考李堯等[13]的方法并略作修改。用55 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.5～7.8)以1 mL/min平衡DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱(2.6 cm×58 cm),平衡3個(gè)柱體積,200 mg粗多糖溶于4 mL Tris-HCl溶液中,0.22 μm濾頭過濾后上樣。以Tris-HCl和含有0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L NaCl的Tris-HCl溶液進(jìn)行梯度洗脫,流速為1 mL/min,每8 min收集一管洗脫液,每管采用苯酚-硫酸法[14]檢測(cè)多糖含量,測(cè)定其OD490nm值。以管數(shù)為橫坐標(biāo),OD490nm值為縱坐標(biāo),作洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線收集主峰,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,超純水透析2 d,真空冷凍干燥。

1.2.2.3 Sepharose CL-6B 分子篩層析

Tris-HCl溶液以1 mL/min平衡Sepharose CL-6B層析柱(2.6 cm×60 cm),平衡3個(gè)柱體積,取經(jīng)陰離子交換柱層析后的多糖樣品100 mg溶于2 mL Tris-HCl中,0.22 μm濾頭過濾后上樣。以Tris-HCl溶液進(jìn)行洗脫,流速為1 mL/min,每8 min收集一管洗脫液,每管采用苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量,測(cè)定其OD490nm值。以管數(shù)為橫坐標(biāo),OD490nm值為縱坐標(biāo),作洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線收集主峰,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,超純水透析2 d,真空冷凍干燥,即得到純化EPS。

1.2.3 腸膜明串珠菌EPS純化組分的基本組成分析

1.2.3.1 紫外光譜分析

通過紫外分光光度計(jì)將1.00 mg/mL純化EPS溶液進(jìn)行200～800 nm全波段掃描,檢測(cè)純化EPS在260、280 nm和400～700 nm處是否含有核酸、蛋白質(zhì)和色素的特征吸收峰。

1.2.3.2 總糖、蛋白質(zhì)、硫酸根、糖醛酸含量測(cè)定

采用硫酸-苯酚法,通過繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定純化EPS的總糖含量;使用索萊寶蛋白質(zhì)含量試劑盒,通過繪制蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定純化EPS的蛋白質(zhì)含量;采用氯化鋇-明膠比濁法,通過繪制硫酸根含量標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定純化EPS的硫酸根含量[15];采用硫酸-咔唑法,通過繪制糖醛酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定純化EPS的糖醛酸含量[16]。

1.2.4 腸膜明串珠菌EPS純化組分的結(jié)構(gòu)分析

1.2.4.1 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用水相凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography,GPC)測(cè)定純化后EPS的分子質(zhì)量。用超純水配制質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的樣品溶液,0.22 μm 濾膜過濾后進(jìn)行GPC檢測(cè)。采用不同相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過Breeze軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,確定其平均分子質(zhì)量。

GPC色譜條件:采用Waters 2414示差折光檢測(cè)器;PL aquqgel-OH MIXED 8 μm(250 mm×4.6 mm)色譜柱,0.2 mol/L NaNO3和0.01 mol/L NaH2PO4(pH 7.0)為流動(dòng)相,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量40 μL,流速1 mL/min進(jìn)行洗脫。

1.2.4.2 紅外光譜測(cè)定

取干燥至恒重的純化EPS與干燥的KBr以質(zhì)量比1∶50研磨、壓片,利用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1進(jìn)行掃描。

1.2.4.3 單糖組成分析

精密稱取甘露糖,核糖,鼠李糖,葡萄糖醛酸,半乳糖醛酸,N-乙酰-氨基葡萄糖,葡萄糖,N-乙酰-氨基半乳糖,半乳糖,木糖,阿拉伯糖,巖藻糖對(duì)照品適量,加水溶解稀釋至每1 mL中各含50 μg的混合對(duì)照溶液。另取約3.0 mg純化多糖、3.0 mL 2 mol/L三氟乙酸于10 mL安瓿瓶中,封管,120 ℃酸解4 h,取出加入甲醇,氮吹揮干三氟乙酸,加3.0 mL水復(fù)溶。精確吸取250 μL混合對(duì)照溶液和水解后的純化EPS溶液至5 mL EP管中,加入250 μL 0.6 mol/L NaOH,500 μL 0.4 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(溶于甲醇),70 ℃反應(yīng)1 h。冷水中冷卻10 min;加入500 μL 0.3 mol/L HCl中和,再加入1 mL氯仿渦旋1 min,3 000 r/min離心10 min,小心取上清液,萃取3次后采用高效液相色譜儀分析。

分析條件:采用Xtimate C18 (4.6 mm×200 mm)5 μm色譜柱,以V(0.05 mol/L K2HPO4)∶V(乙腈)=83∶17為流動(dòng)相,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量20 μL,檢測(cè)波長250 nm,流速1.0 mL/min進(jìn)行洗脫。

1.2.5 腸膜明串珠菌EPS純化組分的功能活性測(cè)定

1.2.5.1 抗致病菌生物被膜活性的測(cè)定

參考WANG等[17]的方法稍作修改。將金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌以2%的接種量接種至LB培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min活化兩代后,用新鮮LB培養(yǎng)基稀釋至106CFU/mL,取100 μL稀釋后的菌液加入到96 孔板中,另取 0.5、1、2、4、8 mg/mL 100 μL純化EPS加入96孔板中,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h,用無菌水作為對(duì)照。采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定純化EPS對(duì)致病菌生物被膜形成的抑制率[18]。

1.2.5.2 抗氧化活性的測(cè)定

參考李堯等[13]的方法測(cè)定純化EPS對(duì)DPPH自由基、羥自由基(·OH)、ABTS陽離子自由基和超氧陰離子自由基(·O2-)清除能力;參考WANG等[19]的方法測(cè)定純化EPS的總還原能力。

1.2.5.3 對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定

參考WANG等[20]的方法測(cè)定純化EPS對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)涉及的數(shù)據(jù)均重復(fù)3次或3次以上,采用IBM SPSS Statistics 25對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,采用GraphPad Prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPS的分離純化

乳酸菌EPS粗提物中通常含有帶不同電荷、不同分子質(zhì)量的EPS,以及一些小分子雜質(zhì),為混合物,需要對(duì)其進(jìn)一步分離純化。DEAE-Sepharose Fast Flow屬于陰離子交換劑,分辨率高,適用于大劑量樣品分離出中性、酸性多糖[21]。如圖1所示,L21-49的EPS粗提物經(jīng)不同濃度的Tris-NaCl(0～0.7 mol/L)洗脫后共得到EPS-A、EPS-B、EPS-C和EPS-D 4個(gè)多糖組分,將其對(duì)應(yīng)管數(shù)收集,透析、冷凍干燥之后稱重,得率分別為21.15%、14.00%、10.28%和3.68%。其中用Tris-HCl洗脫可以得到EPS-A,為中性多糖;用不同濃度的Tris-NaCl洗脫可以得到EPS-B、EPS-C和EPS-D,這3種多糖組分都帶有電荷,為酸性多糖。由于EPS-D得率太低,后續(xù)主要研究EPS-A、EPS-B和EPS-C。

圖1 L21-49的EPS粗提物的DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析Fig.1 The DEAE-Sepharose Fast Flow ion exchange chromatogram of the crude EPS of L21-49

經(jīng)離子交換層析純化后獲得不帶電荷和帶電荷性質(zhì)相近的EPS組分,由于其分子質(zhì)量大小可能不同,因此還需通過Sepharose CL-6B分子篩進(jìn)一步分離純化。Sepharose CL-6B具有化學(xué)穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、流速快等優(yōu)勢(shì)。如圖2所示,用Tris-HCl對(duì)L21-49的3種純化組分進(jìn)行洗脫,3種組分的洗脫曲線都能得到比較對(duì)稱的單一峰,表明這3種純化EPS組分為分子質(zhì)量大小均一的單一組分。將EPS-A、EPS-B和EPS-C對(duì)應(yīng)管數(shù)收集,透析、冷凍干燥之后稱重,得率分別為57.20%、54.79%和59.20%。

a-EPS-A;b-EPS-B;c-EPS-C圖2 EPS-A、EPS-B、EPS-C的Sepharose CL-6B分子篩層析Fig.2 The Sepharose CL-6B exclusion chromatography for EPS-A, EPS-B, and EPS-C

2.2 EPS純化組分的基本組成分析

2.2.1 紫外光譜分析

使用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)不同的EPS樣品進(jìn)行紫外-可見(200～800 nm)全波長掃描,吸收光譜如圖3所示。各純化組分在260 nm處沒有吸收峰;EPS-A和EPS-B在280 nm處無吸收峰,而EPS-C在280 nm處出現(xiàn)了微弱吸收峰,可能其含有少量的蛋白質(zhì),為糖-蛋白體系。各組分在可見光波長都沒有出現(xiàn)吸收峰,表明都不含有色素。綜上所述EPS-A、EPS-B和EPS-C基本不含有核酸、蛋白質(zhì)和色素,分離效果好,較為純凈。

a-EPS粗提物;b-EPS-A;c-EPS-B;d-EPS-C圖3 EPS粗提物和各純化EPS的紫外-可見吸收光譜Fig.3 The UV-Vis spectra of the crude EPS and the purified EPSs

2.2.2 總糖、蛋白質(zhì)、硫酸根、糖醛酸含量

通過實(shí)驗(yàn)獲得葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.006 9X+0.084 5(R2=0.999),蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.669 0X+0.593 2(R2=0.990),硫酸根含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.187 4X+0.084 9(R2=0.993),糖醛酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=5.667 0X+0.158 8(R2=0.990)。純化EPS的總糖、蛋白質(zhì)、硫酸根、糖醛酸含量如表1所示。本研究中L21-49的純化EPS的總糖含量高于粗多糖,但硫酸根和糖醛酸含量卻比粗多糖低。EPS-A和EPS-B的硫酸根及糖醛酸含量都低于EPS-C,與周佳敏[22]分離純化的一株鼠李糖乳桿菌結(jié)果類似,由此可見酸性多糖不同帶電量應(yīng)該與硫酸根、糖醛酸含量以及其所處環(huán)境等有關(guān)。

表1 L21-49 的EPS的基本組成 單位:%

2.3 EPS純化組分的結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

純化EPS相對(duì)分子質(zhì)量的GPC色譜圖如圖4所示,3種純化EPS經(jīng) GPC 洗脫后第1個(gè)峰峰形尖銳對(duì)稱,表明得到的EPS較為純凈,分子質(zhì)量均一。利用Brezze軟件分析3種純化EPS的分子特征,如表2所示。

表2 純化EPS的分子特征Table 2 The molecular characteristics of the purified EPSs

a-EPS-A;b-EPS-B;c-EPS-C圖4 EPS-A、EPS-B、EPS-C的GPC圖譜Fig.4 The gel permeation chromatograms of EPS-A, EPS-B, and EPS-C

當(dāng)多分散性系數(shù)(polymer dispersity index,PDI,Mz/Mw)小于3時(shí),表明分子質(zhì)量分布范圍較為均一[23],也有研究表明,PDI作為衡量EPS 分子質(zhì)量分布寬度的指標(biāo),對(duì)EPS功能性質(zhì)具有顯著影響[24]。EPS的分子質(zhì)量在很大程度上影響其理化、生理甚至生物學(xué)性質(zhì)。EPS一些生物活性如抗菌和降低膽固醇與分子質(zhì)量呈正相關(guān),有研究表明高分子質(zhì)量EPS對(duì)革蘭氏陽性菌的抗菌作用比低分子質(zhì)量EPS更強(qiáng)[25]。但EPS分子質(zhì)量與免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性之間是否存在關(guān)系尚沒有確定的結(jié)論[19]。

2.3.2 紅外光譜測(cè)定

a-EPS-A;b-EPS-B;c-EPS-C圖5 EPS-A、EPS-B、EPS-C的紅外光譜圖Fig.5 The infrared spectra of EPS-A, EPS-B, and EPS-C

EPS的分子骨架,從連接方式(α/β和1→3、4、6)到成分組成(異構(gòu)體和官能團(tuán))都可以顯著影響它們的物理化學(xué)和生物學(xué)特性[29]。(1→4)主鏈連接方式賦予比(1→2)和(1→3)更大的剛度,因此在EPS抗氧化活性中可以通過這種剛性結(jié)構(gòu)將大量半縮醛羥基暴露于環(huán)境自由基分子中[30]。羧基這種官能團(tuán)可以發(fā)揮協(xié)同作用,一方面它們可以提供更多的孤對(duì)電子以加強(qiáng)分子間氫鍵相互作用,從而顯示出高黏度、抗菌和降膽固醇活性,另一方面,這些負(fù)基團(tuán)可以為EPS創(chuàng)造酸性環(huán)境,以促進(jìn)其水解以暴露更多的半縮醛羥基,從而顯示出優(yōu)異的抗氧化活性[31]。

2.3.3 單糖組成分析

如表3所示,3種多糖均含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖,但組成的比例不同。EPS-A主要含有甘露糖和葡萄糖,EPS-B主要含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸,EPS-C單糖組成較多,主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸和巖藻糖組成。

表3 純化EPS的單糖組成 單位:%

2.4 EPS純化組分的功能活性測(cè)定

2.4.1 抗致病菌生物被膜活性的測(cè)定

結(jié)果如圖6所示,質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL時(shí),EPS-A、EPS-B、EPS-C對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制率分別為51.58%、62.24%、47.33%;但是EPS-A、EPS-B、EPS-C對(duì)單增李斯特菌生物被膜的抑制率分別為34.57%、55.96%、30.58%?？傮w來看,3種純化EPS都表現(xiàn)出一定的抑制活性,EPS-B對(duì)兩種菌生物被膜的抑制效果始終優(yōu)于EPS-A和EPS-C。KANMANI等[32]研究表明乳酸鏈球菌EPS可以抑制革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的生物被膜形成,其在1 mg/mL 時(shí)對(duì)單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制率超過67%。

a-金黃色葡萄球菌;b-單增李斯特菌圖6 純化EPS的抗致病菌生物被膜活性Fig.6 The anti-biofilm activities of the purified EPSs

對(duì)于乳酸菌EPS抗致病菌生物被膜的研究相對(duì)較少,有研究顯示添加EPS可以降低致病菌細(xì)胞表面疏水性、zeta電位和細(xì)胞間相互作用,從而抑制生物被膜的形成,然而具體的抑制機(jī)制尚未闡明[33]。在本研究中,L21-49的3種純化EPS對(duì)于兩種致病菌生物被膜抑制率均呈現(xiàn)EPS-B>EPS-A>EPS-C,生物被膜抑制活性的差異可能是由于不同EPS的電荷、分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)不同引起的,推測(cè)中等分子質(zhì)量并帶有少量電荷的EPS對(duì)生物被膜具有較好的抑制活性。BAI等[34]研究也表明乳酸菌EPS在質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL時(shí)對(duì)單增李斯特菌生物被膜也具有較好的抑制活性,且EPS可能對(duì)細(xì)菌細(xì)胞表面的修飾、初始細(xì)胞附著的抑制或下調(diào)參與生物被膜形成的基因表達(dá)具有潛在的影響。乳酸菌EPS抑制生物被膜的機(jī)制還需要更加深入的研究。

2.4.2 抗氧化活性的測(cè)定

a-DPPH自由基;b-·OH;c-ABTS陽離子自由基;總還原力圖7 純化EPS的抗氧化活性Fig.7 The antioxidant activities of the purified EPSs

EPS體外抗氧化的分子機(jī)制在于這些生物大分子在酸性環(huán)境中發(fā)生水解,產(chǎn)生大量活潑的半縮醛羥基,同時(shí)將電子傳遞給反應(yīng)體系中的自由基,促進(jìn)自由基向穩(wěn)定物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,最終降低自由基的濃度[31]。抗氧化性能與分子質(zhì)量有很大關(guān)系,如前所述,這些聚合物的抗氧化活性取決于半縮醛羥基的數(shù)量,同時(shí)分子質(zhì)量越低,在同等質(zhì)量濃度下暴露的半縮醛羥基越多,因此,抗氧化活性隨著分子質(zhì)量的降低而提高。本研究中3種純化EPS分子質(zhì)量從高到低依次為EPS-A、EPS-B和EPS-C,根據(jù)糖醛酸含量和單糖組成分析結(jié)果,EPS-A基本不含葡萄糖醛酸,EPS-C的葡萄糖醛酸含量高于EPS-B,預(yù)測(cè)抗氧化活性EPS-C>EPS-B>EPS-A,從后續(xù)實(shí)驗(yàn)中也驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果,EPS-C的高抗氧化活性也有可能與其含有硫酸鹽有關(guān)。

2.4.3 對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性,可以降低食物在腸道內(nèi)水解成葡萄糖的速度,從而降低血液中的葡萄糖含量[37]。如圖8所示,L21-49的3種純化EPS在0.5～1.0 mg/mL時(shí)對(duì)α-淀粉酶發(fā)揮濃度依賴性抑制作用,其對(duì)α-淀粉酶的最大抑制率分別為25.60%、27.55%、17.78%。WANG等[20]研究表明樺褐孔菌胞外多糖UIOPS-1I在0.2 mg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)α-淀粉酶的抑制率為37.96%。3種純化EPS在0.5～8.0 mg/mL對(duì)α-葡萄糖苷酶發(fā)揮濃度依賴性抑制作用,最大抑制率分別為32.19%、20.41%、22.80%。

a-α-淀粉酶;b-α-葡萄糖苷酶圖8 純化EPS對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.8 The inhibitory activities of the purified EPSs on α-amylase and α-glucosidase

EPS-A相較于EPS-B和EPS-C來說具有較高的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性,且隨著EPS濃度的增加,對(duì)α-淀粉酶的抑制率不再上升,說明EPS對(duì)α-淀粉酶的活性抑制作用有飽和效應(yīng),而對(duì)于α-葡萄糖苷酶也具有一定的濃度依賴性。JIANG等[37]通過α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌EPS對(duì)兩種酶的抑制作用均為可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

3 結(jié)論