陳李綱,高云鴿,董 健,翟梁好,王明義,呂小慧,陳必良

(1.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西 西安 710032;2.中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科,四川 成都 610036)

卵巢癌是治療最困難的女性生殖道惡性腫瘤,因發(fā)現(xiàn)晚、易復發(fā)、易耐藥,晚期卵巢癌的5年生存率不足30%。卵巢癌患者經(jīng)過以R0為目標的腫瘤細胞減滅術(shù)、以鉑為基礎的規(guī)范化療后,繼續(xù)使用聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑(poly ADP ribose polymerase inhibitor,PARPi)維持治療可延緩復發(fā)并延長無進展生存(progression-free survival,PFS)時間。隨著PARPi的廣泛應用,PARP抑制劑的耐藥問題日益突出,因此,闡明PARP抑制劑的作用機制、耐藥機制,尋求更好的解決耐藥問題的策略,才能使晚期卵巢癌患者更多獲益。

1 PARPi的作用機制

PARP酶家族包含17個成員,其中PARP1占80%以上,在DNA單鏈損傷(SSB)修復中發(fā)揮重要作用。PARP1能及時識別并結(jié)合SSB,通過水解煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),將二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)核糖部分填加至PARP1和組蛋白等底物蛋白,使底物蛋白發(fā)生核糖基化修飾(PAR化),進而導致染色質(zhì)松弛和DNA修復酶如XRCC1的募集,啟動SSB修復反應[1-2]。

同源重組(homologous recombination,HR)修復途徑以同源序列作為修復模板,是一種準確且高保真的雙鏈DNA斷裂(DSB)修復方式。在HR修復過程中,乳腺癌易感基因(breast cancer,BRCA)1和BRCA2通過促進DNA末端切除、促進重組酶在DSB位點募集,發(fā)揮了非常重要作用。PARPi主要以兩種機制發(fā)揮作用,一方面,PARPi通過合成致死發(fā)揮作用:在BRCA1/2突變細胞中,PARPi抑制PARP1活性,導致大量未修復SSBS累積,進而促進停滯復制叉坍塌,導致DSB增多,由于BRCA1/2突變引起同源重組修復缺陷(homologue recombination deficient,HRD),大量DSB由容易出錯的非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)途徑修復,導致基因組不穩(wěn)定,隨后導致細胞死亡[3]。另一方面,PARPi通過阻止PARP1自體PAR化和誘導變構(gòu)調(diào)節(jié)來阻礙PARP1與DNA的解離,將PARP1捕獲在DNA上,阻礙復制叉進程,最終導致有絲分裂過程中染色質(zhì)的異常形成和細胞死亡[4]。

2 PARPi耐藥機制

2.1 HR恢復

2.1.1 BRCA1/2的回復突變

腫瘤細胞通過回復轉(zhuǎn)突變恢復BRCA1/2的功能是常見的PARPi耐藥機制。四川大學華西第二院對5例接受PARPi維持治療出現(xiàn)耐藥的晚期卵巢癌患者活檢樣本進行高通量測序(next generation sequencing,NGS),發(fā)現(xiàn)1例患者治療前為BRCA1突變,耐藥后檢測到BRCA1發(fā)生回復突變。另一項對攜帶BRCA1/2突變的泛癌研究中,含鉑化療及PARP抑制劑治療后進行組織基因檢測,在86例(26%)患者中發(fā)現(xiàn)BRCA1/2回復突變[5-6]。

2.1.2 BRCA1啟動子高甲基化的缺失

BRCA1啟動子的高甲基化導致BRCA1 mRNA表達下調(diào),10%～20%的漿液性卵巢癌BRCA1功能缺失與啟動子區(qū)CpG島的高甲基化相關(guān)[7]。在卵巢癌患者異種移植物(patient-derived xenografts,PDX)模型中發(fā)現(xiàn),BRCA1啟動子甲基化缺失,使BRCA1重新表達HR途徑恢復,進而產(chǎn)生對PARPi耐藥[8-9]。

2.1.3拮抗DNA末端切除分子缺失

HR途徑的激活需要切除5′端的DNA產(chǎn)生一定長度的3′懸垂,p53結(jié)合蛋白1(53BP1)、Rap1 相互作用因子1(Rap1-interacting factor 1,RIF1)、Shieldin復合物(SHLD1、SHLD2、SHLD3、Rev7)保護5′端不被切除,限制3′懸垂的形成。此外,Shieldin復合物招募端粒結(jié)合蛋白復合物及相關(guān)的DNA聚合酶α/引物酶(POLα/引物酶),通過填充合成來限制3′懸垂形成[10-11]。此外,動力蛋白輕鏈1(dynein light chain 1,DYNLL1)通過抑制核酸酶MRE11活性,DNA解旋酶B(HeLB)通過抑制核酸酶EXO1和BLM-DNA2活性也同樣發(fā)揮拮抗DNA末端切除的作用。故以上抑制DNA末端切除分子的缺失可恢復BRCA1缺陷細胞的HR途徑,產(chǎn)生對PARPi的耐藥性[12-14]。

2.1.4 RAD51過度表達

BRCA1-BRCA2-RAD51軸是 HR的關(guān)鍵。細胞內(nèi)RAD51水平通過早期有絲分裂抑制因子1(early mitotic inhibitory 1,EMI1)介導的降解得以控制。在BRCA1缺失的三陰型乳腺癌細胞中下調(diào)EMI1,可恢復依賴RAD51的HR,產(chǎn)生對PARPi的抗性[15]。在卵巢癌PDX模型研究中發(fā)現(xiàn),RAD51病灶的基礎水平與奧拉帕利反應強烈呈負相關(guān),病灶評分越低,對奧拉帕利的敏感性越高[16]。

2.1.5微同源介導的末端連接修復途徑過度激活

微同源介導的末端連接(microhomology-medi-ated end joining,MMEJ)修復途徑在正常哺乳動物細胞中很少使用,而在癌癥中普遍上調(diào),尤其是在HRD癌細胞[17]。DNA聚合酶θ(Polθ)是MMEJ修復途徑的關(guān)鍵酶,在HRD的癌細胞中,Polθ過度表達使MMEJ修復途徑過度激活,修復損傷DSB[18]。此外,通過ctDNA測序分析卵巢癌或乳腺癌患者治療進展前后的血漿樣本,發(fā)現(xiàn)68%的BRCA回復突變是由MMEJ途徑介導的[19],故MMEJ途徑與PARPi耐藥密切相關(guān)。

2.2復制叉穩(wěn)定性恢復

高級別漿液性卵巢癌(high-grade serous ovarian carcinoma,HGSOC)是高復制應激腫瘤的典型代表。復制應激中停滯的復制叉由轉(zhuǎn)位酶SMARCAL1、ZRANB3和HLTF激活核酸酶啟動復制叉重塑來維持基因組穩(wěn)定性[20]。轉(zhuǎn)位酶SMARCAL1、ZRANB3和HLTF的丟失或核酸酶MRE11/EXO1、核酸內(nèi)切酶EZH2/MUS81的活性降低,都會相對增加復制叉的穩(wěn)定性而引起PARPi耐藥。此外,X染色體上RPA相關(guān)RAD51拮抗蛋白(RPA-related,RAD51-antagonist on X-chromosome,RADX)通過調(diào)節(jié)RAD51活性參與復制叉保護,RADX的缺失為BRCA1/2、FANCA、FANCD2或BOD1L基因缺失的細胞提供復制叉保護,引起PARPi耐藥[21-22]。

2.3 PARP1捕獲減少

如前所述,PARPi發(fā)揮作用的一條重要途徑是將PARP1捕獲在DNA損傷位點,阻礙復制叉進程,最終導致HRD腫瘤細胞死亡。故PARP1突變引起捕獲減少,可引起PARPi耐藥。通過CRISPR-Cas9技術(shù)對PARP1進行全基因組測序發(fā)現(xiàn),PARP1突變引起PARP1的捕獲減少,導致PARPi在BRCA1突變型三陰型乳腺和卵巢癌細胞中的毒性降低。此外,一名患者因PARP1突變導致PARP1從受損DNA位點迅速解離,而對奧拉帕利產(chǎn)生耐藥[23-24]。

PAR糖化水解酶(poly ADP ribose glycohydrolase,PARG)是降解PAR鏈的主要酶,PARG的缺乏也可以使PARP1捕獲相對減少。PARG的缺乏使PARP產(chǎn)生的高負電荷PAR鏈不能被降解,促進了其從DNA上的釋放從而減少了PARP1捕獲。在細胞試驗中,通過shRNA介導PARG丟失導致小鼠乳腺腫瘤細胞對奧拉帕利和AZD2461的耐藥性增加。對臨床腫瘤標本檢測發(fā)現(xiàn),PARG丟失的HGSOC細胞對PARPi具有耐藥性[25]。

2.4藥物外排增加

多藥耐藥基因1(MDR1)編碼的P-糖蛋白的表達增加是耐藥的公認機制之一[26],P-糖蛋白利用ATP水解的能量,將有毒化合物轉(zhuǎn)移至細胞外,從而對多種藥物產(chǎn)生抗性。對由MDR1表達增加引起的耐藥研究發(fā)現(xiàn),紫杉醇耐藥A2780卵巢癌細胞對奧拉帕利和盧卡帕利具有交叉耐藥性,但對維利帕利或AZD2461不具有交叉耐藥性,在使用MDR1抑制劑維拉帕米和依克立達治療后耐藥性是可逆的[27]。

2.5細胞周期依賴性激酶12過度表達

細胞周期依賴性激酶12(CDK12)表達水平可以影響細胞對PARPi的敏感性。用CDK12 shRNA沉默奧拉帕利耐藥卵巢癌細胞株OV90中CDK12的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)奧拉帕利敏感性顯著增加,增加程度與沉默BRCA1相當。同時,恢復CDK12低表達的腫瘤細胞系CAOV3中CDK12表達,顯著增加了對奧拉帕利的耐藥性。細胞周期蛋白K(Cyclin K)是CDK12的細胞周期蛋白伴侶,負責調(diào)節(jié)CDK12的表達,沉默Cyclin K與沉默CDK12效果相同。因此,CDK12或Cyclin K在腫瘤細胞中的過度表達與PARPi耐藥相關(guān)[28]。

2.6微小RNA表達異常

miR-622在S期通過下調(diào)Ku復合物表達抑制NHEJ,并促進MRE11的募集促進S期HR介導的雙鏈DNA損傷修復的啟動,異位過表達miR-622可以誘導BRCA1突變HGSOC對PARPi和鉑類藥物耐藥[29]。miR-182在BRCA1的表達方面起著重要作用,拮抗miR-182表達通過上調(diào)BRCA1表達增強了HR能力,從而使細胞對PARPi產(chǎn)生抗性[30]。miR-493-5p表達增加介導BRCA2突變腫瘤對PARPi耐藥。不同于miR-622和miR-182,miR-493-5P不改變同源重組的能力。miR-493-5P在BRCA2突變腫瘤內(nèi)的表達降低了核酸酶活性,從而導致了相對穩(wěn)定的復制叉,僅在攜帶BRCA2突變的腫瘤細胞中誘導對PARPi的耐藥性[31]。

3可能克服PARPi耐藥的策略

3.1 PARPi聯(lián)合同源重組途徑抑制劑

針對因同源重組恢復引起的PARPi耐藥,聯(lián)合使用同源重組途徑抑制劑可能逆轉(zhuǎn)PARPi耐藥。RNF168抑制劑阻斷了BRCA1非依賴性PALB2/BRCA2募集,提高了因丟失53BP1-RIF1-Rev7-Shieldin末端保護途徑而對PARPi耐藥的BRCA1突變型腫瘤再次對PARPi的敏感性[32]。KIAA1529通過極光激酶A(Aurora-A)增加下游效應子RAD51的表達,使HR在卵巢癌細胞中得到恢復,聯(lián)合KIAA1529抑制劑可逆轉(zhuǎn)因RAD51過表達引起的PARPi耐藥[33]。此外,第10染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)缺失通過抑制RAD51的表達抑制HR,聯(lián)合PTEN抑制劑也可發(fā)揮上述作用[34]。Polθ抑制劑ART558抑制Polθ介導的MMEJ修復途徑,促進BRCA1/2突變腫瘤細胞的DNA損傷和合成致死性,聯(lián)合Polθ抑制劑可逆轉(zhuǎn)因MMEJ修復途徑過度激活引起的PARPi耐藥,而且對53BP1/Shieldin復合物缺失誘導的PARPi耐藥也有一定效果[35]。熱休克蛋白90抑制劑17-AAG通過抑制HR,增強對奧拉帕利的敏感性,與單獨使用奧拉帕利相比,17-AAG聯(lián)合使用奧拉帕利可誘導更多的雙鏈DNA損傷[36]。溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)域(BET)抑制劑JQ1通過抑制BRCA1的表達而阻斷HR途徑,與PARPi聯(lián)合使用可克服腫瘤細胞對PARPi的耐藥性并提高PARPi的療效[37]。

3.2 PARPi聯(lián)合細胞周期檢查點抑制劑

細胞周期檢查點可分為DNA損傷檢查點(ATM-CHK2-P53)和DNA復制應激檢查點(ATR-CHK1-WEE1),負責監(jiān)視細胞周期G1/S期和G2/M期的轉(zhuǎn)換。惡性腫瘤細胞高度依賴DNA復制應激檢查點通路處理本身的高復制應激,HGSOC就是高復制應激腫瘤的典型代表。ATR-CHK1-WEE1通路抑制劑抑制S期和G2/M細胞周期檢查點,使惡性腫瘤細胞提前進入有絲分裂期,從而增加DNA錯誤的數(shù)量,導致基因組不穩(wěn)定,有絲分裂突變增多,與PARPi聯(lián)合使用可以產(chǎn)生協(xié)同作用。

ATR通過與PARP的相互作用引起G2/M細胞周期阻滯和保持復制叉穩(wěn)定。此外,ATR可繞過BRCA1,通過磷酸化復制蛋白A向DSB招募PALB2和BRCA2,參與HR的恢復[38]。在PARPi耐藥的BRCA1/2缺乏的HGSOC細胞株中觀察到ATR的過度表達,聯(lián)合ATR抑制劑AZD6738使耐藥細胞對PARPi再敏感[39]。在一項評估口服ATR抑制劑M6620在晚期難治實體瘤患者中應用的Ⅰ期試驗中,1例對鉑類及PARPi耐藥的BRCA1突變卵巢癌患者,口服M6620后獲得部分應答,CA125水平相應降低[40]。

CHK1除了參與G2/M細胞周期阻滯外,還通過促進BRCA2-RAD51磷酸化參與DSB的修復。在奧拉帕利耐藥PDX模型中,CHK1抑制劑Prexasertib與奧拉帕利聯(lián)合使用具有協(xié)同作用,可顯著抑制腫瘤生長;在奧拉帕利敏感PDX模型中,增強了反應的程度和持久性[41]。在PARPi耐藥的HGSOC患者中進行了Prexasertib與奧拉帕利的聯(lián)合試驗,其中18例患者中有4例獲得部分緩解[42]。

WEE1通過磷酸化抑制CDC25C,進而導致CDK2和CDK1缺失,引起G2/M期阻滯。一項Ⅱ期臨床研究在復發(fā)性PARPi耐藥卵巢癌患者中評估WEE1抑制劑Adavosertib聯(lián)合或不聯(lián)合奧拉帕利的療效?？傮w反映率分別為23%、29%,中位PFS分別為5.5個月、6.8個月。其中野生型BRCA1/2患者,單一治療組的總體反映率為31%,聯(lián)合治療組為39%[43]。在卵巢癌PDX中還發(fā)現(xiàn)相較于同時給藥,序貫給藥對正常細胞影響較小,毒性較低,療效相同[44]。

3.3 PARPi聯(lián)合免疫檢查點抑制劑

PARPi通過釋放DNA顆粒到細胞質(zhì)中激活環(huán)GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)-干擾素基因刺激物(stimulator of interferon genes,STING)通路。cGAS-STING通路的激活一方面可以引發(fā)先天免疫應答,另一方面還能上調(diào)細胞程序性死亡配體1(programmed death ligand-1,PDL1)的表達。因此,將抗PD1或PDL1的單克隆抗體與PARPi聯(lián)合使用,可增強對腫瘤細胞的殺傷作用[45],但對PARPi耐藥的患者是否可以從這種聯(lián)合治療中受益還有待進一步臨床試驗確定。

3.4 PARPi聯(lián)合ALK抑制劑

間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)磷酸化CDK9,促進HR和PARPi耐藥。分別在卵巢癌PDX模型和對PARPi耐藥的三陰型乳腺癌PDX模型中比較PARPi和ALK抑制劑的單獨及聯(lián)合作用,兩種模型結(jié)果均為PARPi聯(lián)合ALK抑制劑用藥組小鼠荷瘤大小明顯小于單用任何一種藥物;與單藥治療的小鼠相比,聯(lián)合用藥組小鼠顯示出更好的存活率[46]。因此,聯(lián)合ALK抑制劑可能是克服PARPi耐藥性的一種策略。

3.5 PARPi聯(lián)合管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑

血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)抑制劑通過誘導BRCA1/2和RAD51的表達下調(diào)抑制HR,增加PARPi的敏感性。卵巢癌PDX模型研究表明,聯(lián)合VEGFR抑制劑Cediranib可提高奧拉帕利對PARPi耐藥卵巢癌細胞的殺傷作用[47]。一項Ⅱ期臨床試驗對單用尼拉帕利組和聯(lián)合貝伐單抗組治療鉑敏感復發(fā)性卵巢癌的療效進行比較,結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組顯著提高PFS(中位PFS分別為5.5個月、11.9個月)[48],聯(lián)合VEGFR抑制劑是治療PARPi耐藥患者的可行方法。

4結(jié)語

雖然以PARPi為主的維持治療使卵巢癌患者5年生存率較前有所提升,但同其他化療藥物一樣,耐藥依然是限制卵巢癌患者從PARPi更大獲益的瓶頸。目前大量的臨床前及臨床研究為我們揭示了PARPi可能的耐藥機制及逆轉(zhuǎn)PARPi耐藥的可行策略,我們?nèi)孕枥^續(xù)深入研究不同種類PARPi的確切作用機制及耐藥機制,并將研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應用以保持PARPi持續(xù)敏感性。此外,由于大部分患者在接受PARPi前已經(jīng)接受多周期化療,腫瘤可能已經(jīng)對PARPi產(chǎn)生了某些形式的耐藥,我們需要研究是否能在腫瘤細胞減滅術(shù)后盡早給予PARPi來最大程度地改善患者預后。相信隨著研究進展,會出現(xiàn)更多安全有效的方案來預防或推遲耐藥的發(fā)生,并最終改善患者的長期結(jié)局。