胡晏寧,范艷艷,武永莉,王清揚,向麗麗,魯炳懷,,△

1.北京大學中日友好臨床醫(yī)學院,北京 100029;2.中日友好醫(yī)院臨床微生物感染實驗室,北京 100029;3.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院,北京 100730;4.重慶市沙坪壩區(qū)陳家橋醫(yī)院/重慶醫(yī)藥高等專科學校附屬醫(yī)院檢驗科,重慶 400000

諾卡菌是人致病革蘭陽性需氧放線菌,生長緩慢,存在于土壤與環(huán)境中[1]。諾卡菌常在免疫功能嚴重受損人群如接受化療的癌癥患者、艾滋病患者和器官移植受者體中引起機會性感染,也常常感染免疫力正常的人群。經(jīng)呼吸道與皮膚軟組織侵入,以肺部感染最為常見,其次為皮膚軟組織感染,在部分免疫能力低下人群中,可由肺部或軟組織等原發(fā)病灶經(jīng)血行播散[2]。近年來,諾卡菌病感染診斷較為困難。僅依靠傳統(tǒng)的染色涂片與普通培養(yǎng),檢出率低。提高諾卡菌檢出率,對合理使用抗菌藥物、降低病死率非常重要。實驗室檢測方法主要包括革蘭染色、弱抗酸染色、常規(guī)培養(yǎng)等手段,陽性率低。如果常規(guī)的呼吸道樣本,如咳出痰、支氣管肺泡灌洗液等病原學檢測陰性,臨床可采用肺組織標本進行病原學診斷。此類標本為有創(chuàng)獲取標本,實驗室處理非常關(guān)鍵。在肺組織樣本中檢出諾卡菌的病例非常罕見。本文回顧性分析中日友好醫(yī)院近年來肺組織檢出諾卡菌的9例患者的臨床特征及影像學特點,并回顧了相關(guān)文獻,為提高諾卡菌的診治水平提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 2018年10月至2022年3月,中日友好醫(yī)院共有3 105例患者送檢肺組織標本,將其中9例諾卡菌培養(yǎng)陽性的患者納入研究,男7例,女2例,年齡39～78歲。本研究通過中日友好醫(yī)院倫理委員會審核批準(2020-102-K66)。納入標準:無菌操作條件下經(jīng)皮穿刺或經(jīng)電子支氣管鏡獲取或術(shù)中獲取的病灶組織,經(jīng)過哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)、BACTEC MGIT BD960分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)(MGIT 960)、BACTEC BD Myco/F Lytic真菌/分枝桿菌系統(tǒng)(Myco/F)培養(yǎng),至少1種方法顯示諾卡菌培養(yǎng)陽性。通過病歷系統(tǒng)收集患者的流行病學數(shù)據(jù)、基礎(chǔ)疾病、臨床表現(xiàn)、影像檢查結(jié)果,病理學表現(xiàn)、診療用藥及結(jié)局。

1.2試劑 革蘭染色與弱抗酸染色染液與六胺銀染液(中國珠海貝索公司),血平皿(中國鄭州安圖公司),MGIT 960與Myco/F(美國BD公司)。

1.3方法 將經(jīng)CT引導下經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)或經(jīng)支氣管鏡引導下肺活檢術(shù)獲取的肺組織分別進行病理組織切片六胺銀染色。研磨后的樣本加入1 mL生理鹽水,取0.5 mL分別接種血平皿、MGIT 960、Myco/F,其余0.5 mL用于制備涂片進行革蘭染色與弱抗酸染色鏡檢以及其他分子生物學檢測。血平皿放置35 ℃環(huán)境下孵育1周,MGIT 960與Myco/F上機孵育時間為42 d,如有陽性預警,轉(zhuǎn)種血平皿。典型的諾卡菌在血平皿生長2～7 d,可觀察到粗糙、凸起、灰白或黃色、不透明的菌落。生長菌落經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)或16S rRNA鑒定諾卡菌到種水平。

2 結(jié) 果

2.1臨床資料 9例組織標本中檢出的諾卡菌感染患者相關(guān)資料見表1。6例患者的肺組織標本由經(jīng)CT引導經(jīng)皮肺穿刺獲得,2例來自經(jīng)支氣管鏡肺活檢術(shù),1例來自手術(shù)切除。既往肺移植術(shù)后患者2例,2型糖尿病患者1例,非霍奇金淋巴瘤化療后長期使用糖皮質(zhì)激素患者1例,腎病綜合征患者1例,4例患者既往身體健康。9例患者的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、胸悶、咳嗽、咳痰?；颊?發(fā)熱同時伴胸痛,患者7主要表現(xiàn)為咯血。

表1 9例諾卡菌陽性組織標本臨床感染特點與診療過程及回顧文獻中的4例諾卡菌感染患者特征

2.2實驗室與影像學檢查 病原學培養(yǎng)結(jié)果顯示9例患者中檢出蓋爾森基興諾卡菌3例,皮疽諾卡菌3例,新諾卡菌、亞洲諾卡菌、線團擬諾卡菌各1例。8例經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)檢出,5例經(jīng)Myco/F培養(yǎng)檢出,2例經(jīng)MGIT 960檢出。諾卡菌感染患者肺部CT表現(xiàn)多變而不典型。所有患者影像學均可見斑片狀密度影,6例可見結(jié)節(jié)影,6例可見磨玻璃影,2例可見空洞,伴胸腔積液者4例,3例可見條索狀密度增高影。見圖1。

在所有患者的組織切片病理學檢查結(jié)果中,7例患者可見慢性炎性細胞浸潤,5例可見支氣管黏膜顯急慢性炎,2例可見局部膿腫形成,患者3銀染可見組織內(nèi)的菌絲形態(tài),患者6可見與諾卡菌共同感染的絲狀真菌菌團。

2.3抗菌藥物治療及結(jié)局 9例患者中有7例采用甲氧芐啶-磺胺甲噁唑(TMP-SMZ)治療,2例用阿米卡星治療,2例使用利奈唑胺治療。除1例(患者6)未愈出院外,其余8例患者病情均有好轉(zhuǎn)并出院。見表1。

2.4文獻回顧 回顧文獻報道中的4例組織標本檢出諾卡菌患者的臨床感染特點及實驗室檢查結(jié)果,見表1。諾卡菌感染病患的感染部位、影像學與病理學病變特征呈現(xiàn)多樣性。男女比例為1∶1,平均發(fā)病年齡為46歲。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、胸痛等。影像學表現(xiàn)多為肺部多發(fā)實變影,病理學檢查結(jié)果多為炎性細胞浸潤與肉芽腫。4例患者中北京諾卡菌、星形諾卡菌各檢出1例,患者2未鑒定到種,例4鑒定結(jié)果為一種新型諾卡菌。在4例患者的影像學表現(xiàn)中,2例表現(xiàn)為斑片狀密度影,1例有結(jié)節(jié)影,2例有空洞表現(xiàn),1例合并胸腔積液,1例支氣管空氣征,1例針狀腫塊。在病理學檢查結(jié)果中,1例患者有慢性炎性細胞浸潤,2例患者表現(xiàn)為肉芽腫。

3 討 論

諾卡菌屬是土壤中發(fā)現(xiàn)的革蘭陽性需氧放線菌。于1888年首次從牛瘤病例的樣本中分離出來[7],這些細菌是免疫抑制患者的常見致病菌,有時可導致較高的病死率[8],到目前為止諾卡菌屬已發(fā)現(xiàn)121個菌種,有研究認為其中有超過50種菌種能夠使人類致病[9],其中新諾卡菌復合群、蓋爾森基興諾卡菌、皮疽諾卡菌、巴西諾卡菌、膿腫諾卡菌復合群、南非諾卡菌是6種最常見的諾卡菌種[2]。多數(shù)諾卡菌病患者有免疫抑制、慢性阻塞性肺疾病、慢性腎病或糖尿病等基礎(chǔ)性疾病[10]。

到目前為止,諾卡菌作為一種人類致病菌受到的關(guān)注仍然不足,其實驗室檢測方法主要有涂片鏡檢法、培養(yǎng)法等。鏡下涂片染色見被急性炎癥細胞包圍的呈90°分枝角的典型的分枝菌絲是具有診斷意義的[1]。諾卡菌在固體培養(yǎng)基上生長的菌落呈現(xiàn)光滑、顆粒狀、表面褶皺等形態(tài),有泥土氣味,菌落顏色多為黃色或深橙色。MGIT BD960在臨床中的最初同時也是主要的用途是培養(yǎng)結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌,同時也可作為諾卡菌的液體培養(yǎng)檢測方法,但目前關(guān)于BD MGIT 960檢出諾卡菌的報道仍然較少[11]。本研究中的9例諾卡菌,8例經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)檢出,說明常規(guī)血平皿放置1周可檢出諾卡菌。5例經(jīng)Myco/F培養(yǎng)檢出,2例經(jīng)MGIT 960檢出。特別是患者3的肺組織僅通過MGIT 960檢出亞洲諾卡菌,說明多種培養(yǎng)手段應用對于肺組織檢出諾卡菌的重要價值。

諾卡菌是影響免疫缺陷宿主的機會性病原體,呼吸道吸入是接觸環(huán)境菌的主要途徑,故肺諾卡菌病最常見。一般為亞急性或慢性起病,主要癥狀包括咳嗽、呼吸急促、胸痛、咯血、發(fā)燒、盜汗、體重減輕和進行性疲勞等[12]。肺諾卡菌病的影像學特征通常是多樣且非特異的,表現(xiàn)為局灶性或多灶性病變,伴有結(jié)節(jié)和(或)實變浸潤以及空洞病變[13],只靠胸部X線片比較難以診斷,需要結(jié)合培養(yǎng)等聯(lián)合診斷。本文總結(jié)的9例肺組織標本檢出諾卡菌的病例,影像學均可見斑片狀密度影,66.7%(6/9)的患者表現(xiàn)為結(jié)節(jié)影,44.4%(4/9)為磨玻璃影,3例可見條索狀密度增高影,2例可見空洞,3例患者同時伴有胸腔積液。而在病理學檢查結(jié)果中,77.8%(7/9)的患者表現(xiàn)為慢性炎性細胞浸潤,55.6%(5/9)可見支氣管黏膜顯急慢性炎,2例有局部膿腫形成,其中病例3銀染可見組織內(nèi)的菌絲形態(tài)。而文獻回顧的4例肺組織標本檢出諾卡菌陽性的患者中,4例均為肺部感染,且在此之中有1例合并了腦部感染。在4例患者的影像學表現(xiàn)中,2例表現(xiàn)為斑片狀密度影,1例有結(jié)節(jié)影,2例有空洞表現(xiàn),1例合并胸腔積液,1例支氣管空氣征,1例針狀腫塊。在病理學檢查結(jié)果中,1例患者有慢性炎性細胞浸潤,2例患者表現(xiàn)為肉芽腫。

肺諾卡菌病治療首選TMP-SMX。此外,利奈唑胺、阿米卡星及亞胺培南等藥物敏感性也較高。LEBEAUX等[14]首次大規(guī)模研究了法國諾卡菌流行病學與藥敏情況,對從2010-2015年所有檢出的736株諾卡菌進行了藥敏試驗,結(jié)果為諾卡菌對利奈唑胺、阿米卡星、TMP-SMX、米諾環(huán)素和亞胺培南最敏感。本課題組曾經(jīng)對國內(nèi)收集到的21個省、市、自治區(qū)的441株諾卡菌進行藥敏檢測,發(fā)現(xiàn)國內(nèi)諾卡菌對利奈唑胺、阿米卡星與TMP-SMX保持極高的敏感性[2]。本文9例患者中有7例應用了TMP-SMZ,分別有2例分別使用了利奈唑胺和阿米卡星,除患者6未愈離院外,其余8例的病情均有好轉(zhuǎn)?；颊?也并未使用TMP-SMZ,利奈唑胺或阿米卡星。文獻回顧的4例患者全部好轉(zhuǎn)出院,其中3例患者使用了TMP-SMZ,有2例使用了亞胺培南。以上說明目前對于肺諾卡菌病的治療主要選擇的藥物還是TMP-SMZ,但以上結(jié)果也說明不同諾卡菌種的耐藥譜不同,對于諾卡菌感染的治療,最好是能鑒定到具體的菌種,才能合理用藥。

綜上所述,由于肺諾卡菌病的臨床表現(xiàn)、影像學特征不明顯易與肺結(jié)核病混淆,且諾卡菌生長緩慢、病理切片與染色涂片鏡檢陽性率較低,諾卡菌在臨床病例中很容易被漏檢或誤檢。肺諾卡菌病采集肺組織為創(chuàng)傷性臨床操作,臨床醫(yī)生需與微生物實驗室及時溝通,肺組織標本除送檢病理外,應取部分送至臨床微生物實驗室,采取合適的培養(yǎng)方法,延長培養(yǎng)時間,才能提高臨床感染病例的諾卡菌分離率,合理使用抗菌藥物。