林添輝，崔艷銘，吳傳聰，盧勤燕，魏建波，丁韋仁，李業(yè)豪，彭翔

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院（清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院）風(fēng)濕免疫科，廣東 清遠(yuǎn) 511500

近30 年來，我國糖尿?。―M）患病率明顯增加，患病人數(shù)已達(dá)1.44 億，高居全球首位[1-2]，其中約20%～40%的DM 患者合并糖尿病腎?。―KD），現(xiàn)已成為終末期腎病的主要原因之一[3-4]。臨床上，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）通過降低血壓、選擇性擴(kuò)張出球小動(dòng)脈，從而降低腎小球內(nèi)壓、改變腎小球的結(jié)構(gòu)進(jìn)而減少蛋白尿，是治療DM 患者的首選藥物之一[5]。其中，雷米普利是一種廣泛使用的口服ACEI，具有較強(qiáng)的ACE 抑制活性和較長的作用時(shí)間。研究表明，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，雷米普利具有緩解DKD 的作用[6-9]。有研究表明，除了高糖血癥外，氧化應(yīng)激是DKD 發(fā)病機(jī)制的重要因素[10]。中藥虎杖含有多種藥理活性成分，其主要有效成分白藜蘆醇（RES）即3，4，5 一三羥基二苯乙烯。Wang X等[11]的一項(xiàng)研究表明，白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)SIRT1/FOXO3a 通路來改善DKD 大鼠腎小管中高血糖引起的氧化應(yīng)激，從而改善DKD 大鼠的腎小球硬化。同樣，Wen D 等[12]的報(bào)告顯示白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)血管生成來減弱DKD。但是，目前雷米普利與白藜蘆醇聯(lián)用治療DKD 的研究報(bào)道較少，其聯(lián)用治療效果尚未有明確定論。本研究在不使用降糖藥物干預(yù)的情況下，評估雷米普利與白藜蘆醇在鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的早期DKD 大鼠模型中單用或聯(lián)用的治療效果，探討雷米普利與白藜蘆醇聯(lián)用是否可通過抑制RhoA與ROCK 蛋白表達(dá)水平，減輕腎臟纖維化。

1 材料與方法

1.1 藥物雷米普利（PHR-1446，Sigma Aldrich，St.Louis，Missouri）的CAS 號為87333-19-5，分子式為C23H32N2O5，分子量為416.51。白藜蘆醇（R5010，Sigma Aldrich）的CAS 號為501-36-0，分子式為C14H12O3，分子量為228.24。STZ（V900890，Sigma Aldrich）CAS 號18883-66-4，分子式C8H15N3O7，分子量265.22。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會審核批準(zhǔn)（No.2018-065）。本研究共使用40 只SD 大鼠（購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），全程飼養(yǎng)于以下標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：溫度25 ℃、濕度60%，光/暗循環(huán)12 h，自由飲水、自由采食普通飼料。對照組大鼠（n=8）于建模第1 天腹腔注射檸檬酸緩沖液（1 mL，pH=3.5）1 次。STZ 誘導(dǎo)糖尿病組大鼠（n=32）于建模第1 天腹腔注射用檸檬酸緩沖溶液（pH=3.5）配制的STZ 溶液，注射劑量為15 mg/kg。建模第2 天，注射STZ 的大鼠空腹血糖水平超過20 mg/dL，即STZ 成功誘導(dǎo)大鼠糖尿病表型，直至第35 天，大鼠出現(xiàn)微量蛋白尿，則表示STZ 誘導(dǎo)早期DKD 大鼠建模完成[13]。第36 天起開始藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)，對照組大鼠連續(xù)10 d，每天用1 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）灌胃。另將STZ 誘導(dǎo)的早期DKD 大鼠分為4 組（n=8），連續(xù)10 d，分別給予1 mL PBS、白藜蘆醇（15 mg/kg）、雷米普利（10 mg/kg）、白藜蘆醇（15 mg/kg）+雷米普利（10 mg/kg）灌胃，每天1 次。劑量根據(jù)課題組以前的工作或其他參考資料選擇[7，14]。第45 天，所有大鼠在5%異氟烷麻醉情況下完成心臟采血，處死后采集組織標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)的蛋白質(zhì)樣品制備及分析，病理標(biāo)本制備及血液學(xué)分析。

1.3 血液學(xué)分析在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的最后一天采集新鮮的血清，并經(jīng)由檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室（廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院）鑒定。分析參數(shù)為血清葡萄糖（serum glucose）、血清總蛋白（serum total protein）、血清肌酐（serum Cre）、血清糖化血紅蛋白（HbA1c）、血清血管緊張素（serum AngⅡ）。

1.4 病理標(biāo)本制備及檢查分析大鼠腎臟組織浸泡于3.9%福爾馬林溶液中，于第3 天更換1 次福爾馬林溶液。在福爾馬林溶液中保存10 d 后，組織分別在60%、70%、80%、90%和100%的乙醇梯度脫水，接著石蠟包埋后制作成厚度為5 μm 的切片，切片通過二甲苯浸泡脫蠟，然后再通過100%、90%、80%、70%和60%的乙醇梯度再水化。組織切片采用Masson's trichrome 染色，并使用P250 FLASH系統(tǒng)（3DHISTECH，Ltd.，Budapest，Hungary）拍攝獲取圖像數(shù)據(jù)，再使用CaseViewer v2.1 版軟件（3DHISTECH，Ltd.，Budapest）將圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。每個(gè)切片的硬化腎小球數(shù)和總腎小球數(shù)經(jīng)鑒定后，計(jì)算腎小球硬化/腎小球比率。

1.5 蛋白分析將大鼠腎組織加入蛋白提取液（PRO-PREP，iNtRON Biotechnology，Korea）后置于冰上勻漿。接著在4 ℃以14 000 r/min 離心30 min（離心半徑10 cm）后收集上清液，以牛血清白蛋白（BSA，1 mg/mL）作為標(biāo)準(zhǔn)對照，使用考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑（Kenlor Industries，Santa Ana，California）測定蛋白質(zhì)濃度。接著所有的蛋白樣本采用Western Blot 法進(jìn)行蛋白電泳進(jìn)行層析分離。經(jīng)過電泳層析分離后的蛋白再使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，再使用5%BSA 溶液中孵育60 min 并使用以下一抗進(jìn)行識別：TGF-β（#3711）、p-p38（#4511）、 p38（#2371）、 p- JNK（#4668）、 JNK（#3708）、p-Smad2（#8828）、GAPDH（#5174）、TGFβ- R（#5544）、 RhoA（#2117）、 ROCK2（#9029）、SirT1（#9475）、p-FoxO3（#9466）和FoxO3（#12829），以上抗體均購自 Cell Signaling Technology 公司（Danvers，Massachusetts）。接著將聚偏二氟乙烯膜清洗后添加辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗，如抗兔IgG（#7074，Cell Signaling Technology）或抗小鼠IgG（#7076，Cell Signaling Technology）孵育30 min 再清洗干凈，最后添加化學(xué)發(fā)光劑后，使用化學(xué)發(fā)光成像儀las4000（GE Healthcare UK，Ltd.）拍攝目標(biāo)蛋白的條帶圖像數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Sigmaplote v10.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素方差分析（ANOVA）對多組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P值小于0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病理切片檢查比較見圖1。各組大鼠腎臟切片使用Masson 染色檢視腎小球纖維化（硬化）的情況（圖1A）。腎小球纖維化數(shù)量與腎小球數(shù)量比值（圖1B）則顯示了STZ 誘導(dǎo)早期DKD 病情的惡化程度。STZ 誘導(dǎo)早期DKD 大鼠的腎小球周圍有明顯的纖維化特征而且腎小球纖維化數(shù)量與腎小球數(shù)量比值高于其他各組（P＜0.05）。對照組的大鼠腎小球周圍則無纖維化的情況發(fā)生。白藜蘆醇治療組大鼠腎小球纖維化的程度有輕微減少。雷米普利和雷米普利-白藜蘆醇二藥聯(lián)用治療組大鼠的大鼠腎小球周圍則幾乎沒有纖維化的情況發(fā)生，腎小球纖維化數(shù)量與腎小球數(shù)量比值也與對照組無顯著差異。

圖1 大鼠腎臟病理切片Masson 染色

2.2 各組血液檢查結(jié)果比較見圖2。各組血清葡萄糖和血清HbA1c 結(jié)果分析表明，STZ 誘導(dǎo)DKD 組的大鼠血糖與HbA1c 均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而白藜蘆醇[15 mg/（kg·d）]、雷米普利[10 mg/（kg·d）]的單藥治療組與STZ 誘導(dǎo)DKD 組的血糖與HbA1c 相比則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是白藜蘆醇[15 mg/（kg·d）]和雷米普利[10 mg/（kg·d）]聯(lián)用治療組的大鼠血糖和HbA1c 均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而各組的血清總蛋白、肌酐、血管緊張素比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 各組血液檢查結(jié)果比較

2.3 各組蛋白信號通路分析結(jié)果比較見圖3。STZ誘導(dǎo)早期DKD 大鼠的TGF-β/p-p38/p-JNK/p-Smad2/CTGF 信號通路（圖3A）蛋白表達(dá)并未明顯增加，而TGF-β-R/RhoA/ROCK2 信號通路（圖3B）蛋白表達(dá)則明顯增加。此外，在藥物干預(yù)組別，包含白藜蘆醇治療組、雷米普利治療組、雷米普利-白藜蘆醇聯(lián)用治療組的大鼠腎臟組織樣本中的RhoA、ROCK2 的蛋白表達(dá)量均有降低，其中雷米普利-白藜蘆醇聯(lián)用治療組的RhoA、ROCK2 的蛋白水平幾乎與對照組相同。此外，白藜蘆醇是Sirt-1 蛋白的激動(dòng)劑，因此本研究額外分析了Sirt-1/p-FOXO3 信號通路（圖3C），結(jié)果表明僅有白藜蘆醇治療組、雷米普利-白藜蘆醇聯(lián)用治療組的大鼠腎臟組織樣本中Sirt-1、p-FOXO3 表達(dá)與對照組相比有明顯增加，但是與腎小球纖維化無明顯關(guān)聯(lián)。

圖3 大鼠腎臟組織蛋白電泳分析結(jié)果

3 討論

通過檢測STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血清葡萄糖和HbA1c 水平，結(jié)果提示糖尿病大鼠建模成功。Masson 染色顯示腎小球硬化率在各組間有類似的表現(xiàn)。這一發(fā)現(xiàn)表明早期DKD 可在出現(xiàn)高血糖（糖尿病確診）的癥狀后的短時(shí)間內(nèi)開始出現(xiàn)，不應(yīng)被認(rèn)為是一種慢性疾病。

DKD 的主要病理特征是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，臨床上早期DKD 患者的癥狀為微量白蛋白尿，血糖的管理和控制是目前的主要治療策略[15]。臨床研究表明，高血糖可誘發(fā)早期DKD 出現(xiàn)微量蛋白尿，氧化應(yīng)激、腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)積累促進(jìn)早期DKD 向慢性腎病和腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)展[16]。出現(xiàn)微量白蛋白尿則表示腎臟功能已經(jīng)受損，即使患者能夠很好的控制血糖，而此階段的腎臟損傷能否復(fù)原尚無定論。

越來越多的證據(jù)表明腎小球的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變是早期DKD 的診斷指標(biāo)，有研究表明，TGF-β1 和p-Smad2/3 水平在DKD 中升高[17]，DKD 中膠原蛋白和纖維連接蛋白的水平也升高。事實(shí)上，Masson 染色顯示膠原在DKD 早期積聚（圖1）。白藜蘆醇組CTGF 表達(dá)略有升高，在雷米普利-白藜蘆醇聯(lián)合治療組中降低，提示雷米普利似乎對CTGF 有一定的調(diào)節(jié)作用（圖3）。因此，白藜蘆醇和雷米普利的聯(lián)合治療可抑制CTGF 的表達(dá)來改善CTGF 的纖維化作用。TGF-β 信號通路分析表明，TGF-β 信號通路與早期DKD 密切相關(guān)，進(jìn)一步分析顯示RhoA/ROCK 信號通路在DKD 早期顯著失調(diào)（圖3）。

內(nèi)皮功能障礙是DKD 出現(xiàn)早期癥狀的主要原因，也可能是DKD 進(jìn)展的原因之一。RhoA 是一種小GTP 酶蛋白，其直接下游靶標(biāo)Rho 激酶（ROCK）控制多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。有研究發(fā)現(xiàn)某些藥物可通過減少活性氧（ROS）來抑制RhoA/ROCK 信號通路，從而顯著阻止了高血糖破壞的腎內(nèi)皮屏障功能，這是由Nrf2 的激活介導(dǎo)的[18]。RhoA/ROCK 和NF-κB 信號通路均在DKD 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Xie X等[19]的研究表明ROCK 抑制劑法舒地爾治療可抑制RhoA/ROCK 活化和NF-κB 核轉(zhuǎn)位，并顯著降低腎FN、ICAM-1 和TGF-β1 蛋白水平，RhoA/ROCK 通路可能調(diào)節(jié)NF-κB 上調(diào)炎癥基因并介導(dǎo)DKD 的發(fā)展。Shu A 等[20]研究發(fā)現(xiàn)梓醇顯著抑制AGEs 受體（RAGE）過表達(dá)DKD 小鼠的RAGE/Ras 同源基因家族成員A（RhoA）/ROCK 通路，表明梓醇可通過抑制RAGE/RhoA/ROCK 通路改善內(nèi)皮功能障礙和炎癥，從而延緩DKD 的進(jìn)展。

ROCK 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，ROCK1 和ROCK2 參與肌動(dòng)球蛋白細(xì)胞的骨架重塑和上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化。有報(bào)道稱ROCK1 是DKD 發(fā)病機(jī)制中的重要因素，在DKD 動(dòng)物模型中，抑制ROCK1 的表達(dá)，可以減少小鼠的蛋白尿以及延緩DKD 的發(fā)展[21-22]。

本課題組前期的研究中也發(fā)現(xiàn)高血糖直接誘導(dǎo)緊密連接蛋白的增加，可能激活RhoA/ROCK1 通路，導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙；抑制RhoA/ROCK 通路，可減弱由高血糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞的高張力[23]，而白藜蘆醇已被報(bào)道用于控制血糖水平和降低患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[24]，有趣的是，STZ 誘導(dǎo)的DM（圖2），白藜蘆醇、雷米普利和雷米普利-白藜蘆醇聯(lián)合治療組在RhoA/ROCK2 信號通路中出現(xiàn)了類似的變化。

有研究表明，白藜蘆醇通過激活SIRT1/FOXO1信號通路上調(diào)腎皮質(zhì)自噬水平參與保護(hù)腎臟足細(xì)胞，從而阻止蛋白尿生成[25]。白藜蘆醇被證明可以通過激活Sirt-1 來增強(qiáng)FOXO3 磷酸化[26]，Sirt-1 也被報(bào)道在減輕DM 白蛋白尿中有重要作用[27]。本研究發(fā)現(xiàn)在STZ 誘導(dǎo)的DM 大鼠中，Sirt-1 和p-FOXO3水平僅在白藜蘆醇和雷米普利-白藜蘆醇聯(lián)合治療組中升高，在PBS 組及雷米普利治療組中無變化（圖3）。

中藥虎杖干預(yù)DM 動(dòng)物模型能降低其DM 的發(fā)生率和死亡率，大量研究表明，虎杖中的主要成分白藜蘆醇具有擴(kuò)血管、抗血栓、降血脂及對自由基系統(tǒng)引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有很強(qiáng)的抑制作用[28]，由此，課題組希望在早期DKD 階段，給予中藥虎杖干預(yù)，或許能夠盡早控制血糖，抑制DKD 的進(jìn)展，將中藥藥理研究成果與臨床應(yīng)用有機(jī)地結(jié)合起來，不斷發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)藥物新的治療用途，為早期DKD 的治療尋找有效的中西藥結(jié)合方法。

綜上所述，通過觀察白藜蘆醇、雷米普利在早期STZ 誘導(dǎo)的短期DM 動(dòng)物模型中的作用，發(fā)現(xiàn)早期DKD 可能由腎皮質(zhì)病變中的部分腎小球硬化引起，正常的腎小球功能代償性增強(qiáng)，并引起腎小球高過濾。這一發(fā)現(xiàn)表明，DKD 的治療應(yīng)在早期開始。早期DKD 腎小球硬化中上調(diào)的主要途徑可能是RhoA/ROCK 信號通路，而不是TGF-β 信號通路。白藜蘆醇和雷米普利治療可略微減慢DKD 進(jìn)展，白藜蘆醇-雷米普利聯(lián)合治療可能通過減弱RhoA/ROCK通路顯著減少STZ 誘導(dǎo)的早期DKD 大鼠的腎小球硬化。