張偉偉 呂建建 李玉坤 初凡智 高保全 劉 萍

三疣梭子蟹基因克隆及其在免疫中的功能研究*

張偉偉1, 2呂建建2李玉坤1, 2初凡智1, 2高保全2劉 萍2①

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 海水養(yǎng)殖生物育種與可持續(xù)產(chǎn)出全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266071)

克隆了三疣梭子蟹TLR家族的一個(gè)新基因, 將其命名為。該基因全長(zhǎng)為4 034 bp, 預(yù)測(cè)分子量為109.078 kDa, 理論等電點(diǎn)為6.06, 共編碼977個(gè)氨基酸。SMART預(yù)測(cè)顯示,具有Toll樣受體典型的結(jié)構(gòu)域, 包括前端的序列區(qū)(LRR)、跨膜區(qū)(TM)和胞內(nèi)(TIR)區(qū), 進(jìn)化樹分析表明其與同屬節(jié)肢動(dòng)物門的果蠅聚為一支。組織表達(dá)分布結(jié)果顯示,在肝胰腺中特異性地高表達(dá), 其次表達(dá)于腸道, 在鰓中的表達(dá)量最低。采用3種PAMPs進(jìn)行注射刺激, 發(fā)現(xiàn)對(duì)脂多糖的響應(yīng)最為強(qiáng)烈, 在感染48 h后的表達(dá)量為對(duì)照組的上千倍, 推測(cè)其可能為基因主要識(shí)別的病原相關(guān)分子模式。在人工感染副溶血弧菌后的12 h開始上調(diào)表達(dá), 至24 h達(dá)到峰值(上調(diào)9.02倍)。采用RNAi敲降后, MyD88的表達(dá)量相應(yīng)下調(diào), 同時(shí)發(fā)現(xiàn)感染副溶血弧菌后的死亡率顯著提高, 為陰性對(duì)照組的1.8倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:基因在抗副溶血弧菌中發(fā)揮重要功能。本實(shí)驗(yàn)對(duì)解析三疣梭子蟹抵御病原入侵的分子機(jī)制具有重要指導(dǎo)作用。

三疣梭子蟹; Toll樣受體; 模式識(shí)別受體; 病原相關(guān)分子模式

三疣梭子蟹()隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬(), 地理分布集中在我國渤海、黃海, 以及日本等海域, 肉多且脂膏肥美, 具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(戴愛云等, 1977; 薛俊增等, 1997)。隨著人工養(yǎng)殖的規(guī)模逐漸擴(kuò)大, 苗種參差不齊,導(dǎo)致病害嚴(yán)重, 給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。副溶血弧菌()是三疣梭子蟹主要的致病菌之一, 可以誘導(dǎo)肝胰腺壞死病等多種病癥, 該病原可引發(fā)梭子蟹生長(zhǎng)緩慢、嗜睡、空腹、空腸, 最終致其死亡(郝景偉等, 2019; 霍詩天等, 2022)。與哺乳類動(dòng)物不同的是, 三疣梭子蟹沒有B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞, 缺少獲得性免疫系統(tǒng)。在應(yīng)對(duì)病原入侵時(shí), 只能依賴于與生俱來的先天性免疫系統(tǒng), 通過免疫信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)識(shí)別清除病原的作用(Uematsu, 2008)。因此, 研究其先天性免疫機(jī)理對(duì)三疣梭子蟹抗病以及新品種培育有著重要意義。

Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)等模式識(shí)別受體(Pathogen recognize receptor, PRR)能夠在病原刺激中介導(dǎo)三疣梭子蟹等甲殼動(dòng)物的先天免疫, 各類PRR都能通過識(shí)別病原中某種保守的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern, PAMPs), 啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答(Carty, 2010)。TLR家族基因具有高度的保守性, 在漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化歷程中末端的TIR結(jié)構(gòu)域都高度同源, 且Toll蛋白均屬于Ⅰ型跨膜結(jié)構(gòu)蛋白。其結(jié)構(gòu)包括胞外在免疫中起到關(guān)鍵識(shí)別作用的序列區(qū)(LRR)、跨膜區(qū)(TM)和與白介素受體高度同源的胞內(nèi)區(qū)(TIR) (Slack, 2000; 章曉聯(lián)等, 2002; Uribe, 2011)。TLR家族下信號(hào)通路主要有兩種依賴途徑, 一條是MyD88 (髓樣分化因子88)依賴途徑, 另一條是非依賴MyD88途徑, 通過TRIF進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), MyD88與TRIF都屬于TLR的下游接頭分子(Yamamoto, 2002; Tang, 2012)。目前在甲殼動(dòng)物中, TLRs家族基因都只進(jìn)行了一些基礎(chǔ)性的研究, 如Yang等(2007)在凡納濱對(duì)蝦()中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Toll樣受體, 命名為, 這是在甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的首個(gè)TLR家族基因。另外, 在三疣梭子蟹中已克隆了5個(gè)TLR基因并初步分析其在病原脅迫后的表達(dá)模式(Zhou, 2015; 張杰, 2017)。然而, 相比哺乳類(王有琴等, 2021; 章琳俐等, 2021)和昆蟲類(Yagi, 2010), 甲殼動(dòng)物TLR基因的研究基礎(chǔ)相對(duì)薄弱, 主要體現(xiàn)在: (1) 尚不明確其識(shí)別的PAMPs, (2) 缺乏必要的功能驗(yàn)證研究, (3) 對(duì)其分子調(diào)控通路解析不足。

本實(shí)驗(yàn)克隆了三疣梭子蟹基因, 分析了該基因的組織表達(dá)分布特征, 明確了其主要識(shí)別的PAMPs。初步驗(yàn)證了基因在抗副溶血弧菌感染中具有一定作用, 可能依賴MyD88途徑發(fā)揮免疫功能。研究結(jié)果為深入解析甲殼動(dòng)物TLR基因的功能提供依據(jù), 同時(shí)可為三疣梭子蟹抗病良種培育提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品的采集

實(shí)驗(yàn)所用的三疣梭子蟹取自于山東省昌邑市海豐水產(chǎn)公司。在飼養(yǎng)至80日齡時(shí), 選取健康有活力的三疣梭子蟹[體重為(30±5) g], 將其置于一個(gè)20 m3的混凝土池塘中暫養(yǎng)7 d, 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)條件保持晝夜水溫(25±3) °C, 鹽度35, pH 8.7。每天對(duì)水體進(jìn)行換水, 換水量為1/3, 并定時(shí)喂食新鮮雜魚, 實(shí)驗(yàn)全程于此公司實(shí)驗(yàn)車間進(jìn)行。

在室內(nèi)水泥池暫養(yǎng)7 d后, 隨機(jī)選取9只暫養(yǎng)的健康三疣梭子蟹, 分別采集心臟、表皮、胃、腸、腦、肝胰腺、鰓、眼柄、血淋巴、肌肉共10個(gè)不同的組織, 置于液氮中保存, 用于合成RACE模板和的組織表達(dá)分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取、cDNA和RACE模板合成 取上述三疣梭子蟹10個(gè)不同的組織各50 mg, 按照TRIzol?Reagent (Roche公司)方法進(jìn)行總RNA提取, 并利用紫外分光光度計(jì)(NanoDrop2000, Thermo)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA的質(zhì)量和濃度。

選取不同組織高質(zhì)量的RNA, 使用HiScript II Q RT Super Mixfor qPCR (+gDNA wiper) kit (諾維贊, 南京)合成cDNA。將各組織中高質(zhì)量的總RNA均勻混合, 使用SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit (TaKaRa, 日本)合成3′和5′ RACE cDNA模板。

1.2.2 三疣梭子蟹的cDNA全長(zhǎng)的克隆、序列及進(jìn)化分析 根據(jù)從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的三疣梭子蟹基因組數(shù)據(jù)庫中篩選驗(yàn)證得到的基因EST序列, 利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)的3′和5′ RACE特異性引物及通用引物并由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。使用TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity (HiFi)高保真聚合酶(全式金生物, 北京)參照說明書進(jìn)行RACE 3′和5′末端巢式PCR擴(kuò)增, 將PCR產(chǎn)物回收純化并進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化, 挑取單克隆, 經(jīng)菌落PCR鑒定后篩選目的菌液送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序, 參照宋柳等(2019)。

通過ContigExpress軟件將克隆序列與EST序列進(jìn)行拼接、驗(yàn)證, 得到基因的 cDNA全長(zhǎng), 分別采用NCBI-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)、ORFFinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/)在線網(wǎng)站對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析及開放閱讀框(ORF)的預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域利用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用DNAMAN軟件將與甲殼動(dòng)物中的TLR基因進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì), 并通過MEGA軟件對(duì)進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.2.3 三疣梭子蟹的組織表達(dá)分析 將不同個(gè)體相同組織的cDNA等濃度混合, 用于組織表達(dá)分析。根據(jù)已獲得的cDNA全長(zhǎng)序列, 通過PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性引物, 內(nèi)參基因選用β-actin (表1), 具體PCR實(shí)驗(yàn)體系及方法參考宋柳等(2019)。使用SPSS19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析, 借助OriginPro將統(tǒng)計(jì)結(jié)果整理形成圖表,0.05為顯著差異,0.01為極顯著性差異。

1.2.4 病原相關(guān)分子模式刺激 隨機(jī)選擇120只經(jīng)過室內(nèi)暫養(yǎng)后大小一致、健康有活力的三疣梭子蟹, 平均分成4組, 各組分別注射1×PBS緩沖液100 μL、1 mg/mL脂多糖100 μL、1 mg/mL肽聚糖100 μL以及1 mg/mL Poly IC 100 μL。在注射后0、12、24、48、72 h, 每組分別隨機(jī)選取3只三疣梭子蟹, 取肝胰腺組織置于液氮中保存, 用于RNA提取。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物序列

Tab.1 The sequence of primers used in the experiment

1.2.5 副溶血弧菌感染 隨機(jī)將60只室內(nèi)暫養(yǎng)后大小一致、健康有活力的三疣梭子蟹, 平均分成2組(攻毒組和對(duì)照組)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組為注射無菌的海洋甲殼動(dòng)物生理鹽水, 攻毒組為注射副溶血弧菌, 濃度依據(jù)張杰等(2017)報(bào)道注射副溶血弧菌的濃度(2.6×107CFU/mL)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。劑量均為1 μL/g (體重)。在自然海水以及最適溫度下, 72 h半致死, 而對(duì)照組沒有死亡情況出現(xiàn), 此劑量濃度作為正式實(shí)驗(yàn)使用。

選取180只三疣梭子蟹進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn), 平均分為兩組即實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組, 在梭子蟹游泳足的第一關(guān)節(jié)基部處進(jìn)行注射(謝建軍等, 2011; Ren, 2017)。實(shí)驗(yàn)組注射2.6×107CFU/mL的副溶血弧菌, 對(duì)照組注射海洋甲殼動(dòng)物生理鹽水, 劑量均為1 μL/g。副溶血弧菌懸液參照竇全偉等(2018)的方法提取制備。分別在注射后0、12、24、48、72 h, 每組各隨機(jī)取3只三疣梭子蟹的肝胰腺組織于液氮中保存, 用于RNA提取。

1.2.6基因RNAi實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)通過生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)的干擾序列進(jìn)行位點(diǎn)篩選, 最后確定具有干擾效果的一對(duì)序列由公司合成(表2)。

RNAi實(shí)驗(yàn)共分為4組各60個(gè)個(gè)體: 實(shí)驗(yàn)組(注射siRNA)、陰性對(duì)照組(注射NC siRNA)、空白對(duì)照組(注射生理鹽水)、陽性對(duì)照組(注射生理鹽水)。將siRNA濃度稀釋為1 μg/μL, 陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組根據(jù)三疣梭子蟹個(gè)體的體重進(jìn)行注射(注射量為1 μg/g); 空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組根據(jù)三疣梭子蟹個(gè)體的體重進(jìn)行注射生理鹽水(注射量為1 μL/g)。在注射后0、24、48、72 h, 分別取空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組3只三疣梭子蟹的肝胰腺組織于液氮中保存, 用于干擾效率檢測(cè)。

在RNAi實(shí)驗(yàn)24 h后, 4組各取30個(gè)個(gè)體進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn), 按體重注射(注射量為1 μL/g): 空白對(duì)照組注射1×PBS緩沖液; 其他3個(gè)組注射2.6×107CFU/mL副溶血弧菌。實(shí)驗(yàn)每3 h統(tǒng)計(jì)一次死亡數(shù)。在0、12、24、48、72 h, 每組分別選取3只依然存活的三疣梭子蟹解剖取肝胰腺組織存于液氮中保存。

1.2.7 接頭分子的實(shí)時(shí)熒光定量分析 利用材料1.2.2方法, 得到了MyD88與TRIF的cDNA序列, 并設(shè)計(jì)了qRT-PCR引物, 所用引物如表3, 使用1.2.6中RNAi材料, 對(duì)其下游接頭分子進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。

表2 本研究所用雙鏈RNA

Tab.2 The double-stranded RNA used in the experiment

表3 實(shí)驗(yàn)所用的引物序列

Tab.3 The sequence of primers used in the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 PtToll6基因cDNA全長(zhǎng)及序列結(jié)構(gòu)特征

的cDNA全長(zhǎng)為4 034 bp, 其中包括129 bp的5′ UTR, 2 934 bp的ORF區(qū)域, 和1 100 bp的3′ UTR, 預(yù)測(cè)分子量為109.078 kDa, 理論等電點(diǎn)為6.06, 共編碼977個(gè)氨基酸(圖1)。利用SMART在線預(yù)測(cè)分析網(wǎng)站以及DNAMAN軟件對(duì)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)、序列比對(duì)分析。結(jié)果顯示,具有Toll樣受體蛋白的重要結(jié)構(gòu)域: LRR、TIR (圖2), 且與其他甲殼動(dòng)物Toll具有高度同源的TIR保守區(qū), 而胞外的LRR較為復(fù)雜多樣(圖3)。三疣梭子蟹與其他Toll的序列同源性較低, 同源性為8.42%～17.92%, 其中同源性最高的是克氏原螯蝦(), 同源性為17.92%。利用MEGA 5.0軟件對(duì)基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析, 圖4結(jié)果顯示,沒有與親緣關(guān)系近的甲殼動(dòng)物聚在一起, 反而是與同屬節(jié)肢動(dòng)物門的果蠅單獨(dú)聚為一支(以紅色圓點(diǎn)表示)。在已發(fā)表的三疣梭子蟹中, 有兩個(gè)分別與親緣關(guān)系較近的中華絨螯蟹()、擬穴青蟹()聚在一起, 而其他三疣梭子蟹Toll都是與果蠅Toll聚在一起(已發(fā)表的三疣梭子蟹Toll以紅色圓圈表示)。

圖1 PtToll6基因cDNA全長(zhǎng)及氨基酸序列

2.2 PtToll6的組織表達(dá)分布

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù), 分析了在不同組織中的相對(duì)表達(dá)情況。如圖5所示,在心臟、表皮、胃、腸、腦、肝胰腺、鰓、眼柄、血淋巴、肌肉這10個(gè)組織中均有表達(dá)。其中,在肝胰腺中特異性地高表達(dá), 其次在腸以及腦中的表達(dá)量相對(duì)較高, 在鰓組織中的表達(dá)量最低。

圖2 PtToll6基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域位置

圖4 PtToll6的系統(tǒng)進(jìn)化樹

注:以紅色圓點(diǎn)表示; 已發(fā)表的三疣梭子蟹Toll以紅色圓圈表示

圖5 PtToll6基因在不同組織中的表達(dá)分析

注: H: 心臟; Hp: 肝胰腺; E: 眼柄; M: 肌肉; B: 血細(xì)胞; G: 鰓; S: 胃; C: 表皮; I: 腸; Br: 腦

2.3 病原相關(guān)分子刺激后PtToll6的表達(dá)規(guī)律

利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)PAMPs刺激的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行分析。從圖6中可以發(fā)現(xiàn), 在肝胰腺組織中, 脂多糖以及 Poly IC 的刺激均使基因的表達(dá)顯著上調(diào)(<0.05), 且都在48 h達(dá)到峰值, 72 h開始回落, 但對(duì)脂多糖的響應(yīng)更加強(qiáng)烈(對(duì)照組的上千倍)。在肽聚糖的刺激下,基因在12 h、24 h下調(diào), 但在48 h出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象(<0.05)。

圖6 不同PAMPs刺激下PtToll6基因的表達(dá)分析

注: *表示差異顯著(<0.05), **表示差異極顯著(<0.01)。下同

2.4 副溶血弧菌感染后PtToll6及其接頭分子的表達(dá)特征

在副溶血弧菌的感染下,在三疣梭子蟹的肝胰腺中呈顯著上調(diào)表達(dá)(<0.05), 12 h顯著上調(diào)至0 h的2.74倍, 于24 h上調(diào)至9.02倍達(dá)到峰值, 后有回落又小幅上調(diào)(圖7)。 MyD88也在感染下呈上調(diào)表達(dá)(<0.05), 在72 h達(dá)到峰值為0 h的11.4倍。而TRIF在感染后則是下調(diào)趨勢(shì)(圖8)。

圖7 副溶血弧菌刺激后PtToll6基因的表達(dá)變化情況

圖8 副溶血弧菌刺激后PtToll6接頭分子的表達(dá)變化情況

2.5 功能驗(yàn)證

RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 注射雙鏈RNA后, 三疣梭子蟹基因在24 h、48 h都呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá), 差異顯著(<0.05), 產(chǎn)生敲降效果, 24 h的干擾效率大于99% (圖9)。RNAi試驗(yàn)后死亡率統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖10), 陽性對(duì)照組的死亡率為50%, NC陰性對(duì)照組的死亡率為53.34%, 而實(shí)驗(yàn)組的死亡率為93.34%, 結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組死亡率顯著升高, 為陰性對(duì)照組的1.8倍(<0.05)。

2.6 PtToll6的下游接頭分子驗(yàn)證

在敲降后, MyD88的表達(dá)也受到了抑制, 24 h至72 h之間幾乎不表達(dá), 具有明顯的干擾效果, 而TRIF在24 h與72 h都呈上調(diào)趨勢(shì)(圖11)。

圖9 PtToll6基因干擾后的表達(dá)分析

注: 對(duì)照組為注射的序列打亂的雙鏈RNA, 實(shí)驗(yàn)組為注射的干擾序列。下同

圖10 干擾后三疣梭子蟹在感染下的死亡率

圖11 接頭分子干擾后的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

先天免疫是三疣梭子蟹等無脊椎動(dòng)物抵抗外界病原入侵的重要防御機(jī)制, 主要由胚系基因所編碼的PRR所介導(dǎo), 其中TLR是一種在病原入侵后發(fā)揮識(shí)別和清除功能的重要 PRR (Carty, 2010)。本實(shí)驗(yàn)克隆了三疣梭子蟹基因的cDNA全長(zhǎng)序列, 并預(yù)測(cè)了其編碼蛋白結(jié)構(gòu)域。與已發(fā)表的5個(gè)三疣梭子蟹TLR基因相比,沒有LRR-CT (C端-LRR), LRR僅有8個(gè), 是該物種中已知LRR數(shù)量最少的TLR基因(Zhou, 2015; 張杰, 2017)。LRR結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著TLR基因識(shí)別PAMPs的功能, 不同的LRR結(jié)構(gòu)域賦予了TLR基因能特異性識(shí)別病原相關(guān)分子模式的能力(Johnson, 2003)。具有較少的LRR的特征可能與其識(shí)別特定的PAMPs相關(guān)。

三疣梭子蟹在肝胰腺中特異性地高表達(dá), 這與已發(fā)表的其他三疣梭子蟹 TLR 基因主要在血淋巴、鰓組織等組織高表達(dá)不同(Zhou, 2015; 張杰, 2017)。肝胰腺是甲殼動(dòng)物解毒代謝和免疫調(diào)節(jié)的主要組織(R?szer, 2014; Xu, 2020), 推測(cè)可能在該組織中發(fā)揮重要的免疫功能。為了明確所識(shí)別的PAMPs, 我們采用脂多糖、肽聚糖、Poly IC進(jìn)行注射刺激, 發(fā)現(xiàn)3種PAMPs均能誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)。值得注意的是對(duì)脂多糖的響應(yīng)最為強(qiáng)烈, 在感染48 h后肝胰腺中的表達(dá)量上調(diào)上千倍, 表明脂多糖是主要識(shí)別的PAMPs。

副溶血弧菌屬于典型的革蘭氏陰性菌, 而脂多糖(又稱內(nèi)毒素)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜中的主要成分(于耕紅等, 2011; 霍詩天等, 2022)。為了探究TLR 6是否能夠識(shí)別含有脂多糖的副溶血弧菌, 本研究進(jìn)行了梭子蟹人工感染副溶血弧菌的實(shí)驗(yàn)。qPCR結(jié)果顯示在副溶血弧菌感染12 h后開始上調(diào)表達(dá), 至24 h達(dá)到峰值, 表明其可以識(shí)別并響應(yīng)該病原的入侵。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其在抗副溶血弧菌中的功能, 我們采用RNAi技術(shù)成功敲降了的表達(dá)。對(duì)比不同組別人工感染副溶血弧菌的死亡率, 發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的死亡率顯著高于陰性對(duì)照組(1.8倍), 表明基因的確在抗副溶血弧菌中發(fā)揮了重要的免疫作用。

我們分析了敲降后下游兩種接頭分子的表達(dá)情況, 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MyD88與趨勢(shì)相同, 在24 h、48 h被抑制表達(dá), 而TRIF的表達(dá)沒有被抑制。在副溶血弧菌感染實(shí)驗(yàn)中, MyD88也與趨勢(shì)相同, 呈上調(diào)表達(dá), 而TRIF則是下調(diào)趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,主要依賴MyD88途徑, MyD88是其下游通路的接頭分子。有研究表明, MyD88在副溶血弧菌感染中發(fā)揮了重要免疫功能, 如南美白對(duì)蝦()在用脂多糖、金黃色葡萄菌和WSSV等刺激后, LvMyD88上調(diào)表達(dá), 在天然免疫中可能發(fā)揮了作用(Zhang, 2012)。在櫛孔扇貝(), 經(jīng)過脂多糖、肽聚糖處理后, MyD88在原代培養(yǎng)的血細(xì)胞中也上調(diào)表達(dá)(Qiu, 2007)。本實(shí)驗(yàn)中, MyD88同樣在副溶血弧菌感染下呈上調(diào)表達(dá), 一定程度地參與了天然免疫進(jìn)程。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了三疣梭子蟹基因cDNA全長(zhǎng)序列并分析了該基因的功能結(jié)構(gòu)域和物種進(jìn)化關(guān)系。通過分析基因的組織表達(dá)、不同PAMPs刺激后的表達(dá)、病原感染下的表達(dá)特征以及RNAi后的死亡率, 探究了該基因在三疣梭子蟹天然免疫中的功能以及初步明確了其下游接頭分子。研究結(jié)果有助于全面解析三疣梭子蟹中TLR家族的免疫機(jī)制。

于耕紅, 范昕, 馮詠梅, 2011. 潰瘍性結(jié)腸炎患者CA125及內(nèi)毒素檢測(cè)價(jià)值的探討[J]. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 10(11): 827-829.

王有琴, 黃飛, 張睿, 等, 2021. 柯里拉京對(duì)小鼠單純皰疹病毒性腦炎Toll樣受體3-干擾素誘導(dǎo)鏈接蛋白通路的調(diào)控機(jī)制研究[J]. 兒科藥學(xué)雜志, 27(5): 1-5.

宋柳, 呂建建, 王磊, 等, 2019. 三疣梭子蟹幾丁質(zhì)酶基因()的克隆及其在免疫中的功能分析[J]. 海洋與湖沼, 50(5): 1080-1090.

張杰, 2017. 三疣梭子蟹Toll、HMGB家族基因在先天免疫中的功能研究[D]. 上海: 上海海洋大學(xué): 35-36.

張杰, 呂建建, 劉萍, 等, 2017. 三疣梭子蟹基因克隆及其應(yīng)答不同病原入侵的表達(dá)特征[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 41(6): 1193-1199.

郝景偉, 高保全, 王崇, 等, 2019. 致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(AHPND)自然感染三疣梭子蟹[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 43(7): 1647-1660.

章曉聯(lián), 潘勤, 2002. Toll樣受體在免疫學(xué)方面的研究進(jìn)展[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 18(5): 670-672.

章琳俐, 辛清武, 李麗, 等, 2021. TLRs在雄性動(dòng)物生殖中的生物學(xué)功能[J]. 福建畜牧獸醫(yī), 43(2): 22-24.

謝建軍, 許文軍, 施慧, 等, 2011. 溶藻弧菌誘導(dǎo)對(duì)三疣梭子蟹血淋巴非特異性免疫水平的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 35(9): 1392-1398.

竇全偉, 李吉濤, 劉萍, 等, 2018. 脊尾白蝦血藍(lán)蛋白大亞基基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 42(1): 86-93.

薛俊增, 堵南山, 賴偉, 等, 1997. 中國三疣梭子蟹Miers的研究[J]. 東海海洋, 15(4): 61-66.

霍詩天, 焦厚琪, 李清, 等, 2022. 克氏原螯蝦副溶血弧菌的分離鑒定及藥敏特性[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 43(1): 124-129.

戴愛云, 馮鐘琪, 宋玉枝, 等, 1977. 三疣梭子蟹漁業(yè)生物學(xué)的初步調(diào)查[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志, (2): 30-39.

CARTY M, BOWIE A G, 2010. Recent insights into the role of Toll-like receptors in viral infection [J]. Clinical and Experimental Immunology, 161(3): 397-406.

JOHNSON G B, BRUNN G J, TANG A H,, 2003. Evolutionary clues to the functions of the Toll-like family as surveillance receptors [J]. Trends in Immunology, 24(1): 19-24.

QIU L M, SONG L S, YU Y D,, 2007. Identification and characterization of a myeloid differentiation factor 88 (MyD88) cDNA from Zhikong scallop[J]. Fish & Shellfish Immunology, 23(3): 614-623.

REN X Y, WANG Z Q, GAO B Q,, 2017. Effects of florfenicol on the antioxidant status, detoxification system and biomolecule damage in the swimming crab () [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 143: 6-11.

R?SZER T, 2014. The invertebrate midintestinal gland ("hepatopancreas") is an evolutionary forerunner in the integration of immunity and metabolism [J]. Cell and Tissue Research, 358(3): 685-695.

SLACK J L, SCHOOLEY K, BONNERT T P,, 2000. Identification of two major sites in the type I interleukin-1 receptor cytoplasmic region responsible for coupling to pro-inflammatory signaling pathways [J]. Journal of Biological Chemistry, 275(7): 4670-4678.

TANG D, GAO Y H, WANG R X,, 2012. Characterization, genomic organization, and expression profiles of MyD88, a key adaptor molecule in the TLR signaling pathways in miiuy croaker () [J]. Fish Physiology and Biochemistry, 38(6): 1667-1677.

UEMATSU S, AKIRA S, 2008. Toll-Like Receptors (TLRs) and their ligands [M] // BAUER S, HARTMANN G. Toll-Like Receptors (TLRs) and Innate Immunity. Berlin: Springer: 1-20.

URIBE C, FOLCH H, ENRIQUEZ R,, 2011. Innate and adaptive immunity in teleost fish: a review [J]. Veterinární Medicína, 56(10): 486-503.

XU Z N, WEI Y J, GUO S L,, 2020. Short neuropeptide F enhances the immune response in the hepatopancreas of mud crab () [J]. Fish & Shellfish Immunology,101: 244-251.

YAGI Y, NISHIDA Y, IP Y T, 2010. Functional analysis of-related genes in[J]. Development, Growth & Differentiation, 52(9): 771-783.

YAMAMOTO M, SATO S, MORI K,, 2002. Cutting edge: a novel Toll/IL-1 receptor domain-containing adapter that preferentially activates the IFN-β promoter in the Toll-like receptor signaling [J]. The Journal of Immunology, 169(12): 6668-6672.

YANG L S, YIN Z X, LIAO J X,, 2007. A Toll receptor in shrimp [J]. Molecular Immunology, 44(8): 1999-2008.

ZHANG S, LI C Z, YAN H,, 2012. Identification and function of myeloid differentiation factor 88 (MyD88) in[J]. PLoS One, 7(10): e47038.

ZHOU S M, YUAN X M, LIU S,, 2015. Three novel Toll genes (PtToll1-3) identified from a marine crab,: different tissue expression and response to pathogens [J]. Fish & Shellfish Immunology, 46(2): 737-744.

Cloning ofgene inand its function in immunity

ZHANG Wei-Wei1, 2, LYU Jian-Jian2, LI Yu-Kun1, 2, CHU Fan-Zhi1, 2, GAO Bao-Quan2, LIU Ping2

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. National Key Laboratory of Marine Breeding and Sustainable Production, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China)

we cloned a new gene from theTLRs family and named it. The gene is 4 034 bp in length and encodes 977 amino acids.has a typical domain of Toll-like receptor, including LRR, transmembrane region, and intracellular TIR region. Phylogenetic tree analysis showed thatis clustered withof the same phylum Arthropoda. The tissue expression distribution show thatwas specifically over-expressed in hepatopancreas, followed by the intestinal tract, and then the heart. Using three types of PAMPs for injection stimulation, it was found thathad the strongest response to lipopolysaccharides, and the expression amount after 48 h of infection was thousands of times that of the control group, and it was speculated that it may be the pathogen-related molecular pattern mainly recognized bygene. The expression ofwas up-regulated at 12 h afterinfection and peaked at 24 h (up-regulated 9.02-fold). After RNAi knocked down, the expression of MyD88 was lowered, and the mortality rate ofwas significantly increased by 1.8 times that of negative control. This study showed thatgene could play an important role in resisting, and provided an important reference for the understanding the molecular mechanism of.

; toll-like receptors (TLRs); pattern recognition receptors (PRR); pathogen associated molecular patterns (PAMPs)

* 國家蝦蟹產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系, CARS-48號(hào); 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 42076116號(hào); 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi), 2020TD46號(hào)。張偉偉, 碩士研究生, E-mail: 1362326629@qq.com

劉 萍, 研究員, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

2022-11-01,

2023-01-14

S917

10.11693/hyhz20221100285