胡靈溪,安薪宇(綜述),王榮琦(審校)

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科,河北 石家莊 050051)

原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)是我國第5位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因,該病起病隱匿,手術(shù)切除率低,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高,五年凈生存率僅為14.1%[1],發(fā)展敏感度、特異度高,精準(zhǔn)、無創(chuàng)、簡便的肝癌早期篩查技術(shù)是臨床亟待解決的重大問題。液體活檢是指對實(shí)體腫瘤釋放到血液、尿液和唾液等體液中的腫瘤成分進(jìn)行分析的技術(shù),可實(shí)時(shí)監(jiān)測機(jī)體腫瘤發(fā)生的分子改變,展現(xiàn)出患者癌癥惡性程度的完整分子圖譜,減少腫瘤播散的風(fēng)險(xiǎn),未來可能成為替代性檢測手段。本文就當(dāng)前液體活檢不同檢測物在診斷預(yù)后方面的應(yīng)用價(jià)值及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述,以期為原發(fā)性肝癌的診療提供幫助。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)

CTCs是指在原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤形成或發(fā)展過程中,因自發(fā)脫落或診療操作由腫瘤灶進(jìn)入外周循環(huán)的腫瘤細(xì)胞,常被比作腫瘤的“種子”。

以往循環(huán)系統(tǒng)中的CTCs主要用來預(yù)測腫瘤的轉(zhuǎn)移,近年研究證實(shí),早期癌癥患者外周血中同樣存在CTCs,因此CTCs也可用于早期診斷,尤其在診斷甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)陰性肝癌中有很高的準(zhǔn)確性[2],與TNM分期、BCLC分期、血管侵犯、門靜脈癌栓、癌灶大小、癌灶數(shù)量、血清AFP水平顯著相關(guān)[3-4]。一項(xiàng)前瞻性研究發(fā)現(xiàn),112例術(shù)前CTCs檢出率高的已接受癌灶切除術(shù)的肝癌患者中有101例(90.18%)呈CTCs陽性,12例乙型肝炎病毒(hepatitis B,HBV)患者中2例存在少量CTCs,在隨訪的5個(gè)月內(nèi)均經(jīng)CT/MRI檢測到小肝癌[5],說明對于肝癌高風(fēng)險(xiǎn)的患者,CTCs異?？赡芟扔谟跋駥W(xué)改變,并可能成為在極早期檢測出肝癌的重要手段。Cui等[6]對CTCs在肝癌的診斷價(jià)值薈萃分析顯示,CTCs具有高度的特異度(95%),中等的敏感度(60%),具有出色的診斷價(jià)值(AUC=0.910)。CTCs除可用于肝癌早期診斷外,還可作為判斷預(yù)后的指標(biāo),用來評估治療效果[7],持續(xù)高CTCs負(fù)荷的患者在手術(shù)后顯示出腫瘤復(fù)發(fā)的傾向[8],治療前后CTCs數(shù)量的變化比單獨(dú)治療前的計(jì)數(shù)更能準(zhǔn)確識別出肝癌復(fù)發(fā)與否,其在預(yù)測肝癌治療后復(fù)發(fā)的效能可能優(yōu)于癌癥分期等傳統(tǒng)指標(biāo)。

CTCs在外周循環(huán)系統(tǒng)中豐度低,近年來,分子檢測技術(shù)的飛速發(fā)展使得分離和檢測外周血樣本中的CTCs成為可能,CTCs具有完整的細(xì)胞形態(tài)和功能,能夠進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和進(jìn)一步的生物學(xué)分析,可為研究者提供原發(fā)腫瘤的病理特征以及完整的腫瘤學(xué)信息[9],另外,CTCs的深度測序可識別突變,其中一些突變與在原發(fā)腫瘤樣本中檢測到的突變不同,與肝組織活檢相比,CTCs可提供更全面的信息[10]。所以,CTCs是目前具有發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷和實(shí)時(shí)療效監(jiān)測手段,具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 循環(huán)游離DNA和循環(huán)腫瘤DNA(circulating free DNA and circulating tumor DNA,cfDNA and ctDNA)

cfDNA是指外周循環(huán)中存在于細(xì)胞外的部分降解的內(nèi)源性DNA[11],大多數(shù)來源于骨髓和肝臟,也可來源于腫瘤細(xì)胞的釋放。cfDNA可代表腫瘤負(fù)荷并反映肝癌的遺傳特征,cfDNA水平越高,疾病越嚴(yán)重。ctDNA是指在腫瘤增殖過程中,凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞釋放或腫瘤細(xì)胞主動(dòng)分泌的DNA片段,屬于cfDNA的一小部分,因其半衰期較短,可實(shí)時(shí)評估腫瘤狀態(tài),使其成為早期診斷肝癌、評估治療效果并及時(shí)調(diào)整治療方案、監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)的理想選擇[12]。在肝癌患者中,cfDNA遺傳和表觀遺傳學(xué)改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療耐受有關(guān),在肝癌各分期中都是可量化的,可通過深度測序檢測突變、拷貝數(shù)變異和甲基化特征等多種信息的變化,來區(qū)分是否發(fā)生癌變[11]。

2.1cfDNA突變 Nault等[12]通過全外顯子組測序?qū)?01例肝癌組織進(jìn)行基因組分析發(fā)現(xiàn),最常發(fā)生突變的基因依次是TERT(58.1%)、CTNNB1(30.7%)、TP53(18.7%)、ARID1A(13%)、白蛋白(11.4%)、APOB(9.4%)和AXIN1(9.2%)。單一的cfDNA突變作為肝癌的診斷標(biāo)志物并不具有足夠高的敏感度,多個(gè)突變位點(diǎn)相結(jié)合可提高檢出效能,故cfDNA突變圖譜已被研發(fā)用于肝癌診斷及預(yù)后評價(jià)。Cai等[13]等通過綜合所有體細(xì)胞變異的動(dòng)態(tài)變化將ctDNA突變譜圖進(jìn)行整合,高度準(zhǔn)確地評估患者的腫瘤負(fù)荷,平均比影像發(fā)現(xiàn)腫瘤早4.6個(gè)月,比AFP等血清學(xué)蛋白標(biāo)志物具有更好的診斷效能,并可提前檢測出微小殘留病變,預(yù)測患者的無復(fù)發(fā)生存期和總生存期?，F(xiàn)有更多研究表明,早期cfDNA入血豐度低,聯(lián)合蛋白標(biāo)志物可提高其診斷效能。Qu等[14]提出了聯(lián)合蛋白標(biāo)志物與cfDNA突變的肝癌篩查手段“HCC screen”,其在135例AFP或 US異常的HBsAg陽性患者中表現(xiàn)出85%的敏感度和93%的特異度,更為重要的是,331例AFP及US陰性患者中同樣表現(xiàn)出良好的診斷效能,敏感度和特異度高達(dá)100%和94%。Cohen等[15]將8種血清學(xué)標(biāo)志物與16種cfDNA腫瘤相關(guān)基因相結(jié)合,建立的CancerSeek診斷模型已證明在早期肝癌的診斷中具有98%的敏感度和大于99%的特異度。除此之外,cfDNA突變可用于鑒定腫瘤基因圖譜以進(jìn)行個(gè)體化治療。Ikeda等[16]通過ctDNA基因測序發(fā)現(xiàn)PTEN失活和MET激活的晚期肝癌患者行西羅莫司和卡博替尼治療預(yù)后更佳,ARID1A和BRCA2突變在卡培他濱治療的肝癌患者中隨全身治療明顯減少,并在疾病進(jìn)展后患者出現(xiàn)TP53突變,因此,肝癌患者可根據(jù)突變基因制定治療方案,并通過連續(xù)分析ctDNA基因組圖譜監(jiān)測患者的疾病進(jìn)展并及時(shí)調(diào)整治療方案。

2.2cfDNA甲基化 cfDNA甲基化是基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)改變的核心機(jī)制,特定基因甲基化可反映相應(yīng)腫瘤組織中DNA甲基化改變,因此基因的甲基化特征可用于識別cfDNA的組織來源[17]。局灶性高甲基化變化可導(dǎo)致腫瘤關(guān)鍵抑制基因失活,控制細(xì)胞周期和生長調(diào)節(jié)區(qū)域失調(diào),降低對治療的反應(yīng)。DNA甲基化的異常表觀遺傳改變通常發(fā)生在腫瘤形成或發(fā)展之前,可用于診斷早期腫瘤或識別高危人群。SEPT9是細(xì)胞分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,作為腫瘤抑制因子,廣泛存在于機(jī)體各個(gè)組織器官中[18]。一項(xiàng)法國研究分析98例肝癌患者和191例健康對照者中SEPT9的甲基化水平,發(fā)現(xiàn)SEPT9甲基化對肝癌的診斷準(zhǔn)確率很高,AUC達(dá)0.940,但其對BCLCA期肝癌的敏感度僅為64%[19]。RASSF1A是癌癥進(jìn)展的抑癌基因,在原發(fā)性肝癌中,RASSF1A通過啟動(dòng)子高甲基化而失活,敏感度為66.7～100%。Wen等[20]檢測cfDNA中CpG島高甲基化的基因組(RGS10、ST8SIA6、RUNX2和VIM),發(fā)現(xiàn)該基因組在36例肝癌患者,17例肝硬化患者和38名健康對照者中的敏感度為94%,特異度為89%,并且5例AFP陰性的肝癌患者均被確診。在一項(xiàng)1 933例患者參與的大型研究中,Xu等[21]構(gòu)建出BMPR1A等10個(gè)甲基化標(biāo)志物的診斷預(yù)測模型,該模型在715例肝癌患者和560名健康對照者的訓(xùn)練集中對肝癌的敏感度和特異度高達(dá)85.7%和94.3%,在383例肝癌患者和275例健康對照的驗(yàn)證集中敏感度和特異度達(dá)83.3%和90.5%。另外,Xu等建立區(qū)分肝病和肝癌模型的綜合診斷評分“CD-SCORE”,有效地將肝癌患者與病毒性肝炎患者、脂肪肝患者以及健康對照者區(qū)分開來。由此可見,cfDNA甲基化可能是液體活檢中診斷早期肝癌更為有效的診斷標(biāo)志物。

2.3cfDNA羥甲基 cfDNA羥甲基化是近年來備受關(guān)注的表觀遺傳學(xué)改變。5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)是通過11易位酶氧化5-甲基胞嘧啶而產(chǎn)生的啟動(dòng)子。Cai等[22]開發(fā)并驗(yàn)證了一種基于5-hmC的基因診斷模型“WD-SCORE”,該模型在2554例受試者中鑒別巴塞羅那肝癌分期0期和非肝癌患者(AUC=0.871)、癌灶直徑≤ 2.0 cm和非肝癌患者(AUC=0.851)、早期肝癌和具有HBV或肝硬化病史的高危人群(AUC=0.846)中均表現(xiàn)出優(yōu)越的診斷效能,且明顯優(yōu)于AFP。因此,5-hmC檢測技術(shù)作為一種非侵入性檢查手段,可以幫助HBV或肝硬化病史的高危人群及早發(fā)現(xiàn)肝癌。

M2P-HCC(methylation,mutation&protein,M2P)模型是一種基于cfDNA的液體活檢技術(shù),通過檢測特異性靶基因甲基化、高發(fā)性體細(xì)胞點(diǎn)突變、相關(guān)性篩查蛋白三個(gè)層面的多維度指標(biāo),進(jìn)行人工智能建模,建立肝癌早篩預(yù)測模型,如報(bào)告顯示陽性或預(yù)警,通過進(jìn)一步影像檢查,可實(shí)現(xiàn)肝癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷。一項(xiàng)基于1 615例乙型肝炎表面抗原陽性患者的多中心前瞻性研究數(shù)據(jù)顯示,M2P-HCC模型用于肝癌篩查的敏感度和特異度分別為88%、93%,明顯優(yōu)于AFP聯(lián)合超聲檢查[1],對肝癌高危人群,特別是肝硬化患者可做肝癌篩查和監(jiān)測的補(bǔ)充。目前該技術(shù)已應(yīng)用于臨床。

3 外泌體(exosomes)

外泌體是正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞釋放的直徑為50～150 nm的小膜狀囊泡,其內(nèi)含有信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)、微小核糖核酸(microRNA、miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等多種核酸片段及蛋白質(zhì)等,廣泛分布于血液、腹水、尿液和唾液等體液中[11]。

3.1miRNA miRNA是內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼RNA家族的成員,大小為20～22個(gè)核苷酸。外泌體中miRNA-224、miRNA-93、miRNA-92b、miR-106a等在肝細(xì)胞癌患者中表達(dá)上調(diào),miRNA-125b、miRNA-638、miRNA-122等表達(dá)下調(diào),特定miRNA的差異表達(dá)可作為腫瘤潛在的標(biāo)志物,用于腫瘤早期診斷。Cho等[23]研究發(fā)現(xiàn),肝癌患者特別是癌灶直徑≤ 2.0 cm的患者,血清miR-10b-5p表達(dá)顯著上調(diào),但HBV或肝硬化患者血清中未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)增加,表明miR-10b-5p表達(dá)水平可用于區(qū)分早期肝癌與肝癌高風(fēng)險(xiǎn)患者,這可能是由于大部分miR-10b-5p來自肝癌細(xì)胞,其表達(dá)受肝臟炎癥和纖維化的影響小。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)早期和晚期肝癌患者的miR-122、miR-148、miR-1246表達(dá)水平均顯著高于肝硬化和健康對照者(P<0.001),區(qū)分早期肝癌和肝硬化時(shí),miR-148a明顯優(yōu)于AFP(P<0.05),miR-122、miR-148a和AFP聯(lián)合診斷的敏感度和特異度分別達(dá)87.0%和90.0%。血清miRNA除可用于早期診斷外,還與腫瘤負(fù)荷、臨床預(yù)后密切相關(guān)。miR-125b是一種腫瘤抑制因子,可直接調(diào)節(jié)SMAD2/4、Sirtuin7、SUV39H1、LIN28B和PIGF,抑制肝癌的生長、遷移和侵襲,在Liu等[25]的隨機(jī)對照研究中,肝癌患者血清中miR-125b的表達(dá)降低,且與肝癌患者的癌灶數(shù)量、分化程度和TNM分期呈負(fù)相關(guān),與水平較高的患者相比,miR-125b減少的患者復(fù)發(fā)時(shí)間(P<0.01)和總生存期(P<0.01)均縮短,可用于判斷患者預(yù)后。Nakano等[26]發(fā)現(xiàn)肝移植前miR-92b水平具有預(yù)測移植后肝癌復(fù)發(fā)的臨床價(jià)值,移植前AFP和miR-92b聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高移植后患者肝癌復(fù)發(fā)的預(yù)測準(zhǔn)確性(AUC=0.760)。外泌體可保護(hù)其內(nèi)部miRNA免受降解,從而穩(wěn)定存在于循環(huán)中,多研究表示,外泌體miRNA是比血清miRNA更有效的診斷生物學(xué)標(biāo)志物[24],但外泌體的準(zhǔn)確分離仍然存在一定的困難,限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用。

3.2lncRNA lncRNA是長度>200個(gè)核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄物,是非編碼RNA中最廣泛的類別。有研究報(bào)道lncRNA在惡性膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等中呈異常表達(dá),可能會成為新的腫瘤標(biāo)志物,用于患者篩查診斷、治療療效和預(yù)后評估。Zeng等[27]薈萃分析發(fā)現(xiàn),lncRNA診斷肝癌的敏感度、特異度可達(dá)85%、76%(AUC=0.880)。Xu等[28]利用血清外泌體中hnRNPH1 mRNA鑒別肝癌和HBV患者,其敏感度和特異度分別為85.2%和76.5%(AUC=0.670),與血清AFP聯(lián)合檢測診斷效能更高;另外,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),肝癌患者外泌體hnRNPH1 mRNA水平與Child-Pugh評分、門靜脈癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和總生存期相關(guān)(P<0.05)。Wu 等[29]從155例接受肝移植治療的肝癌患者中收集血液和肝癌組織樣本,發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTTIP 在肝癌組織中高表達(dá),是肝移植后肝癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,并與總生存期縮短相關(guān)。由此可見,血清外泌體lncRNA水平在肝癌的早期診斷及預(yù)后評估中均具有重要的預(yù)測價(jià)值。

3.3蛋白質(zhì) Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫顯示,外泌體中的蛋白質(zhì)數(shù)量約為1 800個(gè),根據(jù)外泌體中蛋白質(zhì)的位置不同分為貨運(yùn)蛋白和膜蛋白,在不同腫瘤發(fā)展過程中,外泌體中的貨運(yùn)蛋白組成不同[30],He等[31]在肝癌細(xì)胞系衍生的外泌體中發(fā)現(xiàn)213種特有的蛋白質(zhì),Arbelaiz等[32]分析肝癌組和健康對照組中外泌體蛋白質(zhì)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)肝癌患者外泌體中半乳糖凝集素3結(jié)合蛋白(galectin-3-binding protein,G3BP)和聚合免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor,PIGR)顯著升高,這兩種蛋白對肝癌的早期診斷優(yōu)于AFP,均是促進(jìn)肝癌進(jìn)展、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化、侵襲和增殖的致癌蛋白,也被認(rèn)為是HCC不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。鐵調(diào)素是人體鐵代謝的重要調(diào)節(jié)劑,鐵過量被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)肝癌發(fā)生發(fā)展的重要因素之一,肝癌患者血清外泌體鐵調(diào)素mRNA水平明顯高于健康人[33],可作為肝癌風(fēng)險(xiǎn)的診斷標(biāo)志物。

另外,外泌體具有保護(hù)內(nèi)部RNA及蛋白質(zhì)、低免疫原性、可通過血管內(nèi)皮組織等多種特性,故可用作藥物載體。Lou等[34]報(bào)道,轉(zhuǎn)染miR-122的間充質(zhì)肝細(xì)胞可將miR-122包裹于分泌的外泌體,介導(dǎo)間充質(zhì)肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞之間的miR-122通信,從而改變miR-122靶基因表達(dá)使肝癌細(xì)胞對化療藥物更敏感,顯著提高藥物的抗腫瘤效果。Tian等[35]將小鼠未成熟樹突狀細(xì)胞改造為外泌體膜蛋白,顯示出高效的靶向性和藥物呈遞功能,靜脈注射靶向外泌體可將藥物特異性遞送至腫瘤組織,從而抑制腫瘤生長而沒有明顯毒性。因此,外泌體有望成為肝癌靶向治療的藥物載體。

4 展望

液體活檢包含潛在腫瘤組織釋放的所有腫瘤成分,可獲取先于影像學(xué)改變的分子變化,并且不受特定穿刺活檢的限制,比AFP等血清學(xué)標(biāo)志物更好地預(yù)測腫瘤發(fā)生或進(jìn)展,可在肝癌早期診斷、療效監(jiān)測、預(yù)后判斷、靶向藥物治療等臨床應(yīng)用方面持續(xù)發(fā)揮巨大作用。因此,雖然液體活檢基因組具有不穩(wěn)定性,檢測成本高,目前亦缺乏大規(guī)模的驗(yàn)證性臨床研究,但隨著新技術(shù)的不斷研發(fā),將加快肝癌分子診斷標(biāo)志物的篩選和鑒定,為腫瘤的精準(zhǔn)診療開辟新路徑。