郭軼斌，李佳迅，吳 騁，郭 威，何 倩

1.海軍軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)生勤務(wù)學(xué)系軍隊(duì)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室（上海 200433）

2.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（上海 200433）

在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，研究對(duì)象以細(xì)胞、動(dòng)物為主，一些實(shí)驗(yàn)細(xì)胞或動(dòng)物模型不僅構(gòu)造困難，而且花費(fèi)較大，如巴馬小型豬或恒河猴等，不僅動(dòng)物本身費(fèi)用較高，同時(shí)因倫理限制無法納入太多。因此，部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的樣本量極小，如每組小于10 例[1-3]。統(tǒng)計(jì)學(xué)上為了保證一定的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)效率，常要求樣本例數(shù)不能過小。此外，在使用如獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)等參數(shù)檢驗(yàn)方法時(shí)，還要求樣本服從正態(tài)分布和方差齊性的假設(shè)[4]。但在極小樣本的情況下，即使是不服從正態(tài)分布的樣本，在統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)效率很低的情況下也無法拒絕H0假設(shè)（樣本服從正態(tài)分布或滿足方差齊性）。當(dāng)獨(dú)立定量資料樣本不滿足正態(tài)分布或方差齊性假設(shè)時(shí)，可以使用對(duì)數(shù)據(jù)分布不敏感的非參數(shù)檢驗(yàn)，對(duì)于兩組獨(dú)立定量資料，可以使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)來比較兩個(gè)樣本所代表的總體分布位置是否相同[5-6]。但這兩種方法是將樣本的原始數(shù)據(jù)編秩后再進(jìn)行后續(xù)的假設(shè)檢驗(yàn)，當(dāng)資料服從參數(shù)檢驗(yàn)的條件時(shí)，會(huì)導(dǎo)致樣本大量變異的信息損失，進(jìn)而影響統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)效率，增加犯Ⅱ類錯(cuò)誤的概率[7]。當(dāng)樣本量小于4 時(shí)，使用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)的P值均大于0.05。Siegel 認(rèn)為樣本量小于6 時(shí)，不能使用t檢驗(yàn)[8]。祝國強(qiáng)等認(rèn)為在對(duì)非正態(tài)極小樣本的定量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷時(shí)，不適合使用t檢驗(yàn)，推薦使用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)[9]。林正大等認(rèn)為在大樣本或偏離對(duì)稱性較遠(yuǎn)的情況下，Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)更優(yōu)[10]。對(duì)于統(tǒng)計(jì)學(xué)的頻率學(xué)派來說，假設(shè)檢驗(yàn)和置信區(qū)間（Confidence Interval,CI）是一對(duì)相伴相隨的概念，在同一置信度/檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，參數(shù)的置信區(qū)間未跨過拒絕域，假設(shè)檢驗(yàn)則不能拒絕H0。Bootstrap 法是一種可以用來穩(wěn)健地估計(jì)置信區(qū)間的非參數(shù)方法，其通過對(duì)原始樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行有放回抽樣得到統(tǒng)計(jì)量的經(jīng)驗(yàn)分布，從而估計(jì)統(tǒng)計(jì)量對(duì)應(yīng)總體參數(shù)的置信區(qū)間[11]。在極小樣本時(shí)，Bootstrap 法能否達(dá)到其在大樣本中的穩(wěn)健性，以及該方法估計(jì)的置信區(qū)間的精度也值得進(jìn)一步探索。

本研究采用蒙特卡洛數(shù)據(jù)模擬方法，比較兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)和Bootstrap 置信區(qū)間法在解決極小樣本兩獨(dú)立定量資料比較中的表現(xiàn)，以期為相關(guān)實(shí)驗(yàn)性研究提供方法學(xué)參考。

1 資料與方法

1.1 模擬數(shù)據(jù)的生成

通過蒙特卡洛數(shù)據(jù)模擬方法生成模擬數(shù)據(jù)，主要有以下幾個(gè)模擬情景。樣本含量：本研究主要模擬極小樣本量下的統(tǒng)計(jì)方法表現(xiàn)性能，共模擬5 種樣本量——每組各2、3、5、10 和20。均數(shù)差：共設(shè)置5 種均數(shù)差——0、0.5、1、2 和3。從均數(shù)相同的兩總體中抽樣，兩總體均數(shù)差為0，H0成立，且均數(shù)差的置信區(qū)間包含0，認(rèn)為兩樣本來自同一總體，兩組樣本均數(shù)的不同由抽樣誤差造成，當(dāng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法拒絕H0時(shí)則認(rèn)為發(fā)生I類錯(cuò)誤。當(dāng)兩樣本均數(shù)差不為0 時(shí)，兩樣本不是來自同一樣本，若統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法未能拒絕H0，則認(rèn)為發(fā)生Ⅱ類錯(cuò)誤。樣本分布：共設(shè)置3 種總體分布，第1 種為兩樣本均服從總體方差為12 的正態(tài)分布，總體均數(shù)根據(jù)均數(shù)差確定（其中一組為0，即第一組的總體為標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布）；第2種（偏態(tài)分布一）為兩樣本服從偏度系數(shù)為1.5，峰度系數(shù)為3.0 的偏態(tài)分布；第3 種（偏態(tài)分布二）為兩樣本服從偏度系數(shù)為1.0，峰度系數(shù)為2.0 的偏態(tài)分布[12]。

對(duì)以上三個(gè)因素的不同水平進(jìn)行全排列構(gòu)建75 種（5 種樣本量×5 種均數(shù)差×3 種總體分布）情景，每種生成10 000 個(gè)模擬數(shù)據(jù)集。

1.2 檢驗(yàn)方法

基于Bootstrap 法估計(jì)均數(shù)差的置信區(qū)間。采用Bootstrap 重抽樣技術(shù)對(duì)模擬數(shù)據(jù)集進(jìn)行1 000次重抽樣構(gòu)建兩樣本均數(shù)差的經(jīng)驗(yàn)分布。通過估計(jì)經(jīng)驗(yàn)分布的第2.5%和第97.5%分位數(shù)確定均數(shù)差的95%CI。當(dāng)95%CI 下限大于0 或上限小于0 時(shí)，認(rèn)為兩組均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩樣本對(duì)應(yīng)的總體均數(shù)不同。

參數(shù)和非參數(shù)假設(shè)檢驗(yàn)法。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)對(duì)兩總體均數(shù)是否相同進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。與Bootstrap 法估計(jì)的95%CI相對(duì)應(yīng)，假設(shè)檢驗(yàn)的檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

在均數(shù)差為0 時(shí)，若t檢驗(yàn)和Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)的P值小于α，或Bootstrap 法估計(jì)的均數(shù)差95%CI 未跨過0，認(rèn)為發(fā)生I 類錯(cuò)誤。在均數(shù)差不為0 時(shí)，以上情形認(rèn)為成功檢驗(yàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即未發(fā)生Ⅱ類錯(cuò)誤。

分別使用t檢驗(yàn)、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Bootstrap 置信區(qū)間法對(duì)75 種情景下，每種情景的10 000 個(gè)模擬數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。計(jì)算并比較3 種方法在不同數(shù)據(jù)情景下的I 類錯(cuò)誤發(fā)生率和100%-Ⅱ類錯(cuò)誤發(fā)生率（統(tǒng)計(jì)效率）。

1.4 統(tǒng)計(jì)軟件和硬件

本研究使用的統(tǒng)計(jì)軟件為R 4.1.3，數(shù)據(jù)模擬的平臺(tái)為塔式服務(wù)器，處理器型號(hào)為Intel Xeon Gold 6230，內(nèi)存為384GB。

2 結(jié)果

2.1 I類錯(cuò)誤

大樣本時(shí)I 類錯(cuò)誤的發(fā)生與樣本量無關(guān)，其僅與檢驗(yàn)水準(zhǔn)α 有關(guān)，但根據(jù)本研究的模擬結(jié)果，t檢驗(yàn)和Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)的I 類錯(cuò)誤發(fā)生率均小于檢驗(yàn)水準(zhǔn)（圖1a 和圖1b）。當(dāng)樣本量n=2、n=3 時(shí)，Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)的I 類錯(cuò)誤發(fā)生率為0。這是由Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)方法特性造成的[8]。對(duì)于t檢驗(yàn)來說，極小樣本時(shí)的I 類錯(cuò)誤發(fā)生率小于檢驗(yàn)水準(zhǔn)α，尤其是當(dāng)數(shù)據(jù)分布為本研究設(shè)定的兩種偏態(tài)分布時(shí)更為明顯，這可能與此種情形下不適用t檢驗(yàn)有關(guān)。但Bootstrap 置信區(qū)間法的I 類錯(cuò)誤發(fā)生率較高，當(dāng)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布時(shí)，I類錯(cuò)誤發(fā)生率隨著樣本量的增加而下降，當(dāng)數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布時(shí)，I 類錯(cuò)誤發(fā)生率隨著樣本量的增加而上升（圖1c）。

圖1 三種方法的I類錯(cuò)誤發(fā)生率（%）Figure 1.Type I error rate of three methods (%)

2.2 統(tǒng)計(jì)效率

三種總體分布下（正態(tài)分布、偏態(tài)分布一和偏態(tài)分布二）分別使用三種方法（t檢驗(yàn)、Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)和Bootstrap 置信區(qū)間法）的統(tǒng)計(jì)效率分別如圖2a、圖2b 和圖2c 所示。當(dāng)均數(shù)差較小時(shí)，無論使用哪種方法，統(tǒng)計(jì)效率都很低，Bootstrap 置信區(qū)間法表現(xiàn)略優(yōu)于另外兩種假設(shè)檢驗(yàn)的方法；當(dāng)均數(shù)差較大時(shí)，即使樣本量很小，Bootstrap 置信區(qū)間法仍有較高的統(tǒng)計(jì)效率，說明此時(shí)犯Ⅱ類錯(cuò)誤的概率較低（圖2c）。

圖2 不同情形下三種方法的統(tǒng)計(jì)效率（%）Figure 2.Power of three methods in different scenarios (%)

無論數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，當(dāng)樣本量極小時(shí)（n=2、n=3），t檢驗(yàn)的表現(xiàn)優(yōu)于Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。但當(dāng)樣本量較大且均數(shù)差也較大時(shí)，t檢驗(yàn)與Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)效率差異不大（圖2a、圖2b）。

3 結(jié)論

本研究通過數(shù)據(jù)模擬的方法，探索了采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)和Bootstrap置信區(qū)間法對(duì)極小樣本兩獨(dú)立定量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷時(shí)統(tǒng)計(jì)效率的差異。由模擬結(jié)果可見，相較于Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)在樣本量極小時(shí)（n=2、n=3）仍有一定的統(tǒng)計(jì)效率，且對(duì)總體數(shù)據(jù)分布不是很敏感。當(dāng)數(shù)據(jù)服從本研究設(shè)定的兩種偏態(tài)分布時(shí)，t檢驗(yàn)的表現(xiàn)不差于Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。在樣本量極小時(shí)，Bootstrap 置信區(qū)間法可以增加統(tǒng)計(jì)效率，但在兩組樣本均數(shù)差為0（即兩組樣本來自同一總體），且數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布時(shí)，犯I 類錯(cuò)誤的概率較高。

綜上，根據(jù)本模擬研究結(jié)果，當(dāng)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布時(shí)，建議使用t檢驗(yàn)對(duì)極小樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷；當(dāng)數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布時(shí)，建議使用Bootstrap 置信區(qū)間法對(duì)極小樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。由于對(duì)于極小樣本統(tǒng)計(jì)效率太低，當(dāng)樣本量極小時(shí)，無論數(shù)據(jù)服從何種分布，均不建議使用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。