馬凱，謝嘉慧，魏烈群，姜曉靜，高麗

（煙臺大學海洋學院，山東 煙臺 264005）

磷是導致大多數(shù)水體富營養(yǎng)化的重要誘因，當外源輸入減緩或得到有效控制的情況下，沉積物內(nèi)源磷的釋放可使湖泊等水體長時間處于富營養(yǎng)化狀態(tài)[1]。微生物作為生態(tài)系統(tǒng)中的分解者，在水圈生境氮、磷等生源要素的循環(huán)過程中發(fā)揮著關鍵的驅(qū)動作用，從而影響著水體的營養(yǎng)狀態(tài)[2]。研究表明，沉積物中解磷菌的溶磷作用可使上覆水的可溶性磷水平明顯升高，從而為有害藻華的暴發(fā)提供了必要條件[3-4]。近年來，解磷菌在水體磷循環(huán)過程中的作用機制越來越受到關注。

有機解磷菌（OPB）可通過分泌磷酸酶、植酸酶等促進有機磷礦化，其中堿性磷酸酶在水體磷循環(huán)過程中起著重要作用，其活性與解磷量關系密切[5-6]。在太湖，沉積物中堿性磷酸酶活性（APA）與OPB數(shù)量呈正相關關系[7]，解磷菌數(shù)量是影響解磷能力的重要因素。已有模擬研究證實，接種解磷菌可改變水體的pH、Eh等理化因子，并對沉積物中磷的釋放具有一定促進作用，但解磷效果與解磷菌的種類、數(shù)量以及沉積物磷的賦存形態(tài)等有關[8-9]。Qu 等[9]將類芽孢桿菌屬（Paenibillus sp.）菌株接種至沉積物中，發(fā)現(xiàn)其可改變水體pH 和金屬離子濃度，并促進沉積物磷的釋放。由此可見，解磷菌是影響沉積物內(nèi)源磷釋放的重要生物因子。研究表明，不同生境中解磷菌的優(yōu)勢種屬及解磷能力均存在較大差異[8，10]。目前沉積物解磷菌的相關研究多集中于淡水湖泊和河口水域，解磷能力評估大多在培養(yǎng)基條件下進行，而針對大型藻華暴發(fā)的潟湖中OPB 的種屬及其對沉積物的解磷效果鮮見報道。

榮成天鵝湖是位于山東半島的天然潟湖，東南端與榮成灣相連，受潮汐影響水體交換頻繁，其生境與湖泊、河流等水體差異較大。近年來，由于污水排放、水產(chǎn)養(yǎng)殖等人為活動影響，絲狀硬毛藻（Chaetomor?pha spp.）在湖內(nèi)常年暴發(fā)，導致鰻草（Zostera marina）數(shù)量明顯減少，并對底棲生物的生存造成了一定威脅[11]。此外，藻體死亡后大量堆積于沉積物表面，使得沉積物內(nèi)源污染加劇[12]。天鵝湖濕地因其獨特的地理位置和生境特性而具有較高的科研價值。本研究對天鵝湖冬季沉積物中OPB 進行了分離和鑒定，并探究了不同OPB 菌株對藻華區(qū)沉積物磷釋放的影響，以期明確OPB 在沉積物磷釋放過程中的作用，旨在為進一步闡明潟湖生境中OPB 的解磷機制提供參考，并為近海藻華水體內(nèi)源污染的治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2020 年1 月，在天鵝湖的西部（37°20'53″ N，122°33'33″ E）和湖中心（37°20'49″ N，122°34'11″E）用柱狀采泥器采集表層沉積物（0~5 cm），沉積物室內(nèi)冷凍保存（-20 ℃），用于OPB的分離篩選。

2021 年12 月，在湖中心采集表層5 cm 沉積物和底層湖水，用于接種模擬試驗；該區(qū)域水位較深，沉積物為黏質(zhì)，有大量硬毛藻和鰻草生長。沉積物樣品放入冷藏箱中盡快送至實驗室，分析磷形態(tài)和APA，其余樣品4 ℃冷藏供模擬試驗使用。湖水一部分進行煮沸，供滅菌組處理使用。底層湖水pH 為8.49，鹽度為28.33‰，總磷（TP）和可溶性磷濃度分別為0.009 mg·L-1和0.004 mg·L-1。

1.2 研究方法

1.2.1 沉積物中解磷菌的分離鑒定

利用選擇性培養(yǎng)基對沉積物中OPB 進行篩選分離。具體步驟：稱取1 g 沉積物樣品加入到99 mL 蒙金娜有機磷液體培養(yǎng)基中，振蕩富集培養(yǎng)24 h，稀釋后涂布于蒙金娜有機磷固體培養(yǎng)基，在30 ℃條件下培養(yǎng)2~7 d。培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)明顯透明圈的菌落視為具有解磷能力的菌株，經(jīng)多次劃線純化后進行16S rDNA測序鑒定，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 不同解磷菌菌株對藻華區(qū)沉積物磷釋放的影響

試驗材料為湖中心的新鮮沉積物、底層湖水及3株代表性OPB[OPB3：嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacil?lus stearothermophilus）；OPB10：彎曲芽孢桿菌（Bacil?lus flexus）；OPB11：短小芽孢桿菌（Bacillus altitudi?nis）]。試驗分為滅菌和非滅菌兩組，每組設置5 個處理：沉積物+湖水（CK1）、沉積物+湖水＋葡萄糖（CK2）、沉積物+湖水+葡萄糖+OPB3、沉積物+湖水+葡萄糖+OPB10、沉積物+湖水+葡萄糖+OPB11。添加葡萄糖的目的是給菌株生長提供能量和碳源。滅菌組沉積物采用高溫方式滅菌（121 ℃，30 min），湖水進行煮沸滅菌。設置非滅菌組是為了分析土著微生物存在條件下解磷菌接種對沉積物磷釋放的影響。操作步驟：稱取300 g沉積物平鋪于燒杯（2.0 L）底部，根據(jù)處理不同分別加入20 mL 菌液（OD600約為0.8）和3 g 葡萄糖，混勻后加入1.8 L 湖水。每個處理設3 次重復，試驗周期為15 d。

1.3 樣品采集與測定

試驗過程中，每2 d 用注射器在沉積物-水界面上方3 cm處采集水樣，分析上覆水TP濃度，并原位測定界面的pH 和溶解氧（DO）濃度；在試驗結(jié)束時，測定沉積物的APA 和各形態(tài)磷含量。界面pH 采用多參數(shù)分析儀（SG78）測定；DO 采用溶氧儀（SG6-FK2）測定；水體TP采用過硫酸鉀消解，鉬銻抗分光光度法測定[13]；沉積物APA 分析采用對硝基磷酸苯二鈉法[14]，磷形態(tài)采用化學連續(xù)提取法[15]。

1.4 統(tǒng)計分析

利用Origin 2021 軟件制圖；采用SPSS 27.0 軟件進行方差分析、相關性分析以及T 檢驗，在滅菌組和非滅菌組的各處理間分別進行差異顯著性檢驗（Dun?can法，P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物中OPB的篩選和鑒定

如圖1 所示，經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)，從天鵝湖冬季表層沉積物中共篩選得到11 株OPB。在湖西部沉積物中共分離純化出4 株具有解磷能力的菌株（OPB1~OPB4），其中OPB1 和OPB3 的透明圈直徑比（D/d）較大，范圍分別為1.65~2.06和1.23~2.17。與湖西部相比，湖中心沉積物中解磷菌種類較為豐富（OPB5~OPB11），且大部分菌株的解磷能力較強。湖中心解磷菌中OPB5、OPB6 和OPB10 的D/d 值較大，其中OPB10的D/d值為3.89~4.11，為已篩選菌株的最大值，初步判斷其具有較強的解磷能力。

圖1 11株OPB在蒙金娜有機磷培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Figure 1 Colony morphology of eleven organic phosphate-solubilizing bacterial strains on Mengjinna organic phosphorus medium

對分離純化的菌株進行16S rDNA 基因測序，用MEGA X 軟件構建系統(tǒng)進化樹（bootstrap 值為1 000，圖2）。初步結(jié)果表明，解磷菌株中有10株屬于Bacil?lus sp.，1 株屬于Geobacillus sp.。依據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》[16]，結(jié)合其形態(tài)特征和16S rDNA 序列，判斷OPB1 為Bacillus cereus，OPB2 為Bacillus paramy?codies，OPB3 為Geobacillus stearothermophilus，OPB4、OPB7、OPB11 均為Bacillus altitudinis，OPB5 為Bacil?lus thuringiensis，OPB6 為 Bacillus stratosphericus，OPB8、OPB10 為Bacillus flexus，OPB9 為Bacillus pumi?lus。

圖2 基于16S rDNA 序列構建的11株OPB的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of eleven organic phosphate-solubilizing bacterial strains based on 16S rDNA gene sequences

2.2 培養(yǎng)過程中沉積物-水界面理化因子的變化

2.2.1 DO濃度的變化

由圖3a 可見，試驗期間滅菌組各處理水體的DO濃度整體呈下降趨勢（除CK1 外）。3 個接種處理的DO 濃度均在試驗前期迅速降低，很快達厭氧狀態(tài)，其中OPB11 處理降幅最大，中后期濃度基本穩(wěn)定（1.55~2.49 mg·L-1）。不同處理相比，3 個接種處理水體DO 濃度均低于兩對照（CK1、CK2），其中與CK1 差異達顯著水平（P<0.05），但不同菌株處理間差異不顯著（P>0.05）。

圖3 不同處理下沉積物-水界面pH和DO濃度的變化Figure 3 Changes in pH and dissolved oxygen concentration at the sediment-water interface under different treatments

非滅菌組各處理DO 濃度為0.87~6.18 mg·L-1（圖3b），與滅菌組相比，其試驗后期厭氧狀態(tài)更為明顯。除CK1 在試驗期間變化較小外，其余處理DO 濃度均表現(xiàn)為在前9 d急劇下降，處于嚴重厭氧狀態(tài)，后期變化較小。試驗結(jié)束時，OPB3 處理DO 濃度顯著高于OPB10 和OPB11 處理。在試驗后期，大多數(shù)處理在非滅菌條件下的DO 濃度低于滅菌組，其中OPB10 處理在兩者間的差異達顯著水平（P<0.05）。

2.2.2 pH的變化

圖3c 顯示，試驗期間滅菌組各處理水體pH 變幅為6.58~8.01，隨時間延長呈降低趨勢。在試驗前5 d，各處理間的差異不明顯（除CK1外），之后隨著試驗進行差異逐漸變大。在第11 天，接種處理pH 表現(xiàn)為OPB11 處理顯著低于OPB3 和OPB10 處理（P<0.05），且3 個接種處理與對照間的差異均達顯著水平。在非滅菌組（圖3d），水體pH 變幅為6.73~8.45，各處理pH 隨時間延長均呈先下降后上升的變化趨勢。不同處理相比，各接種處理pH 均顯著低于CK1。在試驗后期，非滅菌組各接種處理的水體pH均高于滅菌組。

2.3 OPB接種對上覆水TP濃度影響

試驗過程中，滅菌組水體TP 濃度隨時間延長呈迅速上升趨勢，變幅為0.049~0.335 mg·L-1（圖4a）。在試驗前3 d，大多數(shù)處理TP 濃度有所下降，但處理間差異較??；隨著試驗進行，各處理TP濃度均大幅增加。在第13 天，不同處理間的差異較大，其中OPB10處理顯著高于CK1 和OPB3 處理，OPB11 處理顯著高于CK1（P<0.05）。在試驗結(jié)束時，OPB10 處理TP 濃度達最高，為0.335 mg·L-1?？傮w來說，OPB 的接種使得水體TP 濃度明顯增加，不同菌株表現(xiàn)為OPB10>OPB11>OPB3。

圖4 不同處理下水體TP濃度的變化Figure 4 Changes in total phosphorus concentration in water under different treatments

在非滅菌組，試驗期間水體TP 濃度變幅為0.011~0.100 mg·L-1（圖4b）。與滅菌組相比，各處理TP 濃度隨時間的延長增幅較小。其中OPB11處理變化最大，結(jié)束時的TP 濃度較初始值增加了0.085 mg·L-1；其余2 個接種處理增幅也均高于對照。在第9天，各處理間的差異較為明顯，表現(xiàn)為OPB10>OPB3、CK2>CK1>OPB11，其中OPB10 處理顯著高于CK1 和OPB11 處理（P<0.05）。對3 個接種處理而言，非滅菌條件下水體菌株的TP 濃度均顯著低于滅菌組（P<0.05），其中OPB10處理的差異最大（0.235 mg·L-1）。

2.4 沉積物磷形態(tài)及APA的變化

2.4.1 試驗前后沉積物中磷形態(tài)的變化

試驗前后沉積物中各形態(tài)磷的含量如圖5 所示。在試驗結(jié)束時，滅菌組弱吸附態(tài)磷（NH4Cl-P）含量變幅為1.28~2.07 mg·kg-1（圖5a），各接種處理均比初始值顯著增加，表現(xiàn)為OPB3 和OPB10 處理顯著高于初始值、CK1 和OPB11 處理（P<0.05），而OPB11 含量較低；非滅菌組NH4Cl-P 含量明顯低于滅菌組，其中OPB3處理低于初始值，而OPB10處理顯著高于CK1。試驗結(jié)束時，滅菌組各處理的可還原態(tài)磷（BD-P）含量相較于初始值均有所下降（圖5b），其中OPB10 處理顯著低于初始值和CK1；在非滅菌組，CK1的BD-P含量最高，與OPB11 處理間差異顯著（P<0.05），不同接種處理的含量順序為OPB3>OPB10>OPB11。

圖5 不同處理下沉積物中各形態(tài)磷的含量Figure 5 Contents of different phosphorus forms in sediments under different treatments

就鐵鋁結(jié)合態(tài)磷（NaOH-P）而言（圖5c），滅菌組的含量變幅為20.12~38.62 mg·kg-1，不同處理表現(xiàn)為CK1>OPB11>CK2、OPB3>OPB10，其中CK1 與其余處理間的差異均達顯著水平，3 個接種處理間差異不顯著；非滅菌組各處理中OPB10 處理較高，與CK2 和OPB3 間差異達顯著水平（P<0.05）。鈣結(jié)合態(tài)磷（HCl-P）為天鵝湖沉積物中含量最高的磷形態(tài)，試驗結(jié)束時除OPB11 處理外，滅菌組其余各處理含量均顯著低于初始值（圖5d），但處理間差異不顯著（P>0.05）；非滅菌組HCl-P 含量變幅為298.90~357.86 mg·kg-1，不同接種處理表現(xiàn)為OPB3>OPB11>OPB10。

2.4.2 試驗前后沉積物中APA的變化

試驗結(jié)束時，各接種處理沉積物的APA 總體表現(xiàn)為非滅菌組高于滅菌組（圖6）。滅菌組APA 變幅為0.66~1.58 μmol·g-1·h-1，不同接種處理大小為OPB3>OPB10>OPB11，其中OPB3 顯著高于其余2 個菌株（P<0.05）；OPB3 和OPB10 處理的APA 分別是CK1的2.40倍和1.87倍。在非滅菌組，試驗結(jié)束時沉積物APA 變幅為1.18~1.66 μmol·g-1·h-1。除CK1 外，各處理APA 較初始值（0.81 μmol·g-1·h-1）均有所增加，其中3 個接種處理顯著高于對照（P<0.05），但不同菌株間差異不顯著（P>0.05）。對同一菌株而言，非滅菌條件下沉積物的APA 高于滅菌組，其中OPB11處理在兩者間的差異最大。

圖6 不同處理下沉積物中APAFigure 6 Alkaline phosphatase activity in sediments under different treatments

3 討論

3.1 解磷菌接種對水體理化因子的影響

近年來，解磷微生物在水體磷生物地球化學循環(huán)中的作用日益受到關注。研究表明，解磷菌接種可使水體理化性質(zhì)發(fā)生一定變化，進而影響到沉積物中磷的釋放[17-20]。例如，Maitra 等[3]發(fā)現(xiàn)，解磷菌可通過降低pH直接促進沉積物鈣結(jié)合態(tài)磷的釋放。本試驗表明，滅菌組不同處理間DO 濃度存在明顯差異，除空白對照CK1外，其余處理均隨培養(yǎng)時間延長而大幅降低。3 個接種處理DO 濃度顯著降低，沉積物-水界面很快呈厭氧狀態(tài)，這主要是解磷菌呼吸作用消耗大量氧氣所致[21]，其中生長速度較快的OPB10 降幅最大；CK2 處理的DO 也出現(xiàn)明顯下降，這可能與試驗期間有少量空氣中細菌進入，存在葡萄糖的降解耗氧有關。非滅菌條件下，CK1 處理由于未添加葡萄糖，微生物生長受到抑制，因而DO 下降不明顯，而其余處理濃度明顯低于滅菌組。但由于沉積物中土著微生物的大量存在，非滅菌組的接種與未接種處理間的DO濃度差異較小。

水體pH在滅菌組和非滅菌組間的差異同樣十分明顯。滅菌條件下，接種處理pH 明顯低于CK1，試驗后期各接種處理均降至7.0以下，且處理間差異較大，微生物呼吸或者有機酸產(chǎn)生可能是本研究水體pH降低的主要原因[22]。然而，非滅菌組由于大量土著微生物的存在，除CK1 外其余處理間pH 差異較?。淮送?，由于微生物數(shù)量較多，種群競爭加劇，這可能導致試驗過程中部分菌體死亡或發(fā)生自溶釋放出堿性物質(zhì)，從而使得后期pH明顯上升[23-24]。

本研究發(fā)現(xiàn)，滅菌組各接種處理水體TP 濃度明顯增加，表明解磷菌促進了天鵝湖沉積物中磷的釋放，其中OPB10 菌株具有較強的解磷能力。兩因素方差分析結(jié)果表明，沉積物是否滅菌對水體TP 影響顯著（F=244.4，P<0.05）。在未滅菌組，藻華區(qū)沉積物中分布著包括解磷菌在內(nèi)的大量微生物，因而自身具有一定的解磷能力；但由于微生物數(shù)量較多，釋放的磷大部分被其吸收利用以維持生長[25]，且接種的解磷菌和土著微生物間存在著一定的種群競爭，以上原因?qū)е铝私饬拙臃N對水體TP 影響效果不明顯，且非滅菌組濃度顯著低于滅菌組。pH、DO 等是影響沉積物磷釋放的重要環(huán)境因子。對水體TP、pH、DO 等進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)TP 濃度與pH 呈顯著負相關（r=-0.87**，P<0.01），表明解磷菌能通過降低pH 影響沉積物中磷的釋放，導致上覆水磷濃度升高[20]。綜上所述，天鵝湖沉積物中解磷菌的接種可對水體理化性質(zhì)產(chǎn)生明顯影響，并對沉積物磷具有一定促溶作用，但可能由于接種量不足等因素影響[26]，增磷效果不顯著；相較于非滅菌組，沉積物在滅菌條件下接種解磷菌的作用效果較為明顯。

3.2 解磷菌接種對沉積物磷形態(tài)的影響

解磷菌可通過酶解或酸解等機制影響沉積物磷的形態(tài)轉(zhuǎn)化，因而在水體磷循環(huán)過程中起著重要作用[8]。NH4Cl-P 是沉積物中活性較強的一種磷形態(tài)[27]，對比試驗前后可見滅菌組NH4Cl-P 含量明顯升高，表明可能存在其他形態(tài)磷向NH4Cl-P 的轉(zhuǎn)化；滅菌組NH4Cl-P含量明顯高于非滅菌組，且大多數(shù)接種處理顯著高于對照（圖5a），說明適量接種解磷菌有助于沉積物磷形態(tài)間的相互轉(zhuǎn)化[28]。對各形態(tài)磷含量進行方差分析（表1），發(fā)現(xiàn)是否滅菌對NH4Cl-P 和NaOH-P 均具有極顯著影響（P<0.01），是否滅菌×菌株對NH4Cl-P和BD-P有顯著影響（P<0.05）。在滅菌條件下，接種解磷菌有利于沉積物中NH4Cl-P 和BDP向上覆水的釋放（圖5a、圖5b）。巢湖水華大規(guī)模暴發(fā)時，沉積物中NH4Cl-P和BD-P含量也大幅降低，其中BD-P 的釋放尤為明顯[29]。沉積物中BD-P 的釋放主要受氧化還原條件的影響[27]。本試驗期間各接種處理水體DO 濃度明顯下降，后期沉積物-水界面呈厭氧狀態(tài)，這為BD-P 的釋放提供了有利條件；且非滅菌組DO 濃度較低，試驗結(jié)束時其沉積物中BD-P的含量降幅也相應較大。

表1 兩因素方差分析檢驗是否滅菌和菌株對沉積物磷形態(tài)的影響Table 1 Two-way ANOVA for effects of sterilization and OPB strain on phosphorus fractions in sediments

堿性磷酸酶在沉積物有機磷的礦化分解中起著重要作用，高APA 有助于界面磷的再生[8]。本試驗表明，大多數(shù)接種處理沉積物的APA 顯著高于對照（P<0.05），說明增加解磷菌數(shù)量有利于提高沉積物的APA[10]。對水體TP 和沉積物APA 進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)未滅菌條件下二者呈顯著正相關（r=0.98**，P<0.01），這與Barik 等[30]的研究結(jié)果相一致。不同接種菌株間相比，OPB10 處理沉積物的APA 較高，且水體TP 濃度增幅較大。可以推斷，天鵝湖潟湖沉積物中分離的OPB10 菌株具有較高的酶分泌能力和較大的解磷潛力。綜上所述，OPB的接種促進了天鵝湖沉積物中磷的釋放，使得上覆水磷的水平明顯增加，從而為大型藻華發(fā)生提供了有利條件。在藻華頻繁暴發(fā)水體，有機解磷菌、沉積物磷形態(tài)（有機磷）、藻生長三者間的相互關系有待于深入研究。

4 結(jié)論

（1）從榮成天鵝湖的西部和湖中心沉積物中共分離得到11株有機解磷菌（OPB），其中在藻華暴發(fā)的湖中心解磷菌種類較多，芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）為OPB的優(yōu)勢菌屬。

（2）嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearother?mophilus）、彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）和短小芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）接種后，底層水體pH 和溶解氧濃度明顯降低。3 株解磷菌的接種均促進了天鵝湖沉積物中磷的釋放，使得上覆水總磷濃度明顯增加。非滅菌組由于土著微生物的生長吸收，試驗期間總磷濃度顯著低于滅菌組。

（3）OPB接種明顯提高了沉積物中堿性磷酸酶活性，其中彎曲芽孢桿菌具有較高的酶分泌和解磷能力。滅菌條件下，解磷菌的接種促進了沉積物磷的形態(tài)轉(zhuǎn)化，接種處理的弱吸附態(tài)磷（NH4Cl-P）含量顯著增加，而試驗后期的厭氧環(huán)境有利于可還原態(tài)磷（BD-P）的釋放。