林俊銘 謝 靜 曾 榮 白永亮 郭艷峰

（1佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528200；2中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康產(chǎn)業(yè)學(xué)院，廣東中山 528436）

卵孢小奧德蘑Oudemansiella raphanipies，別名長根菇，屬傘菌綱、小奧德蘑屬，因菌菇上半部分為暗褐色，且形似雞菌，故只有商品名黑皮雞菌[1-2]之稱。該菌在中國主要分布于四川、福建、云南等省[3-4]，近幾年人工栽培量逐漸上升。卵孢小奧德蘑肉質(zhì)鮮嫩、口感爽脆、營養(yǎng)價值高[5]，富含氨基酸及生物活性物質(zhì)等，有調(diào)節(jié)人體機(jī)能、增強(qiáng)免疫等作用[6-7]，具有較高營養(yǎng)、藥用價值以及廣闊的市場前景。

目前，食用菌多糖提取的方法有水提醇沉法[8]、超聲波提取法[9]、微波提取法[10]、酶提取法[11]、酸堿提取法[12]、超臨界萃取技術(shù)提取法[13]等，然而上述提取方法仍有一些不足，如：水提醇沉法耗時長，提取率低；微波提取法因為熱應(yīng)力導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞；酶提取法成本較高，多糖結(jié)構(gòu)容易破壞；酸堿提取法中強(qiáng)酸強(qiáng)堿容易導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)破壞；超臨界萃取技術(shù)對設(shè)備要求較高，工藝操作復(fù)雜。而超聲波提取法主要是利用超聲波的機(jī)械作用，破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等生物組織，并提高細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)效率，可促進(jìn)多糖成分的釋放。馬曉寧等[14]通過單因素及響應(yīng)面試驗確定杏鮑菇多糖超聲提取的最佳工藝條件，提取率達(dá)14.71%。周理紅等[15]、吳昊等[16]通過超聲波輔助提取法有效提高了綠菇、紅菇多糖的提取率。焦迎春等[17]采用超聲提取最佳工藝獲得的柴達(dá)木大肥菇（柴達(dá)木雙層環(huán)傘菌）多糖具有較強(qiáng)的抗缺氧化效果。王榮琨等[18]比較竹蓀多糖提取方法，結(jié)果超聲波提取法可提高多糖提取率，且提取的多糖抗氧化性最強(qiáng)。

基于超聲波提取法操作簡單、提取率高的特點，研究以卵孢小奧德蘑為原料，經(jīng)真空冷凍干燥粉碎后，采用超聲波提取法提取多糖。試驗通過單因素、正交試驗比較不同的超聲條件（溫度、時間、功率）以及料液比的多糖提取率，最終篩選出最適合卵孢小奧德蘑多糖提取的工藝及條件。研究可為卵孢小奧德蘑精深加工和功能產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原材料及試劑

新鮮卵孢小奧德蘑來源于廣東省肇慶市廣寧縣食用菌種植基地。

試驗所用主要試劑：無水葡萄糖，天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸，廣東廣試試劑科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

試驗所用主要儀器設(shè)備：BSA124S 電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SB-5200DTD 超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；V6 旋渦混勻器，廣東安勝儀器有限公司；DZKW 電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；3-20R 臺式高速冷凍離心機(jī)，上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司；WZJ6-A 振動式藥物超微粉碎機(jī)，濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 卵孢小奧德蘑多糖的提取及測定

1.3.1.1 卵孢小奧德蘑多糖提取

（1）預(yù)處理：挑選新鮮、無損傷腐爛的卵孢小奧德蘑，清洗干凈后于通風(fēng)室內(nèi)晾干表面水分，備用。

（2）真空冷凍干燥及粉碎：取適量預(yù)處理后的卵孢小奧德蘑，于-20 ℃的冷藏室中預(yù)凍24 h；于冷凍溫度為-42 ℃，真空度為7.9 Pa 的條件下，將預(yù)凍卵孢小奧德蘑放入料盤內(nèi)凍干，待料盤內(nèi)卵孢小奧德蘑溫度與冷凍溫度一致時停止凍干。冷凍后卵孢小奧德蘑用超微粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，用干燥器密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）提取多糖：參考徐瀾等[19]的方法稍做修改。稱取適量粉碎后的卵孢小奧德蘑粉末于燒杯中，加入一定比例的去離子水，混合均勻，在超聲清洗機(jī)的最佳條件下超聲提取粗多糖。超聲提取結(jié)束后于5 000 r/min 離心20 min，收集上清液，棄沉淀。將收集的上清液置于2 000 mL 燒杯中，加入等量的無水乙醇，攪拌均勻置冰箱中，于4 ℃下醇沉24 h。醇沉后的溶液于5 000 r/min 離心10 min，棄上清液，收集沉淀物。

（4）多糖凍干：將收集的沉淀物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)殘留的無水乙醇，然后進(jìn)行真空冷凍干燥，最終獲得卵孢小奧德蘑粗多糖。

1.3.1.2 卵孢小奧德蘑多糖測定

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取0.1 g經(jīng)105 ℃恒溫烘干至恒重的葡萄糖于100 mL 燒杯中，加去離子水溶解，定容至1 000 mL。分別吸取不同體積（0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL）的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，用去離子水補至1.0 mL。向試管液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后立即加入5.0 mL 硫酸，靜置10 min 后，用旋渦振蕩儀振蕩30 s，充分混勻反應(yīng)液，于30 ℃水浴中靜置20 min。用雙光束紫外分光光度計于490 nm 處測定吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：y=0.0109x-0.0085，R2=0.9988。

（2）卵孢小奧德蘑多糖的測定

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用苯酚硫酸法進(jìn)行多糖含量的測定，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出多糖含量，最后根據(jù)方程計算得出多糖提取率。

式中：ω—樣品中多糖含量（g/100 g）；C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定液中多糖含量（mg/L）；V—樣品定容體積（mL）；M—樣品質(zhì)量（g）；0.9—葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 卵孢小奧德蘑多糖提取率與超聲溫度的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取0.5 g 卵孢小奧德蘑粉末，按照料液比1∶40加入去離子水，攪拌均勻。超聲功率240 W，于40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的條件下，分別超聲20 min。

1.3.2.2 卵孢小奧德蘑多糖提取率與超聲時間的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取0.5 g 卵孢小奧德蘑粉末，按照料液比1∶40 加入去離子水，攪拌均勻。于超聲溫度70 ℃，超聲功率240 W 的條件下，分別超聲10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。

1.3.2.3 卵孢小奧德蘑多糖提取率與超聲功率的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取0.5 g 卵孢小奧德蘑粉末，按照料液比1∶40 加入去離子水，攪拌均勻。于超聲溫度70 ℃，超聲功率180 W、210 W、240 W、270 W、300 W 的條件下，超聲20 min。

1.3.2.4 卵孢小奧德蘑多糖提取率與料液比的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取0.5 g 卵孢小奧德蘑粉末，按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 加入去離子水，攪拌均勻。于超聲溫度70 ℃，超聲功率240 W 的條件下，超聲20 min。

1.3.3 正交試驗

基于上述單因素試驗結(jié)果，設(shè)計4 因素3 水平的正交試驗，并通過正交試驗確定卵孢小奧德蘑多糖提取的最佳工藝條件。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Microsoft Office、Excel 2010、正交試驗助手軟件，標(biāo)準(zhǔn)偏差分析采用Spss 26.0 軟件，試驗結(jié)果作圖采用Origin 2021軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲溫度對卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

由圖2 可知，卵孢小奧德蘑多糖提取率隨著超聲溫度的上升呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。超聲溫度50 ℃多糖提取率最高，為4.46%，超聲溫度超過50 ℃，提取率逐漸降低。超聲溫度從30 ℃升至50 ℃，溶液黏度逐漸下降，傳質(zhì)速率逐漸加快，導(dǎo)致對細(xì)胞的破壞力不斷增大，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變得更加疏松多孔，因而多糖更容易溶出[20-21]。超聲溫度過高會破壞多糖的分子結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致提取率低[22]。因此，選取超聲溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃作為后續(xù)的正交試驗超聲溫度水平。

圖2 超聲溫度對卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

2.1.2 超聲時間對卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

研究表明，適度延長超聲的時間，可以提高多糖的提取率[9-23]。由圖3 可知，試驗超聲時間內(nèi)卵孢小奧德蘑多糖提取率先逐漸升高后迅速下降，超聲30 min 多糖提取率最高，為5.45%，顯著高于其他超聲時間處理的提取率（P＜0.05）。超聲時間10 min、20 min、30 min 時，多糖提取率逐漸上升，原因為超聲波作用導(dǎo)致的多糖不斷析出，提取率上升。但當(dāng)超聲時間超過30 min 后，部分多糖因長時間受到超聲波的影響，其結(jié)構(gòu)開始遭到破壞，發(fā)生水解現(xiàn)象，導(dǎo)致多糖損失，造成提取率出現(xiàn)快速下降現(xiàn)象[24]。綜上，選取超聲時間為20 min、30 min、40 min 作為正交試驗設(shè)計的三個超聲時間水平。

圖3 超聲時間（min）對卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

2.1.3 超聲功率對卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

由圖4 可知，卵孢小奧德蘑多糖提取率隨超聲功率的不斷增大，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。其中180 W、210 W、240 W 超聲功率下的多糖提取率顯著高于其他處理。超聲功率為210 W 時，多糖提取率達(dá)最高，為4.32%。當(dāng)超聲功率從180 W 升高至210 W 時，多糖提取率提高，原因為超聲波加速破壞細(xì)胞壁，加快多糖物質(zhì)的傳遞[25]；但是當(dāng)超聲功率大于210 W，由于高頻的功率導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞，造成損失，同時開始析出其他雜質(zhì)[26]，多糖提取率反而降低。因此選取180 W、210 W、240 W 為正交試驗的三個超聲功率水平。

圖4 超聲功率（W）對卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

2.1.4 料液比對卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

由圖5 可知，試驗料（g）液（mL）比之間多糖提取率均存在顯著性差異（P＜0.05）；多糖的提取率隨料液比的上升而提高，并于料液比為1∶40時達(dá)峰值（5.50%），料液比大于1∶40時，提取率開始下降。當(dāng)料液比在1∶10～1∶30時，多糖提取率緩慢上升，是由于粉末相對質(zhì)量多，不能均勻分散在溶劑中，導(dǎo)致多糖提取率不高[27]。隨著料液比的上升，多糖的提取率逐漸提高，因為溶劑的增加，溶劑與粉末間接觸面積增大，以及超聲的空化及振動作用，使多糖溶出量增加[28]。料液比超過1∶40 后，多糖提取率下降，這可能是因為過多的溶劑反而使得提取不完全，導(dǎo)致多糖提取率的下降[29]。正交試驗選取料液比1∶30、1∶40、1∶50水平。

圖5 料（g）液（mL）比對卵孢小奧德蘑多糖提取率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果設(shè)計了4 因素3 水平的正交試驗（表1）。

表1 正交試驗設(shè)計

表4 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果中，R值越大則該因素對多糖的提取率影響越大。由表2 可得，對卵孢小奧德蘑多糖提取率影響次序為D（料液比）＞A（超聲溫度）＞C（超聲功率）＞B（超聲時間），料液比對多糖提取率影響最大，超聲時間最小。由正交試驗結(jié)果中的三組均值K1、K2、K3可知，多糖提取率的4因素3水平正交試驗的最優(yōu)組合是A1B1C1D2，即當(dāng)超聲溫度40 ℃、超聲時間20 min、超聲功率180 W 以及料液比1∶40時，提取卵孢小奧德蘑多糖的效果最佳。

最優(yōu)組合進(jìn)行多糖驗證試驗，重復(fù)三次，多糖提取率為5.64%。因此正交試驗的最優(yōu)組合A1B1C1D2可以確定為卵孢小奧德蘑多糖提取率的最佳工藝條件。

3 小結(jié)

研究采用超聲波提取法提取多糖，利用其機(jī)械作用破壞卵孢小奧德蘑的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，提高細(xì)胞內(nèi)的傳質(zhì)效率，促進(jìn)多糖成分的釋放。通過單因素試驗、正交試驗確定超聲波提取卵孢小奧德蘑多糖的最佳工藝條件為超聲溫度40 ℃，超聲時間20 min，超聲功率180 W，料液比1∶40，在此工藝條件下，卵孢小奧德蘑多糖的提取率達(dá)5.64%。研究為卵孢小奧德蘑多糖的進(jìn)一步提取純化和生物活性研究打下了基礎(chǔ)。