李威威,楊 倩,常 瑚,宋 森,李世強(qiáng),程亞輝,岳 鐘,馮 麗,肖博文

(1.保定市第一中心醫(yī)院眼科,河北 保定071000;2.天津市北辰醫(yī)院眼科,天津 300134)

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus,GDM)是指女性在妊娠期間首次發(fā)生糖代謝紊亂的疾病,常有多飲、多食、多尿等癥狀,嚴(yán)重影響妊娠結(jié)局,可引發(fā)流產(chǎn)、難產(chǎn)、嚴(yán)重胰島素抵抗、羊水過(guò)多、酮癥酸中毒、胎兒畸形、胎兒生長(zhǎng)受限、新生兒呼吸窘迫、新生兒低血糖等并發(fā)癥[1-2]。妊娠期出現(xiàn)了糖尿病,也會(huì)引發(fā)視網(wǎng)膜的疾病,GDM患者血糖控制不達(dá)標(biāo)會(huì)對(duì)孕婦的心臟、大腦、腎、視網(wǎng)膜血管等造成不利影響。糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是目前常見(jiàn)的受妊娠影響的嚴(yán)重微血管疾病,常有視力下降、視物模糊、辨色能力降低、眼部疼痛等表現(xiàn),嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)孕婦失明,對(duì)妊娠結(jié)局產(chǎn)生不利影響[3]。因此及時(shí)對(duì)妊娠期女性DR進(jìn)行診斷和干預(yù)治療對(duì)于降低妊娠不良結(jié)局、提高優(yōu)生優(yōu)育質(zhì)量具有重要意義。已有多項(xiàng)研究報(bào)道DR患者血清中微小RNA(miRNA)水平的變化與疾病的進(jìn)展有關(guān),并被認(rèn)為可作為相關(guān)疾病(包括GDM)的生物標(biāo)志物。miR-200c-3p是 miR-200家族的成員,可能通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后翻譯參與調(diào)節(jié)DR進(jìn)展,研究顯示miR-200c-3p可能會(huì)加劇DR的發(fā)展,抑制miR-200c-3p可減輕DR中的焦亡[4]。另外,已有研究顯示miR-200c-3p的水平變化對(duì)妊娠結(jié)局和妊娠進(jìn)展具有功能重要性[5]。miR-20b-5p在糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠上調(diào),miR-20b-5p的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,并抑制其凋亡[6]。然而關(guān)于miR-200c-3p、miR-20b-5p在妊娠期DR患者中的表達(dá)水平尚不明確,因此本文通過(guò)測(cè)定miR-200c-3p、miR-20b-5p 在妊娠期DR患者中的表達(dá)水平探究?jī)烧叩呐R床價(jià)值,為臨床治療妊娠期DR提供新思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2019年1月至2021年1月在本院收治的GDM患者155例,年齡25～34歲,平均(29.28±2.68)歲,根據(jù)其是否伴有DR分為GDM組(80例)和DR組(75例)。同期選取95例正常妊娠期女性為對(duì)照組,年齡24～35歲,平均(29.01±3.10)歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者符合《妊娠合并糖尿病診治指南(2014)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];單胎;孕檢資料完整,依從性良好;能較好的配合各項(xiàng)檢查,認(rèn)知能力正常。排除標(biāo)準(zhǔn):伴有妊娠高血壓、自身免疫性疾病、感染性疾病、甲狀腺疾病、多囊卵巢綜合征等;有自然流產(chǎn)史、習(xí)慣性流產(chǎn)史;非正常受孕,近期使用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物;其他原因引起的眼部疾病等。根據(jù)視網(wǎng)膜病變程度進(jìn)行分組[8]:Ⅰ期:出現(xiàn)視網(wǎng)膜微動(dòng)脈瘤或視網(wǎng)膜小出血點(diǎn);Ⅱ期:視網(wǎng)膜出血或出現(xiàn)黃色硬性滲出;Ⅲ期:視網(wǎng)膜白色棉絮狀軟性滲出;Ⅳ期:有顳側(cè)顯微組織增生,不完全性視網(wǎng)膜脫離,黃斑、血管弓受牽引;Ⅴ期:完全視網(wǎng)膜脫離。Ⅰ期為輕度DR組(30例),Ⅱ、Ⅲ期為中度DR組(26例),Ⅳ、Ⅴ期為重度DR組(19例)。本研究經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò),所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字,符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 檢測(cè)方法 血糖檢測(cè)儀(型號(hào)POCT)購(gòu)于杭州艾康;全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào)DXC800)購(gòu)于貝克庫(kù)爾曼;糖化血紅蛋白分析儀(型號(hào)H50)購(gòu)于深圳邁瑞。采集所有受試者空腹外周靜脈血、餐后2 h靜脈血5 ml,室溫靜置20 min后,3000 r/min離心10 min,收集血清,采用血糖檢測(cè)儀對(duì)受試者空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2 hPG)進(jìn)行測(cè)定。用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定受試者低密度脂膽固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)。采用RT-qPCR法檢測(cè)血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平,RNA提取試劑盒提取血清組織RNA,將一定量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用定量PCR儀對(duì)miR-200c-3p、miR-20b-5p進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95 ℃、90 s,95 ℃、30 s,63 ℃、30 s,72 ℃、15 s;40個(gè)循環(huán)。miR-200c-3p、miR-20b-5p與內(nèi)參U6的引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 三組受試者一般資料比較

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 觀察項(xiàng)目 所有DR妊娠女性患者均進(jìn)行相同治療,對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪,以出院日為隨訪起點(diǎn),記錄患者發(fā)生預(yù)后不良事件的發(fā)生情況,隨訪截至胎兒出生。預(yù)后不良包括孕婦妊高征、胎兒畸形、胎兒發(fā)育遲緩、新生兒視網(wǎng)膜出血等。根據(jù)隨訪結(jié)果分為預(yù)后良好組和預(yù)后不良組。

2 結(jié) 果

2.1 三組受試者一般資料比較 見(jiàn)表1。三組受試者年齡、體重指數(shù)(BMI)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);與對(duì)照組相比,GDM組、DR組患者FPG、2 hPG、LDL-C、TG、TC、miR-200c-3p、miR-20b-5p水平顯著升高(均P<0.05);與GDM組相比,DR組患者FPG、2 hPG、LDL-C、TG、TC、miR-200c-3p、miR-20b-5p水平顯著升高(均P<0.05)。

2.2 不同嚴(yán)重程度DR患者miR-200c-3p、miR-20b-5p水平比較 見(jiàn)表2。與輕度DR組相比,中度、重度DR組患者miR-200c-3p、miR-20b-5p水平顯著升高(均P<0.05);與中度DR組相比,重度DR組患者miR-200c-3p、miR-20b-5p水平顯著升高(均P<0.05)。

表2 不同嚴(yán)重程度DR患者miR-200c-3p、miR-20b-5p 水平比較

2.3 預(yù)后良好組、預(yù)后不良組DR患者一般資料比較 見(jiàn)表3。預(yù)后良好與預(yù)后不良DR患者年齡、BMI比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);與預(yù)后良好組相比,預(yù)后不良組DR患者FPG、2 hPG、LDL-C、TG、TC、血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平顯著升高(均P<0.05)。

表3 預(yù)后良好組、預(yù)后不良組DR患者一般資料比較

2.4 DR患者不良預(yù)后危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析 見(jiàn)表4。將DR患者是否發(fā)生預(yù)后不良為因變量,以年齡、BMI、FPG、2 hPG、LDL-C、TG、TC血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示血清miR-200c-3p高水平、miR-20b-5p高水平為DR患者發(fā)生預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。

表4 DR患者不良預(yù)后危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析

2.5 miR-200c-3p、miR-20b-5p水平對(duì)DR患者預(yù)后不良的診斷價(jià)值 見(jiàn)表5(圖1)。ROC曲線結(jié)果顯示,血清miR-200c-3p表達(dá)水平診斷DR患者不良預(yù)后曲線下面積(AUC)為0.927(95%CI:0.843～0.974),敏感性為77.78%,特異性為91.67%,截?cái)嘀禐?.74%;miR-20b-5p水平診斷DR患者不良預(yù)后AUC為0.848(95%CI:0.746～0.920),敏感性為92.59%,特異性為64.58%,截?cái)嘀禐?.43;兩者聯(lián)合檢測(cè)顯著提高對(duì)DR患者不良預(yù)后的診斷價(jià)值,AUC為0.985(95%CI:0.924～0.999),敏感性為92.59%,特異性為95.83%。兩者聯(lián)合對(duì)DR患者不良預(yù)后的AUC顯著大于血清miR-200c-3p單獨(dú)診斷的AUC(Z=2.364,P=0.018)和miR-20b-5p單獨(dú)診斷的AUC(Z=2.779,P=0.006)。

圖1 miR-200c-3p、miR-20b-5p水平對(duì)DR患者預(yù)后不良診斷價(jià)值的ROC曲線

表5 miR-200c-3p、miR-20b-5p水平對(duì)DR患者預(yù)后不良的診斷價(jià)值

3 討 論

GDM是指女性妊娠前糖代謝正常,妊娠期首次出現(xiàn)的糖耐量異常的一種代謝性疾病,是女性妊娠期常出現(xiàn)的合并癥之一,嚴(yán)重影響孕婦及胎兒的生命健康,隨著人們飲食習(xí)慣的改變、居住環(huán)境的變化,GDM患病率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì),雖然多數(shù)的GDM患者在妊娠后會(huì)逐漸恢復(fù)正常,但患2型糖尿病的概率會(huì)大大增加[9-10]。DR是糖尿病常見(jiàn)的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥,是妊娠期女性視力減退的重要因素,而妊娠期間心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)等的變化又會(huì)加劇DR病情的進(jìn)展,最終導(dǎo)致孕婦視力下降、視物模糊、失明、胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒窘迫、胎兒視網(wǎng)膜出血等不良表現(xiàn)[11-13]。因此探究與妊娠期DR病情密切相關(guān)的新生生物學(xué)因子對(duì)于緩解孕婦病情、降低不良事件的發(fā)生等方面具有積極意義。

研究顯示,糖尿病患者血清中促炎細(xì)胞因子IL-8、TNF-α水平升高,而miR-200c-3p是一種炎癥相關(guān)的miRNA,其可參與炎性細(xì)胞因子的積累[14-15]。在糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變中,機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)和新生血管的形成之間存在密切的關(guān)系,研究證實(shí),在DR中免疫炎癥反應(yīng)是促進(jìn)病理性新生血管的關(guān)鍵因子[16]。Li等[4]也研究顯示高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微內(nèi)皮細(xì)胞中miR-200c-3p水平明顯升高,且升高miR-200c-3p水平可能會(huì)加劇DR的進(jìn)展,而抑制miR-200c-3p可減輕DR中的炎性反應(yīng)。高志強(qiáng)等[17]也研究發(fā)現(xiàn)miR-200c-3p在糖尿病并發(fā)癥患者血清中明顯升高,且其表達(dá)水平與疾病發(fā)展相關(guān),患者中晚期miR-200c-3p水平明顯高于早期。本研究結(jié)果顯示,妊娠期DR及GDM患者血清中miR-200c-3p水平顯著高于正常妊娠者,其中妊娠期DR患者血清中miR-200c-3p水平顯著高于GDM患者,隨著DR病情的加深,miR-200c-3p水平呈現(xiàn)升高的趨勢(shì),與Li等[4]研究結(jié)果基本一致。在長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下,miR-200c-3p水平逐漸升高,由于miR-200c-3p具有促炎作用,引發(fā)體內(nèi)炎癥因子大量積累,致使病理性新生血管生成,導(dǎo)致視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)破壞,加劇視網(wǎng)膜病變。另外,本研究Logistic回歸分析結(jié)果顯示血清miR-200c-3p水平升高是妊娠期DR患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素,并對(duì)妊娠期DR患者的不良預(yù)后具有一定的診斷價(jià)值。

miR-20b-5p是一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)誘導(dǎo)的miRNA,已經(jīng)證實(shí)其在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和血管生成方面具有重要作用[18]。研究顯示,VEGF是DR發(fā)生的重要因素,其破壞血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)的內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接,增加視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移,加速新血管生成從而誘導(dǎo)視網(wǎng)膜微血管功能障礙,促進(jìn)視網(wǎng)膜病變[19]。另外,也有研究顯示,上調(diào)miR-20b-5p會(huì)降低緊密連接蛋白表達(dá),增加BRB的通透性和微血管滲漏,導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜損傷[20]。本研究結(jié)果顯示,妊娠期DR及GDM患者尿液中miR-20b-5p 水平顯著高于正常妊娠者,其中妊娠期DR患者尿液中miR-20b-5p 水平顯著高于糖尿病患者,隨著DR病情的加深,miR-20b-5p 呈現(xiàn)升高的趨勢(shì),這一結(jié)果與Zhu等[20]研究結(jié)果一致。Logistic回歸分析結(jié)果顯示尿液中miR-20b-5p 水平升高是妊娠期DR患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素,并對(duì)妊娠期DR患者的不良預(yù)后具有一定的診斷價(jià)值。ROC曲線結(jié)果表明miR-200c-3p、miR-20b-5p 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)DR患者不良預(yù)后的診斷具有較好的準(zhǔn)確度,且具有較高的靈敏度。

綜上所述,妊娠期DR患者血清miR-200c-3p、miR-20b-5p水平升高,兩者對(duì)于妊娠期DR患者不良預(yù)后具有一定的診斷價(jià)值,血清miR-200c-3p、miR-20b-5p 水平的升高為妊娠期DR患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素,但DR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,影響因素多樣,本研究只是初步探究miR-200c-3p、miR-20b-5p 與妊娠期DR的關(guān)系,樣本量較少,因此仍需深入研究。