鄒騰躍,鄒芳芳,孫亞君,尹俊倩,畢鐵強

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,山東 濰坊 261053;2.山東大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院,山東 威海 264200)

乳腺癌已成為嚴重威脅女性生命的惡性腫瘤之一[1]。在2020年全球最新癌癥數(shù)據(jù)中報道,乳腺癌目前已取代女性肺癌成為全球女性癌癥第一的惡性腫瘤[2]。腫瘤增殖通常依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的生物學(xué)作用機制[3]。NAD的代謝和穩(wěn)定對維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)尤為重要,高NAD水平可增強腫瘤治療抵抗性[4]。首先,煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Nicotinamide phosphoribosyl transferase,NAMPT)作為生理性NAD合成的限速酶,通過控制干細胞信號傳導(dǎo)途徑增加腫瘤發(fā)生率。腫瘤細胞增殖過程被其他NAMPT抑制劑抑制后,NAD的補充和下游代謝平衡會被中斷。抑制NAMPT過程導(dǎo)致NAD耗盡,隨后抑制ATP合成,進而增加表達NAMPT的癌癥起始細胞群對凋亡的敏感性[5]。其次,NAMPT作為一種致癌基因,可作為誘導(dǎo)乳腺癌中基本干細胞途徑的關(guān)鍵因素。這種效應(yīng)是由NAMPT下游因子PARP和SIRT-1所介導(dǎo)。沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(Silencing regulatory protein-1,SIRT-1)是第三類組蛋白去乙?；傅募易宄蓡T,其使用NAD作為輔助因子。此外,SIRT-1的表達失調(diào)與腫瘤、代謝、感染和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)[6]。最近的研究已將SIRT-1與正常干細胞的功能相聯(lián)系起來,此外,SIRT-1在腫瘤細胞耐藥性、腫瘤干細胞特性和化療誘導(dǎo)的干細胞性中的作用仍是未知狀態(tài)[7-8]。基于此,本研究擬通過組織芯片技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測不同臨床特征乳腺癌中NAMPT及SIRT-1表達,旨在為今后乳腺癌患者的臨床治療、預(yù)后改善等提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象選取為2015年1月至2017年12月威海市立醫(yī)院甲狀腺乳腺外科手術(shù)成功切除乳房的381例乳腺癌患者,年齡34～78歲,平均(56.52±10.12)歲;其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者167例,腫瘤直徑≥2 cm者104例,無病生存期≥55個月者329例,隨訪5年存活364例、死亡17例。病例納入標準:均于我院成功完成乳腺外科手術(shù),并經(jīng)術(shù)后病理結(jié)果證實為乳腺癌患者;手術(shù)前未接受過乳腺放療、化療及其他藥物治療者;完成5年隨訪或隨訪至患者死亡,無失訪病例,且臨床檢查資料與隨訪資料齊全者等。排除標準:伴有其他嚴重惡性腫瘤者;既往參與過其他試驗者;伴有傳染性疾病者;復(fù)發(fā)性乳腺癌患者等。本臨床試驗經(jīng)威海市立醫(yī)院倫理委員會審核并同意。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑:兔抗人Anti-Visfatin antibody抗體及兔抗人重組Anti-SIRT-1抗體均購自美國Abcam公司。

1.2.2 組織芯片技術(shù):收集381例乳腺癌患者的病理組織標本,樣本蠟塊進行蘇木精-伊紅染色法(HE)染色后觀察,選定并分別在HE切片和相應(yīng)石蠟組織塊上標記取樣組織的位點,用內(nèi)徑0.6 mm的不銹鋼針進行穿刺,深度2～3 mm,將其固定于模具蠟塊板上的小孔內(nèi);在切片成型前,蠟塊需在4 ℃的冰箱中預(yù)冷處理4 h,然后取出蠟塊在切片機套板上進行修正。用-20 ℃預(yù)冷冰袋貼覆在模具蠟塊表面膜上5～10 min左右后,快速連續(xù)切片30～50張左右,再用冰袋冷凍出組織塊。將模具蠟塊以4 μm厚度均勻的連續(xù)切片敷貼于載玻片或尼龍膜等固相載體上,完成組織芯片制片。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法(SP法):首先,將組織切片放置在二甲苯甘油中加熱脫蠟,在不同梯度的乙醇溶液中重新水化后進行抗原修復(fù),在3%過氧化氫(H2O2)溶液中脫洗10 min后注入20%山羊血清室溫下封閉1 h;隨后,分別滴加兔抗人Anti-Visfatin antibody抗體及重組Anti-SIRT-1抗體,再分別用20%山羊血血清稀釋(分別為1∶1000、1∶500)抗體,4 ℃冰箱過夜;最后,組織切片用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶液清洗3次后進行孵育。

1.2.4 結(jié)果判定:免疫球蛋白的染色評分結(jié)果基于免疫球蛋白的染色強度值標準和陽性細胞百分比。染色強度判定標準:細胞無著色(0分),細胞著色為淡黃色(1分),細胞著色為深棕色(2分),細胞著色為褐色(3分)[8]。陽性細胞百分比:陽性細胞<25%(0分),陽性細胞比值介于25%～50%之間(1分),陽性細胞比值介于51%～75%之間(2分),陽性細胞比值>75%(3分)。以免疫球蛋白的染色強度值及陽性細胞百分比相加得到的加權(quán)系數(shù)總和得出免疫球蛋白表達的最終得分,其中,染色強度與陽性細胞比值得分相加≤3分為低表達,>3分為高表達。

1.3 觀察指標 分析三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌患者NAMPT及SIRT-1的蛋白表達,并分析其與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小、無病生存期、5年存活率等臨床病特征之間的關(guān)系及NAMPT表達與SIRT-1表達的關(guān)系,采用Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗分析NAMPT、SIRT-1表達與臨床特征之間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析使用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行。計數(shù)資料采用[例(%)]表示,兩組比較采用χ2檢驗;采用Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗分析NAMPT、SIRT-1表達與臨床特征之間的相關(guān)性;P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌患者NAMPT及SIRT-1表達情況比較 三陰性乳腺癌患者NAMPT高表達率高于非三陰性乳腺癌患者(P<0.05),見表1。

表1 三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌患者NAMPT及SIRT-1表達情況比較[例(%)]

2.2 乳腺癌中NAMPT表達與患者臨床特征的關(guān)系 年齡≥56歲、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無病生存期<55個月的乳腺癌患者NAMPT高表達率高于年齡<56歲、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無病生存期≥55個月的乳腺癌患者(均P<0.05),見表2。

表2 乳腺癌中NAMPT表達與患者臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 乳腺癌中SIRT-1表達與患者臨床特征的關(guān)系 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無病生存期<55個月的乳腺癌患者SIRT-1高表達率高于年齡<56歲、無病生存期≥55個月的乳腺癌患者(均P<0.05),見表3。

表3 乳腺癌中SIRT-1表達與患者臨床特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 乳腺癌患者NAMPT與SIRT-1表達的關(guān)系 NAMPT高表達的乳腺癌患者SIRT-1高表達率高于SIRT-1低表達率(P<0.05),見表4。

表4 乳腺癌患者NAMPT與SIRT-1表達的關(guān)系[例(%)]

2.5 乳腺癌患者NAMPT及SIRT-1表達情況與臨床特征之間的相關(guān)性 乳腺癌患者NAMPT、SIRT-1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無病生存期呈正相關(guān)(r=0.079、0.505、0.462、0.497,均P<0.05),見表5。

表5 乳腺癌患者NAMPT及SIRT-1表達情況與臨床特征之間的相關(guān)性

3 討 論

隨著近年來科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,人們的健康防病意識越來越強,這使得癌癥患者在早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療方面得到了新起點,盡管目前對乳腺癌的治療取得一定的進展,但仍有許多中晚期乳腺癌患者的病情無法得到有效的控制。但對于乳腺癌的臨床分子分型、治療方式、預(yù)后預(yù)測等方面還需要進行更為完善的分子病理學(xué)研究及臨床試驗。故而,提高腫瘤組織的靶向化療敏感性,延緩腫瘤細胞的快速進展,提高腫瘤患者的化療生存率,已成為現(xiàn)代抗腫瘤靶向藥物治療中急需解決的重點問題。本研究通過分析乳腺癌患者NAMPT及SIRT-1的表達,取得了較好的結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示,三陰性乳腺癌患者NAMPT高表達率高于非三陰性乳腺癌患者,年齡≥56歲、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無病生存期<55個月的乳腺癌患者NAMPT高表達率較高,且NAMPT表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無病生存期呈正相關(guān),提示三陰性乳腺癌患者NAMPT為高表達,且其表達與乳腺癌患者臨床特征密切相關(guān)。NAMPT可催化煙酰胺轉(zhuǎn)化為煙酰胺單核苷酸(Nicotinamide single nucleotide,NMN)過程,是NAD補救途徑中的限速步驟[9-11]。實驗證明NAMPT在許多腫瘤類型中過表達,且在乳腺癌中NAMPT已被證實是一種有效的靶向癌基因[12]。許多Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗開始推廣NAMPT抑制劑的使用[13-14]。目前已有實驗室正在探索針對NAMPT的新藥設(shè)計,為乳腺癌患者的臨床治療提供新一代腫瘤靶向抑制劑,通過抑制劑抑制NAMPT活性作用于NAD可發(fā)揮減少腫瘤細胞糖酵解、核苷酸合成和腺嘌呤核苷三磷酸生成等作用,進而抑制患者病情進展[15]。此外,NAMPT還可作為控制其他NAD依賴性蛋白家族途徑中的上游因子,NAD+是SIRT-1的限速輔因子,其調(diào)節(jié)成為調(diào)節(jié)SIRT-1功能的重要工具[16]。SIRT-1則傾向于通過賴氨酸殘基的H3脫乙?；瘉砑せ罨蛞种铺囟ò谢虻霓D(zhuǎn)錄[17]。進一步分析SIRT-1與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無病生存期<55個月的乳腺癌患者SIRT-1高表達率較高,SIRT-1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無病生存期呈正相關(guān),且NAMPT高表達的乳腺癌患者SIRT-1高表達率高于SIRT-1低表達率,進一步說明NAMPT可影響SIRT-1的表達,且SIRT-1的表達與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。分析原因可能為SIRT1作為SRtuin家族成員之一,可參與應(yīng)激反應(yīng)、新陳代謝、細胞衰老及增殖等,在腫瘤形成中主要起促癌基因作用。

目前,臨床試驗已證實乳腺癌患者可對NAMPT抑制劑敏感,而本研究進一步證實NAMPT可驅(qū)動干細胞與干細胞信號通路的上調(diào),且NAMPT可影響SIRT-1的表達[18]。因此,可將NAMPT、SIRT-1作為乳腺癌治療和復(fù)發(fā)中的新的治療靶點,在乳腺癌細胞中抑制NAMPT的高表達可能有助于抑制去分化;且對具有化療抵抗性的腫瘤使用NAMPT抑制劑可以抑制SIRT-1的表達,進而抑制腫瘤細胞增殖,同時提高腫瘤對于化療藥物的敏感性,有助于提高乳腺癌患者的臨床治療效果[19]。最近的研究強調(diào)了這些介導(dǎo)腫瘤化療耐藥性的途徑的重要性,并且干細胞信號通路的上調(diào)與腫瘤細胞的放療耐藥性相關(guān)[20]。

綜上,NAMPT在三陰性乳腺癌中表達明顯上調(diào),NAMPT可影響SIRT-1的表達,同時年齡可能影響NAMPT及SIRT-1的表達,且兩者高表達預(yù)示患者可能出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差。NAMPT及SIRT-1的表達可能作為乳腺癌治療和復(fù)發(fā)中的新的生物學(xué)分子治療靶點,為改善患者的不良預(yù)后提供明確的研究方向。但本研究亦存在一定不足,如樣本量較少、為單中心研究、未完全明確三陰性乳腺癌患者NAMPT及SIRT-1的表達機制及二者對乳腺癌的具體作用機制等,仍有待臨床進一步研究并證實NAMPT、SIRT-1在乳腺癌中的表達及其臨床意義。