高二可，錢 峰，金齊力

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233004；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233004）

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤［1］。在我國確診的肺癌患者中，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer cell，NSCLC）約占八成［2］。讓人遺憾的是，NSCLC 的預(yù)后差，很多患者在確診時(shí)就已經(jīng)發(fā)展到晚期或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，五年生存率僅約為百分之十五，嚴(yán)重影響人類的健康安全［3，4］?；熓桥R床治療非小細(xì)胞肺癌的常見治療方案，但化療藥物的敏感性低，治療效果不理想。隨著分子靶向藥的出現(xiàn)，NSCLC 的治療效果顯著提升。但臨床上多數(shù)患者在使用靶向藥后，出現(xiàn)基因突變，導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生，因此需要開發(fā)新的靶向藥來解決相應(yīng)的治療問題。

芳香烴受體（aromatic hydrocarbon receptor，AhR）存在于細(xì)胞質(zhì)中，需依賴配體激活來發(fā)揮功能，是堿性螺旋-環(huán)-螺旋-Per/Arnt/Sim（bHLH-PAS）蛋白家族的一員，其bHLH 結(jié)構(gòu)域是與DNA 結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能的常見成分，而另一部分兩個(gè)PAS 結(jié)構(gòu)域則分別與AhR 受體結(jié)合及與AhR 核易位子（ARNT）形成二聚體［5］。在靜息狀態(tài)下，AhR 在細(xì)胞質(zhì)中與兩個(gè)熱休克蛋白90（HSP90）、乙型肝炎X相關(guān)蛋白2（XAP2）和前列腺素E 合成酶3（P23）形成復(fù)合體［6］。配體與其結(jié)合并激活后，AhR 在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生穿梭，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，穿梭的過程中HSP90 被分離出去，從而暴露出PAS 結(jié)構(gòu)域與AhR 結(jié)合，以調(diào)節(jié)不同異種生物反應(yīng)元件的表達(dá)。除此之外，AhR 還被證明與增殖、發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)［7］。有研究證實(shí)AhR 的激活通過增加CDK 抑制物P27kip1 的表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞的增殖［8］。也有研究證實(shí)，AhR 激動(dòng)劑四氯二苯并二惡英（tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）（0.1～100 nmol/L）的處理顯著減少了人結(jié)腸癌細(xì)胞的集落形成和增殖［9］。犬尿氨酸作為AhR 激動(dòng)劑，也被報(bào)道過通過激活A(yù)hR 而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，AhR 有可能會(huì)成為未來治療腫瘤的靶點(diǎn)之一。

苯烯莫德是一種新型的、來源于具有發(fā)光特性的革蘭氏陰性桿菌的作用局部的AhR 激動(dòng)劑［10］。目前苯烯莫德1% 乳膏（VTAMA?）于2022 年5 月獲得美國FDA 批準(zhǔn)，用于成人斑塊型銀屑病的局部治療。它能與多種細(xì)胞類型的AhR 特異性結(jié)合并激活A(yù)hR，包括CD4+T 細(xì)胞、HaCaT 細(xì)胞和人類皮膚移植物［11，12］。目前的研究表明苯烯莫德通過激活A(yù)hR 調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和皮膚屏障蛋白的表達(dá)以及抗氧化活性，促進(jìn)皮膚屏障的正常化［13，14］。然而現(xiàn)階段國內(nèi)外對(duì)于苯烯莫德的機(jī)制研究?jī)H限于其激活A(yù)hR，調(diào)節(jié)免疫和抗炎維護(hù)皮膚屏障完整性的作用，對(duì)腫瘤是否有抗腫瘤作用尚未可知。本研究闡明了苯烯莫德對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并對(duì)其作用機(jī)制作進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1 試劑

苯烯莫德（Tapinarof，CAS：79338-84-4）購于中國上海MedChemExpress 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基，胰蛋白酶（含EDTA 和酚紅）購于美國Gibco 公司；胎牛血清購于南美Ex Cell Biologic 公司；青霉素-鏈霉素雙抗（100×），CCK-8 試劑購于中國Biosharp 公司；二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）購于中國Solarbio 公司；4%組織細(xì)胞固定液，結(jié)晶紫試劑，RIPA 裂解液，PMSF（100 mM），Western 一抗稀釋液，Western 二抗稀釋液，BCA 蛋白定量試劑盒，HRP 生物素標(biāo)記二抗兔抗購于中國上海碧云天公司；PAGE 凝膠快速制備試劑盒購于上海雅酶生物公司；PVDF 轉(zhuǎn)印膜（0.22 μm）購于美國Millipore 公司；兔源性一抗GAPDH、β-actin、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、CDK2 和P21 購于美國Cell Signaling Technology 公司；AnnexinV-FITC 細(xì)胞凋亡試劑盒，細(xì)胞周期試劑盒購于中國杭州聯(lián)科生物公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （gDNA digester plus）購于上海翊圣生物；熒光定量PCR 試劑盒購于中國Biosharp 公司；人源非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞株（美國菌種保藏中心）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞癌細(xì)胞A549 細(xì)胞用含10% 胎牛血清、1% 青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)液，放置37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d 給細(xì)胞換液或傳代。

1.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

選擇狀態(tài)較好的A549 細(xì)胞，消化離心，加完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞懸液濃度為2×103個(gè)/mL。在6 孔板中每孔接種900 個(gè)細(xì)胞，混勻后放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，用不同濃度（0、2.5、5、10、20、40）μmol/L 的苯烯莫德分別作用A549 細(xì)胞，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)。用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)成克隆團(tuán)后（約9 天）棄去上清，PBS 輕洗細(xì)胞兩次，去除殘留培養(yǎng)基，各孔分別加入600 μL 的4%多聚甲醛，固定時(shí)間20 min。棄掉固定液，PBS 輕輕潤洗一次，各孔分別加入550 μL 的結(jié)晶紫溶液，染色時(shí)間20 min。漂洗染液后，放入42 ℃干燥箱中烘干。在亮光處拍照保存照片，并分區(qū)計(jì)細(xì)胞克隆數(shù)。每組5 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

選擇狀態(tài)較好的A549 細(xì)胞，消化離心，調(diào)細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL。在96 孔板中每孔接種100 uL 細(xì)胞懸液，周圍加入PBS，防止細(xì)胞板孔中的液體揮發(fā)，繼續(xù)培養(yǎng)過夜或6 h 以上。用8 組濃度（0、5、10、20、40、60、80、100）μmol/L 的苯烯莫德分別處理A549 細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。避光配制含10%CCK-8 試劑的混合液，現(xiàn)配現(xiàn)用。棄去上清含藥物的培養(yǎng)液，各孔加入100 μL 混合液放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)約40 min。設(shè)置酶標(biāo)儀的單波長(zhǎng)為450 nm，逐一精準(zhǔn)測(cè)量并記錄各孔OD 值。計(jì)算出各組細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞活力=［（實(shí)驗(yàn)孔-空白孔）/（對(duì)照孔-空白孔）］×100%。

1.5 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

選擇狀態(tài)較好的A549 細(xì)胞，消化離心，調(diào)細(xì)胞懸液的濃度為1×106個(gè)/mL。6 孔板每孔接種400 μL，后用完全培養(yǎng)基定容至2 mL ，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。用不同濃度（0、5、10、20）μmol/L 的苯烯莫德分別處理A549 細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。消化離心收集細(xì)胞，將預(yù)冷固定液（PBS∶無水乙醇=4∶3）加入管底細(xì)胞中，小心吹散。后放入-20 ℃冰箱固定過夜（可保存一個(gè)月再上機(jī)）。上機(jī)前將固定細(xì)胞離心，棄掉上層固定液。加2 mL PBS 再次水化細(xì)胞，離心棄上清。加入300 μL DNA staining solution，吹勻，4 ℃避光孵育半小時(shí)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

選擇狀態(tài)較好的A549 細(xì)胞，消化離心，調(diào)細(xì)胞懸液的濃度為1×106個(gè)/mL。6 孔板每孔接種300 μL，后用完全培養(yǎng)基定容至2 mL，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜或6 h 以上。用不同濃度（0、10、20、40）μmol/L的苯烯莫德分別處理A549 細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。消化離心收集細(xì)胞。設(shè)離心機(jī)轉(zhuǎn)速為800 r/min，離心5 min，棄上清收集沉淀。使用預(yù)冷的PBS 清洗2次。用500 μL 1×結(jié)合緩沖液混勻細(xì)胞，再每組細(xì)胞懸液中分別加入10 μL Annexin V-FITC，8 μL 碘化丙啶（PI）熒光染液，并輕輕混勻。室溫避光孵育。5 min 后置流式細(xì)胞儀檢測(cè)。PI 陰性而PITC陽性是早凋細(xì)胞（右上象限），雙陽性是晚凋細(xì)胞（右下象限），凋亡率為兩者之和。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)

1.7.1 細(xì)胞RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)較好的細(xì)胞，消化離心，鋪板。細(xì)胞貼壁后加40 μmol/L 的苯烯莫德，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄上清，加入PBS 潤洗兩遍。每孔加1 mL 的Trizol ，輕輕吹打十幾次以充分裂解細(xì)胞，收集在EP 管中，室溫靜置5 min。加200 μL 氯仿，震蕩，呈粉紅色渾濁狀后，放于室溫2～3 min。后4 ℃ 12 000×g離心15 min。吸水相至新EP 管中。加500 μL 異丙醇，充分搖勻，放于冰上5～10 min。后4 ℃ 12 000×g離心10 min。倒掉上清，RNA 留于管底（肉眼觀察可見白色沉淀物）。加入75% 乙醇，輕輕搖動(dòng)EP 管，使RNA 懸浮。后在4 ℃ 超速離心機(jī)中以7 500×g離心5 min。重復(fù)兩次。室溫將乙醇晾干后，加適量DEPC 水。測(cè)量RNA 濃度及純度。儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。按照上海翊圣生物逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，獲得cDNA，于-20 ℃保存。

1.7.2 熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn) 引物有上海生工生物合成，GAPDH 上游序列：TCAAGAAGGTGGTGAAGAG，GAPDH 下 游 序 列 ：AGGTGGAAGAATGGGAGTTG；Bcl-2 上游序列：TCGCCCTGTGGATGACTGAGTAC，Bcl-2 下游序列 ：ACAGCCAGGAGAAATCAAACAGAGG；Bax 上 游 序 列 ：AGCGACTGATGTCCCTGTCTCC，Bax 下游序列：AGATGGTGAGTGAGGCGGTGAG；FasL 上游序列：TTCATGGTTCTGGTTGCCTTGGTAG，F(xiàn)asL 上游序列：GCTGTGTGCATCTGGCTGGTAG。配制 20 μL 反應(yīng)體系，全程避光在冰上操作（設(shè)3 個(gè)復(fù)孔），cDNA 模板按1∶20 稀釋，每管樣品反應(yīng)體系加樣如下∶SYBR Green qPCR Mix 加10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各加0.4 μL，cDNA 模板加2 μL，雙蒸水加7.2 μL。加完之后，在渦旋振蕩器上震蕩20 s混勻，瞬離。放入熒光定量PCR 儀器中，使用三步法反應(yīng)程序，調(diào)相關(guān)參數(shù)，如下：95 ℃預(yù)變性，時(shí)間3 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，循環(huán)40 次，最后根據(jù)羅氏儀器推薦程序設(shè)置分析溶解曲線。導(dǎo)出每個(gè)樣品的ct 值，用2-△△ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，歸一化后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 Western Blot 蛋白免疫印跡

1.8.1 細(xì)胞蛋白提取 將6 孔板中上層培養(yǎng)液棄掉，用預(yù)冷PBS 潤洗細(xì)胞兩次。加入適量含有1%PMSF 的RIPA 裂解液，每孔約80～120 μL。在冰上裂解2 min。用細(xì)胞刮刀順時(shí)針來回刮下細(xì)胞，吸取細(xì)胞粘液于EP 管中。在冰上放置20～30 min。用4 ℃超速離心機(jī)12 000 rpm 離心30 min。吸取上清于EP 管中即得到蛋白溶液?？蓵簳r(shí)保存于-80 ℃冰箱。后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)取出，再用BCA 蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.8.2 SDS-PAGE 凝膠電泳 按照PAGE 凝膠試劑盒說明書制備好凝膠，現(xiàn)配現(xiàn)用。將5×蛋白上樣緩沖液均勻混入蛋白樣品中，稀釋成1×蛋白上樣緩沖液。100 ℃ 金屬浴煮樣10 min。變性后可直接進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，或保存在-20℃。根據(jù)蛋白表達(dá)含量每孔加樣20～50 μg。在電泳槽中灌滿電泳液。用80 V 恒壓，跑濃縮膠30 min。后上調(diào)電壓至110 V ，跑分離膠1 h。將PVDF 膜切成一定大小，放入甲醇中激活十幾秒。后小心夾起泡進(jìn)預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液中。打開轉(zhuǎn)膜夾，黑色面放于底層，依次鋪上海綿和濾紙，把切好的凝膠轉(zhuǎn)移到濾紙上，再小心夾起PVDF 膜（不能有折痕），鋪在凝膠表面，用剝膠板小心去除氣泡，最后再依次鋪上濾紙和海綿，夾好轉(zhuǎn)膜夾，放入轉(zhuǎn)膜槽。轉(zhuǎn)膜夾黑色的一面朝向負(fù)極，白色的一面朝向正極。泡沫箱底部鋪入薄冰，后放入轉(zhuǎn)膜槽，再把預(yù)冷的1×轉(zhuǎn)膜液倒入槽內(nèi)。蓋好蓋子，用冰塊把泡沫箱填滿，調(diào)恒流200 mA，轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，打開轉(zhuǎn)膜夾，用鑷子夾出PVDF 膜，并作標(biāo)記。室溫封閉1～2 h。封閉結(jié)束后，做相應(yīng)標(biāo)記，4 ℃ 冰箱過夜孵育一抗。敷完一抗后，用1×TBST 震蕩洗膜3 次，10 min 一次。將PVDF 膜置于按照1∶4 000 配制的二抗中，室溫孵育二抗1 ～2 h。敷完二抗后，用1×TBST 震蕩洗膜3 次，10 min 一次。在避光條件下，將PVDF 膜放入配制好的顯影液中（ECL A 液：B 液=1∶1），用移液槍使膜均勻淋上顯影液，用Tanon-5200 曝光儀顯出各條帶。利用Image j 軟件分析出各樣本灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 苯烯莫德抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖

苯烯莫德化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1A。用不同濃度的苯烯莫德分別處理A549 和H1299 細(xì)胞系約8 d。克隆形成結(jié)果顯示，A549 和H1299 兩種細(xì)胞形成的克隆數(shù)均顯著受到抑制（P＜0.01）。且隨著苯烯莫德的濃度逐漸增大，抑制作用越明顯，呈濃度依賴性，如圖1B-D 所示。CCK-8 結(jié)果顯示不同濃度苯烯莫德作用A549 和H1299 細(xì)胞24 h 后，顯著抑制的細(xì)胞活力（P＜0.01），并呈濃度依賴性。其中高濃度的苯烯莫德對(duì)A549 細(xì)胞活性抑制作用更明顯（P＜0.01），如圖1E-F。

圖1 苯烯莫德抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖Fig 1 Tapinarof inhibits the proliferation of non-small cell lung cancer cells

2.2 苯烯莫德誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡

用不同濃度（0、10、20、40）μmol/L 的苯烯莫德處理A549 細(xì)胞48 h，采用Annexin V-FITC 雙染法流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果如圖2A 所示。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組（0 μmol/L）相比，20、40 μmol/L 濃度的苯烯莫德處理A549 細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率逐漸增加（P＜0.01），并呈濃度依賴性，如圖2B所示。

圖2 苯烯莫德誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡Fig 2 Tapinarof induces apoptosis of A549 cells

2.3 苯烯莫德調(diào)控A549 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及基因mRNA 表達(dá)

用不同濃度（0、10、20、40 μmol/L）的苯烯莫德處理A549 細(xì)胞48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 μmol/L 組相比，20 和40 μmol/L 濃度的苯烯莫德顯著上調(diào)cleaved-caspase 3 和cleaved-PARP 的表達(dá)量（P＜0.01），并呈劑量依賴性，如圖3A-C 所示。熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 μmol/L 組相比，40 μmol/L濃度苯烯莫德處理組降低了抗凋亡基因Bcl-2 mRNA 的表達(dá)，同時(shí)增加了促凋亡基因Bax、Bad 和Fasl mRNA 的表達(dá)（P＜0.01），如圖3D 所示。

圖3 苯烯莫德調(diào)控A549 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及基因mRNA 表達(dá)Fig 3 Tapinarof regulates the expression of apoptosis related proteins and genes in A549 cells

2.4 苯烯莫德誘導(dǎo)A549 細(xì)胞阻滯在G1 期

用不同濃度（0，5，10，20）μmol/L 的苯烯莫德作用A549 細(xì)胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0 μmol/L 組G1 期細(xì)胞比率為61.2%，10 μM 組G1 期細(xì)胞比率為66.88%，20 μmol/L 組G1 期細(xì)胞比率為75.72%，如圖4A 所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相比0 μmol/L 組，10 μmol/L 和20 μmol/L 組的G1 期細(xì)胞比率顯著升高（P＜0.01），S 期和G2 期細(xì)胞比率均有所下降，如圖4B 所示。這些結(jié)果說明苯烯莫德會(huì)誘導(dǎo)A549細(xì)胞系阻滯在G1 期。不同濃度苯烯莫德作用于A549 細(xì)胞24 h 后，用Western Blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了周期相關(guān)蛋白P21 和CDK2 蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯烯莫德可以上調(diào)P21 蛋白而下調(diào)CDK2 蛋白的表達(dá)（P＜0.01）。如圖5A～C。

圖4 苯烯莫德誘導(dǎo)A549 細(xì)胞周期阻滯Fig 4 Tapinarof induces cell cycle arrest in A549

圖5 細(xì)胞周期G1期相關(guān)蛋白P21 和CDK2 蛋白的表達(dá)Fig 5 Expression of P21 and CDK2 proteins associated with G1 phase of the cell cycle

2.5 苯烯莫德抑制A549 細(xì)胞中AKT 的磷酸化水平而增加FOXO1 水平

AKT 在細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用，因此采用Western Blot 檢測(cè)總AKT、p-AKT 和FOXO1 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示與0 μmol/L 組相比，苯烯莫德降低A549 細(xì)胞p-AKT 的表達(dá)（P＜0.01），增加FOXO1 蛋白表達(dá)（P＜0.01），而總AKT 無明顯變化，如圖6A～C 所示。

圖6 苯烯莫德對(duì)p-AKT 和FOXO1 蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Effects of tapinarof on expression of p-AKT and FOXO1 protein

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，苯烯莫德能明顯抑制NSCLC 細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1 期阻滯，并促進(jìn)凋亡。苯烯莫德作用NSCLC 細(xì)胞后，cleaved-caspase 3 和cleaved-PARP 蛋白表達(dá)上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA 表達(dá)下降而促凋亡基因Bax、Bad、FasL mRNA 表達(dá)增加。在細(xì)胞周期時(shí)相進(jìn)程方面，苯烯莫德誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G1 期，并上調(diào)P21 蛋白的表達(dá)而抑制CDK2 蛋白的表達(dá)。在進(jìn)一步的機(jī)制研究中，Western Blot 結(jié)果顯示p-AKT 表達(dá)下降，而FOXO1 表達(dá)增加，因此苯烯莫德的抗腫瘤作用可能與AKT/FOXO1 信號(hào)通路有關(guān)。這些結(jié)果表明苯烯莫德對(duì)A549 細(xì)胞有抗腫瘤作用。

苯烯莫德是一種小分子AhR 激動(dòng)劑，可特異性結(jié)合并激活A(yù)hR［15］。已有研究表明，在體內(nèi)外研究中，苯烯莫德可直接結(jié)合并激活多種細(xì)胞類型，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的CYP1A1 和CYP1B1 等多種與新陳代謝相關(guān)基因的表達(dá)，并誘導(dǎo)AhR 的核易位［12］。然而其在腫瘤治療方面是否具有抗腫瘤作用尚未有研究報(bào)道。在本研究中發(fā)現(xiàn)苯烯莫德可以顯著抑制NSCLC 細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，這對(duì)苯烯莫德藥物用于抗腫瘤具有重大意義。

Caspase 級(jí)聯(lián)信號(hào)在內(nèi)外源性細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。在其成員中，caspase 3 在啟動(dòng)細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，其催化的高度激活是細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞死亡的常見引發(fā)劑。PARP 在體內(nèi)主要被caspase 3 裂解，是檢測(cè)DNA 損傷的關(guān)鍵酶，所以PARP 的裂解產(chǎn)物也被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)生物學(xué)標(biāo)志。有研究表明天然產(chǎn)物曲拉林通過激活caspase 3 和PARP 有效誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。在本研究中發(fā)現(xiàn)，Tapinaorf 作用A549 細(xì)胞后，cleaved-caspase 3 蛋白和cleaved-PARP 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。Bcl-2、Bcl-xl 、Bax 和Bad 是Bcl-2 家族的重要成員，主要介導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡（線粒體依賴性），它們之間的平衡調(diào)控著細(xì)胞凋亡。Bax 與Bcl-2 比值的增加，會(huì)使線粒體釋放細(xì)胞色素c，進(jìn)而裂解caspase 3 和 RARP ，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡［16］。有研究證實(shí)在卵母細(xì)胞中，多環(huán)芳烴7，12-二甲基苯［a］蒽可以靶向AhR 上調(diào)促凋亡分子Bax 的表達(dá)，導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡［17］。另一方面，F(xiàn)as/FasL 在外源性細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，當(dāng)死亡受體被外在因素刺激時(shí)，二者結(jié)合激活caspase 8 和caspase 3，活化的caspase 3 切割蛋白質(zhì)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡［18］。在本研究中，通過熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A549 細(xì)胞經(jīng)苯烯莫德作用后，促凋亡基因Bax、Bad 和FasL mRNA 水平上調(diào)，而抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平下調(diào)。這些結(jié)果表明苯烯莫德可以通過內(nèi)在和外在途徑誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。

許多化合物治療腫瘤的策略側(cè)重于誘導(dǎo)細(xì)胞周期的阻滯［19，20］。細(xì)胞周期有四個(gè)不同階段，包括G1、S、G2 和M 期，通常由幾種周期蛋白依賴性激酶（CDK）調(diào)節(jié)［21］。G1/S 期細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變主要由cyclinD-CDK4/6（早期）和cyclinE-CDK2（晚期）兩種周期蛋白/CDK 復(fù)合物調(diào)控，已有研究表明，其通過促進(jìn)RB（視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤）磷酸化調(diào)控細(xì)胞周期［22］。P21 蛋白可以抑制CDK2 蛋白的表達(dá)，是G1/S 期轉(zhuǎn)變的負(fù)調(diào)控因子，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯在G1期。有研究證實(shí)，桑葚素和抗精神藥物佛羅林肝癌HepG7 和Huh1 細(xì)胞中上調(diào) P21 蛋白表達(dá)而抑制CDK2 的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1 期［23，24］。在本研究中也顯示，苯烯莫德增加了P21 蛋白的表達(dá)而抑制CDK2 的表達(dá)，促使非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞阻滯在G1 期。

AKT 在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞生存、增殖、凋亡等過程。磷酸化AKT（p-AKT）參與細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的調(diào)控［25］。過表達(dá)p-AKT被認(rèn)為是治療腫瘤一個(gè)靶點(diǎn)。例如，已有報(bào)道顯示p-AKT 的高表達(dá)與乳腺癌、狀甲狀腺癌和結(jié)直腸癌患者的癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［26］。也有研究表明，脂聯(lián)素激活A(yù)KT 信號(hào)通路防止心肌細(xì)胞凋亡來保護(hù)心肌，姜黃素可以通過降低p-AKT 表達(dá)來抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［27，28］。在本研究中發(fā)現(xiàn)苯烯莫德對(duì)總AKT 的表達(dá)無明顯影響，而降低了p-AKT 的活性，表明其對(duì)NSCLC 的抗腫瘤活性與p-AKT 的活化有關(guān)。在癌癥的細(xì)胞周期中，F(xiàn)OXO1 信號(hào)可以靶向 P21 蛋白抑制細(xì)胞增殖［29］。有研究表明，在前列腺癌PC3 和LNCaP 細(xì)胞中過表達(dá)FOXO1，細(xì)胞增殖能力降低［30］。在本研究中，苯烯莫德作用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后，p-AKT 的表達(dá)減少，F(xiàn)OXO1 表達(dá)增加，表明苯烯莫德抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡可能依賴AKT/FOXO1 信號(hào)通路。

綜上結(jié)果所示，本研究發(fā)現(xiàn)苯烯莫德可以抑制非小細(xì)胞肺癌A549 和H1299 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)G1 期阻滯和凋亡；其作用機(jī)制可能與AKT/FOXO1 信號(hào)通路有關(guān)；揭示了苯烯莫德可能是抗腫瘤的潛在藥物，但本研究尚未闡明其具體的作用方式和機(jī)制，后續(xù)需進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

高二可：完成實(shí)驗(yàn)，分析數(shù)據(jù)，撰寫論文，文獻(xiàn)收集分析；錢峰：研究指導(dǎo)，論文修改；金齊力：論文撰寫指導(dǎo)

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。