隋銀海，郝 磊，霍志鵬，王 玉，4，何 毅

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院現(xiàn)代中藥開發(fā)中心，天津 300410；3.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300410；4.天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072）

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，常年困擾著全球約1%～3%的患者［1，2］。其病理特征為主要分為3 個(gè)方面，分別為角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管增生［3］，臨床表現(xiàn)多為紅斑、丘疹、鱗屑和瘙癢，影響患者的外貌，且難治易復(fù)發(fā)，因而需要長(zhǎng)期治療，花費(fèi)巨大。不僅給患者的身心健康造成很大負(fù)面影響，也帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

九味化斑方是在古代名方“犀角地黃湯”基礎(chǔ)上，對(duì)處方進(jìn)行化裁組成的中藥復(fù)方，君藥為黃芩、金銀花、水牛角，以涼血散瘀，臣藥為赤芍和牡丹皮，既能清熱涼血，又能活血，可增化斑之功效，佐藥為焦梔子、生石膏和地榆，三者合用以防血與熱結(jié)，使藥為甘草，用以調(diào)和諸藥。全方共奏清熱解毒、活血化瘀和涼血化斑之功效［5］。該方經(jīng)過多年臨床應(yīng)用，療效較好，能顯著降低尋常型銀屑病患者的皮損面積改善其嚴(yán)重程度［6，7］。在前期完成對(duì)九味化斑方的有效成分提取、精制、制備九味化斑丸等研究的基礎(chǔ)上，本研究利用UPLC-Q-TOF/MSE技術(shù)對(duì)九味化斑丸中的化學(xué)成分進(jìn)行分析和鑒定，在此基礎(chǔ)上采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，對(duì)九味化斑丸中的活性成分進(jìn)行篩選并對(duì)其治療銀屑病可能的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期初步闡明九味化斑丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開展九味化斑丸治療銀屑病的藥理研究與臨床試驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材與藥品

飲片：赤芍（批號(hào)：1709133）購(gòu)自甘肅中天藥業(yè)有限責(zé)任公司，焦梔子（批號(hào)：1812015466）、牡丹皮（批號(hào)：1812021905）、地榆（批號(hào)：2103011264）、甘草（批號(hào)：2107021119）購(gòu)自河北藺氏盛泰藥業(yè)有限公司，金銀花（批號(hào)：220301）、黃芩（批號(hào)：220101）購(gòu)自亳州普潤(rùn)藥業(yè)有限公司，經(jīng)天士力研究院中級(jí)工程師霍志鵬、郝磊鑒定均符合《中國(guó)藥典》一部相關(guān)規(guī)定。

對(duì)照品：枸櫞酸、沒食子酸、木犀草苷、白楊素、漢黃芩素、木犀草素、甘草苷、兒茶素、表兒茶素（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為100396-200301、110831-200803、111720-200905、111701-200501、111514-200403、111520-200504、111610-200604、877-200001、110878-200102），綠原酸、甘草酸銨、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、黃芩素、4，5-O-二咖啡?；鼘幩?、黃芩苷、芍藥苷、蘆丁（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110753-202018、110731-201619、111782-201505、111595-201607、110736-202145、100080-202012、111894-202104、110715-202122），4-咖啡?；鼘幩幔ㄌ旖蚴刻m科技有限公司，批號(hào)：20150401）。

1.2 儀器與試劑

電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司），Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司），UPLC-Q-TOF-MS 質(zhì)譜儀、亮氨酸-腦啡肽（美國(guó)Waters 公司），質(zhì)譜甲酸（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司），色譜甲醇、質(zhì)譜乙腈（德國(guó)Merck 公司），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），SwissADME 平臺(tái)（http：//www.swissadme.ch/），SwissTargetPrediction 平臺(tái)（http：//www.swisstargetprediction.ch/），疾病相關(guān)基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGeNET，https：//www.disgenet.org/），GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/），DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//go.drugbank.com/），在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，https：//www.omim.org/），Therapeutic Target Database（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/），全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProt，https：//www.uniprot.org/），Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.string-db.org/），PyMOL 2.4.0，DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），微生信在線作圖（http：//www.bioinformatics.com.cn/），Cytoscape 3.9.1，OpenBabel 2.4.1，RCSBPDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/），AutoDock Vina，Masslynx 4.1。

1.4 基于UPLC-Q-TOF/MSE 的九味化斑丸化學(xué)成分分析

1.4.1 九味化斑丸供試品溶液 精密稱取2.0 g 九味化斑丸粉末于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇溶液，超聲30 min，搖勻，離心10 min（轉(zhuǎn)速：12 000 r/min，半徑：9.8 cm），取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

1.4.2 單味藥供試品溶液 稱取九味化斑丸中各單味藥材適量，分別按九味化斑丸中間體制備方法處理得各單味藥提取物，精密稱取各單味藥提取物0.2 g，按1.4.1 項(xiàng)下方法處理，即得。

1.4.3 對(duì)照品溶液 精密稱定1.1 項(xiàng)下的各對(duì)照品適量，用50%甲醇溶解后定容于100 mL 容量瓶中，過0.22 μm 微孔濾膜，即得質(zhì)量濃度約為80 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.4.4 檢測(cè)條件 色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：（0～10 min，5%B；10～55 min，5%～20%B；55～72 min，20%～38%B；72～83 min，38%～90%B；83～85 min，90%B；85～87 min，90%～5%B；87～90 min，5%B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：3 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），在正、負(fù)離子模式下掃描，掃描范圍m/z50～1 200，毛細(xì)管電壓2.3 kV，錐孔電壓40 V，高純氬氣（Ar）為碰撞氣，霧化氣體（N2）流速50 L/h，脫溶劑氣體（N2）流速800 L/h，脫溶劑氣溫度350 ℃，離子源溫度110 ℃，低能量掃描無碰撞能，高能量MSE模式掃描碰撞能20～50 eV，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min，采用亮氨酸-腦啡肽（m/z554.2615［MH］-，m/z556.2771［M+H］+）實(shí)時(shí)校正［8］。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.5.1 活性成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將1.4 項(xiàng)鑒定得到的化學(xué)成分進(jìn)行導(dǎo)入SwissADME 平臺(tái)進(jìn)行活性篩選，對(duì)符合Lipinski 規(guī)則的成分予以納入，對(duì)不滿足該條件但屬于2020 年版《中國(guó)藥典》中收錄的指標(biāo)成分，或在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中口服生物利用度（OB）≥30，類藥性（DL）≥0.18 的成分仍予以納入。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分的Canonical SMILES 并將其導(dǎo)入Swiss Target Prediction 平臺(tái)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，得到活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。

1.5.2 九味化斑丸治療銀屑病相關(guān)靶點(diǎn)篩選 在GeneCards、DisGeNET、DrugBank、OMIM、TTD 5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“Psoriasis”為關(guān)鍵詞收集相關(guān)靶點(diǎn)，GeneCards、DisGeNET 分別經(jīng)“Relevance score”（中位數(shù)篩選2 輪）、“Score gda”（≥1）篩選后將5 者收集到的靶點(diǎn)整合去重。將得到的結(jié)果與1.5.1 所得藥物靶點(diǎn)取交集，從而獲取藥物- 疾病交集靶點(diǎn)。

1.5.3 核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.5.2 中得到的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，將得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入軟件Cytoscape 3.9.1 中，經(jīng)“CytoNCA”計(jì)算得到的度值對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選（度值中位數(shù)篩選2 輪）得到核心靶點(diǎn)。

1.5.4 GO 分析與KEGG 通路富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)1.5.3 中得到的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析和KEGG 分析，選擇物種為人，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.01 為富集標(biāo)準(zhǔn)，并將結(jié)果導(dǎo)入微生信在線作圖平臺(tái)進(jìn)行可視化。

1.5.5 九味化斑丸“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將KEGG 分析得到的前20 條通路、對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和靶點(diǎn)反向?qū)?yīng)的活性成分進(jìn)行整合，利用Cytoscape 3.9.1 構(gòu)建九味化斑丸“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，利用插件“Analyze Network”進(jìn)行分析、計(jì)算，找到度值排名靠前的化學(xué)成分，即為九味化斑丸治療銀屑病的關(guān)鍵成分。

1.5.6 分子對(duì)接 通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載候選關(guān)鍵成分3D 結(jié)構(gòu)的SDF 文件，在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇合適的晶體結(jié)構(gòu)，通過RCSBPDB 蛋白數(shù)據(jù)下載該晶體結(jié)構(gòu)的PDB 格式文件，運(yùn)用OpenBabel2.4.1、AutoDockTools 1.5.6 軟件進(jìn)行前期處理，利用Autodockvina 運(yùn)行分子對(duì)接并對(duì)對(duì)接結(jié)果打分，通常認(rèn)為受體與配體的結(jié)合能≤-4.25 kcal/mol，表明其有相應(yīng)的結(jié)合能力，≤-5.0 kcal/mol，表明具有較好的結(jié)合活性，≤-7.0 kcal/mol 有強(qiáng)烈的結(jié)合活性［9-12］。利用PyMOL 2.4.0 軟件將分子對(duì)接的結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 九味化斑丸的化學(xué)成分解析

UPLC-Q-TOF-MS 分析的基峰離子色譜圖（BPI 圖）見圖1，結(jié)合九味化斑丸供試品溶液的質(zhì)譜信息，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)及參考文獻(xiàn)分析，共鑒定出75個(gè)化學(xué)成分。主要為黃酮和酚酸類成分，具體結(jié)果如表1 所示。根據(jù)單味藥質(zhì)譜信息將化學(xué)成分進(jìn)行歸屬分類，其中6 個(gè)來源于金銀花，23 個(gè)來源于黃芩，1 個(gè)來源于赤芍，3 個(gè)來源于牡丹皮，赤芍與牡丹皮共有成分5 個(gè)，17 個(gè)來源于地榆，地榆、赤芍、牡丹皮共有成分3 個(gè)，4 個(gè)來源于焦梔子，17 個(gè)來源于地榆，4 個(gè)來源于甘草，金銀花與焦梔子共有成分8 個(gè)，1 個(gè)赤芍、牡丹皮、黃芩、金銀花、焦梔子共有成分。

表1 九味化斑丸中化學(xué)成分的鑒定及歸屬Tab 1 Identification and attribution of chemical components in Jiuwei Huaban pill

圖1 九味化斑丸的 UPLC-Q-TOF/MSE BPI 圖Fig 1 BPI chromatograms of Jiuwei Huaban pill by UPLC-Q-TOF/MSE

圖2 九味化斑丸靶點(diǎn)與銀屑病靶點(diǎn)韋恩圖Fig 2 Venn diagram of psoriasistargets and Jiuwei Huaban pill

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 按照2.2.1 中所設(shè)篩選條件，從所鑒定的75 個(gè)成分中篩選出35 個(gè)活性成分，包括黃芩11 個(gè)、金銀花4 個(gè)、焦梔子2 個(gè)、地榆5 個(gè)、甘草2 個(gè)、赤芍與牡丹皮共有成分1 個(gè)、金銀花與焦梔子共有成分7 個(gè)、地榆赤芍和牡丹皮共有成分2 個(gè)、黃芩金銀花赤芍牡丹皮焦梔子共有成分1 個(gè)。預(yù)測(cè)得到藥物靶點(diǎn)388 個(gè)。

2.2.2 九味化斑丸治療銀屑病相關(guān)靶點(diǎn)篩選 按照2.2.2 項(xiàng)下方法進(jìn)行靶點(diǎn)收集和篩選，共得到1 274 個(gè)與銀屑病較為相關(guān)的靶點(diǎn)，與2.2.1 中的藥物靶點(diǎn)取交集得114 個(gè)共有靶點(diǎn)。

2.2.3 核心靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 按2.2.3 項(xiàng)下方法得到由30 個(gè)節(jié)點(diǎn)、305 條邊構(gòu)成的核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，可視化分析結(jié)果見圖3。圖中節(jié)點(diǎn)的越大說明其在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白作用越強(qiáng)，關(guān)系越緊密，提示血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A （VEGFA）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、腫瘤壞死因子（TNF）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶-2（PTGS2）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）等靶點(diǎn)可能在九味化斑丸治療銀屑病中發(fā)揮重要作用。

圖3 核心靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram of core target

2.2.4 GO 功能與KEGG 通路富集分析 GO 功能富集分析得到213 條生物過程（BP），主要與蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)、血管生成、磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)傳導(dǎo)的正向調(diào)節(jié)等有關(guān)，主要涉及相同的蛋白結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等27 條分子功能（MF），得到40 條細(xì)胞組成（CC），提示九味化斑丸的成分主要作用于胞外區(qū)、細(xì)胞外空間、膜筏等部位發(fā)揮作用，分別選取BP、MF、CC 前10 條利用微生信平臺(tái)進(jìn)行可視化，見圖4A。KEGG 通路富集分析共得到85 個(gè)條目，選取前20 條利用微生信平臺(tái)進(jìn)行可視化，見圖4B。核心靶點(diǎn)主要富集在白細(xì)胞介素-17（IL-17）、TNF、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）、輔助性T 細(xì)胞（Th17）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路。

圖4 GO 生物功能富集分析（A）及KEGG 通路富集分析（B）Fig 4 GO analysis and KEGG pathway analysis of biological process

2.2.5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape構(gòu)建的“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)如圖5 所示。度值排名靠前的成分木犀草素、黃芩新素Ⅱ、黃芩素、芍藥苷、梔子苷等可能為九味化斑丸中起效的關(guān)鍵成分。度值排名靠前的金屬基質(zhì)蛋白酶-2（MMP2）和MMP9 是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中最被熟知的2個(gè)成員，能水解基底膜中的Ⅳ型膠原從而破壞組織屏障，便于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，另外，MMP9 還可通過釋放VEGF 促進(jìn)血管生成［33］。此外，EGFR、PTGS2、JUN、TNF、胰島素樣生長(zhǎng)因子1 受體（IGF1R）等均為較重要的靶點(diǎn)。

圖5 九味化斑丸的“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig 5 Network for active components-targets-pathways of Jiuwei Huaban pill

2.2.6 分子對(duì)接 選取成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中度值大于中位數(shù)（＞4）的活性成分（選擇君藥黃芩和金銀花的指標(biāo)成分黃芩苷和綠原酸予以補(bǔ)充），與網(wǎng)絡(luò)中度值前6 的核心靶點(diǎn)EGFR、MMP2、MMP9、PTGS2、JUN、TNF（結(jié)合PPI 網(wǎng)絡(luò)予以補(bǔ)充，分別為VEGFA、STAT3）進(jìn)行對(duì)接，共得到120 組對(duì)接結(jié)果，結(jié)合能均≤-5.9 kcal/mol，其中108 組對(duì)接結(jié)果結(jié)合能≤-7.0 kcal/mol。具體結(jié)果見圖6。綜上，九味化斑丸中篩選出的關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合較好。部分分子對(duì)接結(jié)果可視化圖如圖7所示。

圖6 分子對(duì)接結(jié)果Fig 6 Results of molecular docking

圖7 AutoDock Vina 分子對(duì)接可視圖Fig 7 Results of AutoDock Vina molecular docking

3 討論

本研究利用UPLC-Q-TOF/MSE技術(shù)，共從九味化斑丸中解析出75 個(gè)化學(xué)成分，多來源于金銀花、黃芩和地榆3 味藥材，以黃酮、酚酸類為主。經(jīng)篩選得到35 個(gè)潛在活性成分并預(yù)測(cè)得到30 個(gè)核心靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，九味化斑丸的主要活性成分木犀草素、黃芩新素Ⅱ、黃芩素、芍藥苷、梔子苷等作用于EGFR 、MMP2 、MMP9 、VEGFA 等核心靶點(diǎn)從而調(diào)節(jié)IL-17、PI3K-Akt、MAPK 等信號(hào)通路發(fā)揮治療銀屑病的作用

銀屑病的病理學(xué)特征主要是角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、炎癥和血管生成［34］。多種活性物質(zhì)治療銀屑病的報(bào)道中，木犀草素可以抑制表皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，抑制炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-17、IL-23 和IL-1β 的表達(dá)，緩解銀屑病樣癥狀［35-37］。芍藥苷可通過核因子κB（NF-κB）通路抑制角質(zhì)形成細(xì)胞（KC）增殖［38，39］，同時(shí)降低相關(guān)炎癥細(xì)胞因子（IL-17、INFγ、IL-6、TNF-α）的表達(dá)［39］、抗血管生成［40］，從而治療銀屑病。盧傳堅(jiān)等［41］的實(shí)驗(yàn)表明梔子苷具有與甲氨蝶呤相當(dāng)?shù)目广y屑病的作用，但安全性優(yōu)于后者。作為九味化斑丸君藥的指標(biāo)成分，有文獻(xiàn)表明黃芩苷和綠原酸對(duì)銀屑病有治療作用，黃芩苷可能通過調(diào)控Notch 信號(hào)通路、酪氨酸激酶-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（JAK-STAT）信號(hào)通路顯著抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的活性和誘導(dǎo)凋亡［42，43］，同時(shí)還能通過抑制γδ T 細(xì)胞活化和相關(guān)炎性因子（IL-17A、IL-22和IL-23）的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎的功效［44］。綠原酸抑制皮膚炎癥反應(yīng)來緩解銀屑病樣小鼠皮損病理改變［45］。本研究分子對(duì)接結(jié)果也顯示，篩選出的活性成分如木犀草素、黃芩素、芍藥苷、梔子苷、黃芩苷和綠原酸等與部分核心靶點(diǎn)親和力較強(qiáng)。推測(cè)九味化斑丸主要通過木犀草素、黃芩素、芍藥苷、梔子苷、黃芩苷和綠原酸等化學(xué)成分發(fā)揮治療銀屑病的作用。

EGFR 是一種酪氨酸激酶，與MAPK 通路、PI3K-Akt 通路、JAK/STAT 通路的調(diào)節(jié)有關(guān)［46］。在銀屑病中，高水平的EGFR 可導(dǎo)致KC 過度增殖和異常分化，同時(shí)還能上調(diào)Decoy Receptor 3（誘騙受體 3）從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)和血管生成［47］。VEGF可由KC 細(xì)胞分泌，VEGFA 是VEGF 家族中的一員，可促進(jìn)新生血管生成和使血管通透性增加，參與銀屑病的發(fā)病過程［48］。在銀屑病患者的皮膚中可以發(fā)現(xiàn)高水平活化的STAT3［49］，STAT3 可介導(dǎo)Th17 細(xì)胞分泌IL-17、IL-22 等炎性因子，還可直接激活I(lǐng)L-17A 和IL-17F 產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，IL-17A 及其它多種炎性因子可導(dǎo)致KC 的增殖［50］。

九味化斑丸治療銀屑病的KEGG 通路富集分析效用機(jī)制主要有IL-17、TNF、PI3K-Akt、Th17、MAPK 等信號(hào)通路。MAPK 通路由P38 絲裂原活化蛋白激酶 （P38 MAPK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 （ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、ERK5 四條亞通路組成［51］。P38 MAPK 和JNK 分別誘導(dǎo)Th1 和Th2 的分化，從而共同介導(dǎo)KC 細(xì)胞增殖，P38 MAPK 和ERK 可調(diào)控血管生成，P38 MAPK、ERK1/2、JNK 可調(diào)節(jié)下游的炎癥因子，從而加重銀屑病的炎癥反應(yīng)［52］。PI3K/AKT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞存活的重要通路，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、能量代謝等多個(gè)過程，另外也參與血管新生［53］。PI3K-Akt信號(hào)通路能夠通過磷酸化和誘導(dǎo)叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FOXO）下調(diào)來影響角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，可能是治療銀屑病的潛在靶點(diǎn)［54］。IL-17 通路、Th17 通路和TNF 通路在銀屑病病程中發(fā)揮重要作用，成熟的Th17 細(xì)胞分泌IL-23 和IL-17，IL-23 能夠反過來促進(jìn)Th17 細(xì)胞的分化、成熟，IL-17 與相應(yīng)受體結(jié)合后可激活P38 MAPK，同時(shí)，IL-17 能夠通過上調(diào)IL-8 導(dǎo)致銀屑病皮損處表皮過度角化［55］，此外，IL-17與TNF-α 可協(xié)同誘導(dǎo)KC 細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)，阻斷TNF-α 可下調(diào)IL-23，從而抑制Th17 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［56］。

綜上所述，本研究利用UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，推測(cè)九味化斑丸治療銀屑病的有效成分主要為黃芩素、木犀草素、梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、綠原酸等化學(xué)成分，通過作用于EGFR、MMP2、MMP9、VEGFA、TNF、STAT3 等靶點(diǎn)調(diào)節(jié)IL-17、TNF、PI3K-Akt、Th17、MAPK 等信號(hào)通路發(fā)揮抑制炎性因子釋放、抑制角質(zhì)細(xì)胞過度增殖、抑制皮損組織血管新生等作用。本研究初步明確了九味化斑丸治療銀屑病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)，也為后續(xù)結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)的作用機(jī)制深度研究提供思路與參考。

作者貢獻(xiàn)度說明：

隋銀海：設(shè)計(jì)并執(zhí)行研究方案，采集與分析數(shù)據(jù)，撰寫論文，最終版本修訂；郝磊：提出研究思路，指導(dǎo)論文的撰寫與修訂；霍志鵬：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)操作，參與論文修訂；王玉、何毅：所有實(shí)驗(yàn)試劑資金支持和技術(shù)指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。