劉金堯，何 明，王權(quán)勝，唐振宇，楊德芬

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.桂林市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 桂林 541002；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530023）

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，65%以上男性不育的病因及其相關(guān)發(fā)病機(jī)制尚未被發(fā)現(xiàn)。2017 年歐洲泌尿外科學(xué)會(huì)相關(guān)資料表明，少精子類型所導(dǎo)致的男性不育患者比例不斷上漲［1］。而由于男性因素所致的不育約占50%，少精子癥的患者至少有5 000 萬(wàn)［2］。少精子癥作為男性不育癥病型之一，由多方面因素所致：生精功能、附睪功能異常，輸精管梗阻，遺傳及生活環(huán)境等因素［3，4］，其中附睪結(jié)構(gòu)及其微環(huán)境的改變是導(dǎo)致少精子癥的重要原因之一［5］。精子從精原細(xì)胞發(fā)育到成熟精子經(jīng)歷了復(fù)雜的過(guò)程，附睪是精子成熟和儲(chǔ)存的重要場(chǎng)所。目前中藥方對(duì)附睪少精子癥研究很少報(bào)道。本課題組經(jīng)過(guò)對(duì)實(shí)際臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，認(rèn)為男性不育癥多緣于“營(yíng)氣不從，腎精虧虛”，治療較多以續(xù)斷種子方，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究表明治療確有成效［6］。該實(shí)驗(yàn)擬創(chuàng)設(shè)實(shí)驗(yàn)性少精子癥小鼠模型，通過(guò)觀察小鼠附睪結(jié)構(gòu)局部顯微、超微結(jié)構(gòu)，研究續(xù)斷種子方對(duì)少精子癥模型小鼠附睪結(jié)構(gòu)的干預(yù)作用，為精子發(fā)育成熟提供培育場(chǎng)所。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

MACRO 精子計(jì)數(shù)板和WLJY-9000 型偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)（北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司）；TDL-4ZB 型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；電子光學(xué)顯微鏡，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

白消安針劑，批號(hào)：K1625007，購(gòu)自阿拉丁公司；TUNE 試劑盒，產(chǎn)品號(hào)：11684817910，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；α-葡糖苷酶檢測(cè)試劑盒，南京欣迪生物藥業(yè)工程有限公司，批號(hào)：A10740102。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

45 只6～8 周齡，重24～28 g 的雄性小鼠，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)［SCXK（桂）2009-0002］。全部小鼠分籠喂養(yǎng)，在20～25 ℃溫度下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，各自進(jìn)水進(jìn)食。3 d 更換干燥墊料。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 動(dòng)物模型制作及分組

實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)7 d 后，無(wú)異?；顒?dòng)，制備少精子癥小鼠模型，方法依照文獻(xiàn)［7］：除外正常組10 只小鼠，余下小鼠選取白消安（Sigma 產(chǎn)品）配以5 mL 0.9%生理鹽水，經(jīng)腹注射白消安（10 mg/kg），連續(xù)5 d，正常組注射相同數(shù)量生理鹽水，在35 只小鼠中選取5 只處死開(kāi)腹摘取小鼠附睪，光學(xué)顯微鏡下觀察附睪見(jiàn)少量精子，說(shuō)明成功造模少精子癥小鼠模型。余下30 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、左卡尼汀組（左卡組）、續(xù)斷種子方組（續(xù)斷組）各10 只。

1.5 實(shí)驗(yàn)藥物

1.5.1 續(xù)斷種子方組 藥物包括（女貞子、山藥、骨碎補(bǔ)、菟絲子、紅藤、牛膝、杜仲、黨參、白術(shù)、淫羊藿、枸杞子、續(xù)斷各10 g），單味中藥顆粒（免煎中藥，江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)1203002）。

1.5.2 左卡尼汀組 左卡尼汀口服液（沈陽(yáng)第一制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990372）。

1.6 方法

1.6.1 干預(yù)方法 造模成功后，采用藥物灌胃干預(yù)治療。0.9%生理鹽水灌胃（模型組和正常組）；續(xù)斷組予9 g·kg-1·d-1的續(xù)斷種子方配以生理鹽水；左卡組予75 mg·kg-1·d-1的左卡尼汀口服液配以生理鹽水；1次/d，連續(xù)8 周。

1.6.2 取材方法 末次灌胃結(jié)束24 h 后，頭頸部處死小鼠，切除其腹部附睪，取下各組一側(cè)附睪相關(guān)組織，迅速放置Bouin 溶液中固定，固定后乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟切片包埋，蘇木素-伊紅（HE）染色，做附睪組織HE 染色檢測(cè)和電鏡備檢用。在添加2 mL 培養(yǎng)液的容器中使用眼科剪剪碎另一側(cè)附睪，精子充分游離泳動(dòng)（36.5 ℃，30 min），做精液分析和精漿生化備檢用。

1.6.3 精液全自動(dòng)檢測(cè) 采取精子計(jì)數(shù)板和精子檢驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行精子濃度和活動(dòng)力的測(cè)定，精子部分參數(shù)依照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》［8］標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。

1.6.4 精漿生化指標(biāo)檢測(cè) 采用3 000×g離心液化后的精液10 min，-20 ℃環(huán)境下放置精漿備檢。以α-葡糖苷酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定精漿NAG 活性；選用間苯二酚比色法測(cè)定精漿果糖濃度。

1.6.5 HE 染色法檢測(cè) 采用HE 染色各組10 張附睪組織切片，各切片觀察2 個(gè)視野。在附睪頭部和尾部使用具有圓形形狀（×200 倍）的附睪小管的15個(gè)橫切面進(jìn)行上皮高度評(píng)價(jià)。測(cè)定附睪頭部和尾部的管狀（上皮，管腔間隔和平滑細(xì)胞）比例，每只動(dòng)物隨機(jī)捕獲10 個(gè)圖像（×200）。將包含100 個(gè)交叉點(diǎn)的網(wǎng)格疊加在圖像上，并將這些點(diǎn)分類為：上皮，管腔，平滑肌和間質(zhì)，每只動(dòng)物共有1 000 個(gè)交叉點(diǎn)，計(jì)算每個(gè)組體積比例。通過(guò)光學(xué)顯微鏡測(cè)量頭部和尾部中附睪小管的直徑和上皮厚度。附睪小管的直徑由縱向和橫向橫截面的平均值確定。

1.6.6 超微結(jié)構(gòu)檢測(cè) 選取各組合適附睪組織，置放1%多聚甲醛和2%戊二醛混合液之中，在電鏡下可見(jiàn)附睪相關(guān)組織變化，視野中可見(jiàn)附睪上皮、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及附睪管等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 造模后小鼠相關(guān)表現(xiàn)

各組小鼠的飲水和進(jìn)食較前均有減少，精神欠佳，自主活動(dòng)減少，體重減輕，毛發(fā)脫落，反應(yīng)不靈敏等表現(xiàn)，予藥物灌胃1 周后上述癥狀逐漸好轉(zhuǎn)。期間因灌胃劑量不準(zhǔn)確導(dǎo)致2 只小鼠死亡（模型組、左卡組各1 只），因藥物灌胃操作不當(dāng)導(dǎo)致刺破部分臟器等因素導(dǎo)致2 只小鼠死亡（續(xù)斷組、模型組各1只）。

2.2 附睪精子質(zhì)量、α-葡糖苷酶、果糖、SOD 影響

與正常組比較，模型組小鼠精液濃度、活力、超氧化物歧化酶（SOD）、α-葡糖苷酶、果糖顯著下降差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，續(xù)斷組精液濃度、活力、SOD、α-葡糖苷酶、果糖、SOD 顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與左卡組比較，續(xù)斷組精液濃度、活力、果糖顯著增加（P＜0.05），α-葡糖苷酶、SOD 顯著增加差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 附睪精子質(zhì)量、α-葡糖苷酶、果糖、SOD 影響（±s）Tab 1 Effects on epididymal sperm quality，A-glucosidase，fructose and SOD （±s）

表1 附睪精子質(zhì)量、α-葡糖苷酶、果糖、SOD 影響（±s）Tab 1 Effects on epididymal sperm quality，A-glucosidase，fructose and SOD （±s）

注：與模型組比較,**P＜0.01;與左卡尼汀組比,#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常組模型組左卡組續(xù)斷組SOD(nmoL/mg)106.04±15.69 77.52±21.42 107.32±17.63##118.04±12.18**137.8 0.22 n 10 899 Ft精子濃度（106/mL）47.53±5.28 17.29±4.83 30.05±5.25#34.37±5.08**52.2 0.29活動(dòng)率（%）61.71±6.03 20.17±6.22 36.10±6.48#41.49±7.53**53.1 0.21 α-葡糖苷酶(mU/g)16.51±3.42 10.56±2.62 14.45±5.24##13.81±4.57**22.7 0.18果糖(mg/mL)111.81±4.47 83.23±13.22 114.32±12.08#106.53±12.65**48.9 0.56

2.3 對(duì)附睪管上皮高度及比例、管室間隔、平滑肌的影響

與正常組比較，模型組上皮高度及比例、平滑肌比例、管間隔顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組，續(xù)斷組上皮高度及比例、平滑肌比例、管間隔顯著下降差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與左卡組比較，續(xù)斷組上皮比例降低（P＜0.05），平滑肌比例、管間隔顯著降低（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)附睪管上皮高度及比例、管室間隔、平滑肌的影響（±s）Tab 2 Effects on height and proportion of epididymal tube epithelium，interventricular septum and smooth muscle（±s）

表2 對(duì)附睪管上皮高度及比例、管室間隔、平滑肌的影響（±s）Tab 2 Effects on height and proportion of epididymal tube epithelium，interventricular septum and smooth muscle（±s）

注：與模型組比較,**P＜0.01；與左卡組比較,#P＜0.05，##P＜0.01。

平滑肌比例（%）3.71±0.25 6.19±0.50 4.70±0.24##4.59±0.27**5.8 0.33組別正常組模型組左卡組續(xù)斷組n 10 899 Ft上皮高度23.94±2.47 28.97±2.19 23.54±2.52 24.12±2.55**31.2 0.28上皮比例20.39±0.68 29.53±2.01 21.90±0.94#17.80±0.43**19.3 0.86管間隔（%）18.31±4.80 29.16±2.96 31.23±2.86##28.23±8.33**21.8 0.52

2.4 對(duì)小鼠附睪結(jié)構(gòu)的影響

光鏡觀察下可見(jiàn)，正常組小鼠附睪相關(guān)組織完整，管腔內(nèi)精子分布均勻，正常纖維、小血管等相關(guān)組織結(jié)構(gòu)存在附睪間質(zhì)內(nèi)（圖1A）。模型組附睪管腔內(nèi)可見(jiàn)較多脫落的生殖細(xì)胞，精子減少，部分精子變性，融合聚集；附睪管上皮細(xì)胞增大，上皮內(nèi)暈細(xì)胞和亮細(xì)胞數(shù)目顯著增多，其附睪管間可見(jiàn)炎細(xì)胞及纖維組織增生性變化。附睪間質(zhì)水腫，管腔內(nèi)含少量精子殘余體、未成熟生精細(xì)胞、畸形精子等（圖1B）。續(xù)斷組：僅附睪頭管腔可見(jiàn)單個(gè)脫落的生殖細(xì)胞，其余2 個(gè)附睪組織（附睪體、附睪尾）結(jié)構(gòu)完整，附睪管上皮細(xì)胞、基膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞完整，管腔內(nèi)儲(chǔ)存大量精子細(xì)胞（圖1C）。左卡組僅附睪頭管腔可見(jiàn)單個(gè)脫落的生殖細(xì)胞，其余2 個(gè)附睪組織（附睪體、附睪尾）結(jié)構(gòu)完整，附睪間質(zhì)有少許水腫、微小血管擴(kuò)張、主細(xì)胞及基細(xì)胞出現(xiàn)空泡化管腔（圖1D）。

圖1 光鏡下各組小鼠附睪相關(guān)組織結(jié)構(gòu)改變 （HE×200）Fig 1 Changes of structure of epididymis related tissues in each group under light microscope（HE×200）

2.5 對(duì)小鼠附睪超微結(jié)構(gòu)的作用

電鏡下，正常對(duì)照組小鼠附睪細(xì)胞中觀察見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基復(fù)合體，精子結(jié)構(gòu)完整，鞭毛結(jié)構(gòu)正常；附睪細(xì)胞之間的密切聯(lián)系復(fù)合體構(gòu)成了血睪屏障，在此基礎(chǔ)形成了屏障機(jī)制（圖2A）。模型組小鼠附睪內(nèi)見(jiàn)錯(cuò)落分布的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，呈退行性改變的附睪管柱狀上皮細(xì)胞；結(jié)構(gòu)錯(cuò)雜排列的管腔面胞質(zhì)大量散落，空泡化的基底部胞質(zhì)數(shù)目明顯上漲，部分局部缺失；精子相關(guān)結(jié)構(gòu)破壞，顯示出大小形狀各異的線圈狀（圖2B）。續(xù)斷組附睪主細(xì)胞中的高爾基復(fù)合體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體分布有序，組織形態(tài)完整，許多成熟精子存在附睪管腔內(nèi)（圖2C）。左卡組可見(jiàn)分布較整齊的附睪睪管柱狀上皮細(xì)胞，附睪內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基復(fù)合體形態(tài)較正常，退變的線粒體得到顯著變化，成熟精子和畸形精子相間存在于管腔內(nèi)（圖2D）。

圖2 電鏡下各組小鼠附睪組織超微結(jié)構(gòu)（EM×3 000）Fig 2 Ultrastructure of epididymis of mice in each group under electron microscope（EM×3 000）

3 討論

少精子癥作為男性不育癥的臨床常見(jiàn)病型，因其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制及多種病因，也發(fā)展為男性不育研究的熱點(diǎn)之一。附睪結(jié)構(gòu)和微環(huán)鏡對(duì)精子的發(fā)育成熟至關(guān)重要，并且附睪也可加速肉毒堿、糖蛋白以及多種酶等的分泌，精子的成熟、運(yùn)動(dòng)以及發(fā)揮常規(guī)生理功能皆與上述物質(zhì)緊密相關(guān)［9］。附睪腔中雄激素含量很高，附睪上皮本身也能分泌少量雄激素，研究表明，睪酮是精子發(fā)生必不可少并調(diào)制附睪收縮和管腔流體黏度因素之一［10］。附睪結(jié)構(gòu)的破壞可導(dǎo)致少精、弱精及精子畸形。因此，課題組通過(guò)建立少精子癥模型小鼠，研究續(xù)斷種子方對(duì)模型小鼠附睪管結(jié)構(gòu)和微環(huán)境的影響，為精子發(fā)育成熟提供培育基地。

單根細(xì)長(zhǎng)扁平小管高度卷曲組成小鼠附睪，從上至下可分為附睪頭、體、尾部3 部分，每個(gè)區(qū)域節(jié)段內(nèi)有著特殊腔內(nèi)微環(huán)境，這對(duì)于睪丸精子到達(dá)尾部時(shí)成熟是至關(guān)重要的。研究表明，頭部和體部是提供精子成熟的微環(huán)境，尾部區(qū)域主要功能存儲(chǔ)網(wǎng)狀站精子［11］。附睪上皮由不同的細(xì)胞類型組成，其中包括主細(xì)胞，基底細(xì)胞，透明細(xì)胞，頂端細(xì)胞和暈細(xì)胞等細(xì)胞，形成圍繞內(nèi)腔的單層［12］。在初始部分，高柱狀主細(xì)胞負(fù)責(zé)水的吸收；離子和小有機(jī)分子也被吸收。頭部中的主細(xì)胞參與蛋白質(zhì)分泌，這些蛋白質(zhì)吸附在精子膜上并改變其蛋白質(zhì)組成。體部的主要細(xì)胞在其核上區(qū)域具有豐富的脂質(zhì)，這些細(xì)胞可能有助于修飾精子質(zhì)膜的脂質(zhì)成分。尾部的上皮比頭部段短得多，透明細(xì)胞很普遍，這些透明細(xì)胞吞噬從成熟精子中脫落的細(xì)胞質(zhì)液滴，并且可能還吞噬其他管腔碎片。在尾部，過(guò)量的腔蛋白被吸收，而固定蛋白被分泌以保持精子靜止。附睪上皮內(nèi)的這些細(xì)胞類型具有單獨(dú)的功能，同時(shí)主要細(xì)胞在相鄰細(xì)胞之間形成緊密連接以產(chǎn)生血-附睪屏障保護(hù)免受免疫原性反應(yīng)，以防止精子進(jìn)入附睪上皮內(nèi)，這對(duì)于附睪管腔內(nèi)的穩(wěn)定和特異性微環(huán)境是必要，細(xì)胞連接的調(diào)節(jié)被認(rèn)為是附睪內(nèi)精子成熟過(guò)程中的關(guān)鍵決定因素［13］。精子成熟涉及附睪上皮周圍的固有層，附睪上皮，精子腔內(nèi)的精子和精子本身之間的高度協(xié)調(diào)的相互作用為精子成熟提供條件。這種分段特點(diǎn)決定了附睪各個(gè)區(qū)段各異的生理功能，也為精子的發(fā)育成熟提供了腔內(nèi)微環(huán)境。

白消安是一種烷化劑，臨床上作為白血病、惡性淋巴瘤等疾病的緩解治療常用藥，同時(shí)亦是建立少精子、無(wú)精子動(dòng)物模型經(jīng)典用藥之一［14］。白消安可破壞睪丸中分化的精原細(xì)胞使生精功能障礙，對(duì)附睪的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能具有毒性損害作用，尤其是成熟精子前向運(yùn)動(dòng)和受精能力［3，15］。有研究報(bào)道，白消安可使小鼠附睪頭部和尾部上皮細(xì)胞增高，減少含有的高爾基體和脂質(zhì)，附睪管室內(nèi)腔窄，毒性可持續(xù)存在附睪管中引起的精子損傷［16］；促進(jìn)活性氧物質(zhì)（ROS）的形成，ROS 升高能刺激附睪上皮脂質(zhì)過(guò)氧化（LP），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改變，使DNA 損傷和生精上皮細(xì)胞破壞［17，18］，LP 和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)，使附睪結(jié)構(gòu)和內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變。附睪損傷，上皮分泌降低，細(xì)胞含有囊泡細(xì)胞質(zhì)退化，其存儲(chǔ)與精子成熟相關(guān)物質(zhì)減少。致密囊泡和脂滴的增加，在某些情況下占據(jù)了整個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞腫脹，上皮細(xì)胞增加和不穩(wěn)定以及囊泡積聚可能引發(fā)附睪分泌模式的改變，可能導(dǎo)致精子成熟不足和運(yùn)動(dòng)性降低。在實(shí)驗(yàn)觀察中，模型組附睪上皮細(xì)胞分布錯(cuò)雜，附睪管柱狀上皮細(xì)胞顯現(xiàn)出退行性變化；管腔直徑變窄，上皮高度增加，局部組織細(xì)胞水腫，空泡化的基底部胞質(zhì)數(shù)目明顯上漲，局部可見(jiàn)缺失；精子結(jié)構(gòu)破壞，呈大小形狀不一的線圈狀。經(jīng)治療后，續(xù)斷組附睪上皮主細(xì)胞中的高爾基復(fù)合體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體形態(tài)完整，排列整齊，上皮高度和管腔直徑正常，較多數(shù)目成熟精子存在于附睪管腔內(nèi)。有文獻(xiàn)報(bào)道，上皮細(xì)胞增加和囊泡積聚可能引發(fā)附睪吸收功能的改變，阻礙精子在附睪管室內(nèi)正常運(yùn)轉(zhuǎn)通過(guò)時(shí)間［19］，在附睪頭部和尾部精子通過(guò)時(shí)間的加速度縮短。實(shí)驗(yàn)研究表明，少精子癥模型小鼠中附睪精子的濃度、活動(dòng)力、顯微、超微結(jié)構(gòu)、血清生化酶學(xué)的結(jié)果改變，與小鼠附睪組織內(nèi)顯微、超微結(jié)構(gòu)和微環(huán)境變化有著密切的聯(lián)系。

中醫(yī)對(duì)男性不育癥的論治多從腎、脾腎、肝腎等方面出發(fā)。通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)探究和對(duì)實(shí)際臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，本課題組發(fā)現(xiàn)“營(yíng)氣不從，腎精虧虛”是導(dǎo)致男性不育癥的重要因素，其中“營(yíng)氣不從”為睪丸局部氣血運(yùn)行不暢；睪丸附睪局部氣血運(yùn)行受阻，營(yíng)衛(wèi)失和，脈管通透作用失司，經(jīng)絡(luò)阻隔，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能得到交換，腎失所養(yǎng)，發(fā)為不育。治以“補(bǔ)脾強(qiáng)腎、活絡(luò)通滯”的續(xù)斷種子方。該方見(jiàn)于《醫(yī)學(xué)正印》一書(shū)，書(shū)中岳氏認(rèn)為此方得種子生息之元，生精最速［20］。方中續(xù)斷、骨碎補(bǔ)，兩藥合用以通為補(bǔ)，補(bǔ)腎精祛瘀滯，使新生之精可循行暢達(dá)而不淤堵。黨參、山藥、白術(shù)培土補(bǔ)益脾胃，脾胃強(qiáng)后天之氣得養(yǎng)，血之化生有源，血足則腎精充養(yǎng)不絕；枸杞子、菟絲子、女貞子促進(jìn)腎中之精的生成轉(zhuǎn)化，補(bǔ)足腎中之精；牛膝填精善載藥下行、紅藤入血分行瘀滯、杜仲暖腎精通除下焦之邪氣；淫羊藿強(qiáng)腎壯陽(yáng)；諸藥合用，共奏補(bǔ)脾強(qiáng)腎生精、活絡(luò)祛瘀通滯功效。藥理研究表明，枸杞子、菟絲子可以恢復(fù)被破壞的睪丸內(nèi)細(xì)胞，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生，總黃酮可以抑制氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的生成，提高精液質(zhì)量，調(diào)節(jié)性激素分泌水平，抑制生精上皮細(xì)胞凋亡［21，22］。女貞子內(nèi)含豐富的微量元素Zn，可提高氧化活性，加速生精細(xì)胞增殖，為精子發(fā)育成熟提供條件［23］。牛膝總皂苷可以抑制IL-6，Th17 的分泌，減少炎癥因子的含量［24］。續(xù)斷、杜仲增強(qiáng)睪酮的合成能力，促進(jìn)性激素的分泌，減少精子氧化反應(yīng)，提高精子活力［25，26］。

綜上所述，本研究表明，續(xù)斷種子方有效改善少精子癥模型小鼠附睪結(jié)構(gòu)，維護(hù)附睪上皮結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，改善附睪精子成熟微環(huán)境，為附睪培育精子成熟創(chuàng)造有利的條件。續(xù)斷種子方對(duì)少精子癥模型小鼠附睪保護(hù)精子具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

劉金堯：動(dòng)物造模，數(shù)據(jù)整理，論文寫(xiě)作；何明：數(shù)據(jù)分析及相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)分析；唐振宇：實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及數(shù)據(jù)整理；楊德芬：文獻(xiàn)查找；王權(quán)勝：論文審核。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。