柴世偉，陳澤俊，劉春桃，陳 甦，何桂林，陳月芬，王瑞霞，朱 薪，凌 奕，顧 碩

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胎兒醫(yī)學(xué)科，海南 海口 570102）

出生缺陷是指胎兒出現(xiàn)身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常，不僅嚴(yán)重危害兒童生存和生活質(zhì)量，亦對家庭和社會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。妊娠相關(guān)病原微生物感染是導(dǎo)致出生缺陷的重要原因［1］。巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）是最常見的先天性感染病原體之一，妊娠期感染巨細(xì)胞病毒后可經(jīng)胎盤垂直傳播而導(dǎo)致胎兒巨細(xì)胞病毒宮內(nèi)感染，是導(dǎo)致胎兒出生后出現(xiàn)先天性神經(jīng)性耳聾、視覺異常、智力發(fā)育遲緩等出生缺陷的常見原因，嚴(yán)重可引起孕婦流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)和新生兒死亡等情況［2，3］。近年來，巨細(xì)胞病毒感染的早期檢測和治療逐步引起產(chǎn)科及產(chǎn)前診斷科醫(yī)生的高度重視。傳統(tǒng)檢測技術(shù)由于其依賴實(shí)驗(yàn)室條件、實(shí)驗(yàn)方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化等限制，導(dǎo)致其敏感性和特異性仍存在爭議，且傳統(tǒng)技術(shù)無法區(qū)分先天性和產(chǎn)后巨細(xì)胞病毒感染［4］?；谙乱淮鷾y序（NGS）技術(shù)的基因組拷貝數(shù)變異測序（copy number variant sequencing，CNV-seq）為檢測提供了新手段，美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會（ACOG）已推薦CNV-seq 作為胎兒結(jié)構(gòu)異常時(shí)診斷評估的一線檢測方法［5］。CNV-seq 利用低深度全基因組測序，可一次性分析23 對染色體非整倍體及100 kb 以上的染色體拷貝數(shù)變異［6，7］。本研究回顧性分析海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胎兒醫(yī)學(xué)科900 例超聲異常或血清學(xué)檢測異?；颊咧? 例CNV-seq 檢測巨細(xì)胞病毒載量陽性患者的臨床基本資料、相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查、治療過程及轉(zhuǎn)歸，并依據(jù)拷貝數(shù)給予產(chǎn)前咨詢、隨訪，以期為這類患者的診療提供新思路，為CNV-seq 技術(shù)在預(yù)測胎兒巨細(xì)胞病毒感染導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)缺陷等方面的應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)，具體如下。

1 病例資料

例1，患者20 歲，G1P0，2020 年05 月15 日于外院行胎兒頸項(xiàng)透明層厚度（nuchal translucency，NT）檢查為1.1 mm，2020 年06 月12 日于我院行無創(chuàng)產(chǎn)前DNA 檢測（non-invasive Prenatal Testing，NIPT）提示低風(fēng)險(xiǎn)，2020 年09 月03 日我院行胎兒系統(tǒng)超聲檢查未見明顯異常。2020 年09 月28 日孕31+周超聲提示“羊水過少”，于我院產(chǎn)前診斷中心抽取羊水樣本進(jìn)行CNV-seq 以檢測胎兒染色體及CMV，結(jié)果提示檢測出CMV 并熒光定量PCR 驗(yàn)證CMV 載量異常。同時(shí)該孕婦行CMV 血清學(xué)檢測提示CMV-IgM 陰性、CMV-IgG 陽性（見表1）。2020 年10 月05 日孕33+周因“胎兒宮內(nèi)窘迫、胎兒生長受限、羊水過少”經(jīng)剖宮產(chǎn)娩出1 活女嬰。2020年10 月13 日該新生兒行外周血CMV 檢測提示CMV-IgM 陽性，尿CMV-DNA 定量 4.54×104Copies/mL（表2），考慮先天性巨細(xì)胞病毒感染。2020 年10 月15 日新生兒行心臟超聲檢查提示卵圓孔未閉，頭顱超聲檢查提示早產(chǎn)兒腦。胎兒頭顱MRI 檢查未見異常。

表1 孕婦血清CMV 抗體結(jié)果Tab 1 Results of CMV antibodies in pregnant women's serum

表2 新生兒尿液CMV-DNA 結(jié)果Tab 2 Newborn urine CMV-DNA results

例2，患者21 歲，G3P1，2022 年01 月09 日于外院查NT 為 1.8 mm，2022 年02 月17 日行唐氏綜合癥篩查結(jié)果提示低風(fēng)險(xiǎn)，且胎兒系統(tǒng)超聲檢查提示未見異常。2022 年04 月01 日血清CMV 檢測提示CMV Ig M 陰性、CMV Ig G 陽性（表1）。2022 年04月03 日孕26+周超聲提示“胎兒左側(cè)鼻骨未顯示、左心室強(qiáng)光點(diǎn)”至我院產(chǎn)前診斷中心抽取羊水樣本進(jìn)行多重短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)分析技術(shù)（quantitative fluorescent PCR，QF）、CNV-seq 檢測胎兒染色體及CMV。CNV-seq 檢測出CMV 并熒光定量PCR 驗(yàn)證CMV 載量異常。2022 年07 月04 日患者孕40 周經(jīng)陰道順娩1 活男嬰。

例3，患者33 歲，G1P0，2020 年09 月20 日于我院行NT 檢查為1.1 mm，2020 年11 月18 日行NIPT提示低風(fēng)險(xiǎn)，2020 年12 月20 日孕25+周行產(chǎn)科超聲提示“胎兒心臟比例增大并心臟結(jié)構(gòu)異常、室間隔缺損、主動(dòng)脈騎跨、肺動(dòng)脈閉鎖”，考慮先天性心臟病復(fù)雜畸形，遂至我院產(chǎn)前診斷中心抽取羊水樣本進(jìn)行QF 檢測、CNV-seq 檢測胎兒染色體及CMV。CNV-seq 檢測出CMV 并熒光定量PCR 驗(yàn)證CMV 載量異常。2021 年01 月11 日孕27+周該孕婦進(jìn)行CMV 血清抗體檢測，該結(jié)果提示CMV-IgG、CMV-IgM（表1）。該患者于2021 年4 月7 日孕36+3 周因“胎膜早破”經(jīng)剖宮產(chǎn)術(shù)娩出1 活男嬰。該新生兒出生后復(fù)查CMV 提示CMV-IgG陰 性 ，尿 CMV-DNA 定 量 4.8×104Copies/ml（表2）。

2 結(jié)果

2.1 CNV-seq 產(chǎn)前診斷與CMV 檢測

3 例孕婦羊水CNV-seq 結(jié)果均提示樣本中未檢出非整倍體或符合性染色體連鎖遺傳及常染色體顯性遺傳方式的致病、疑似致病變異（表3）。3 例孕婦均在羊水CNV-seq 的同時(shí)對該樣本進(jìn)行CMV 生物信息學(xué)分析，通過檢出序列數(shù)/總序列數(shù)比值來明確是否存在CMV。其中病例1 比值為179/2 048 166（0.000 087），病例2 比值為15 619/1 815 815 （0.008 602），病例3 比值為13 227/2 736 964 （0.004 833）（表3）。在此基礎(chǔ)上對確定CMV 存在的羊水樣本CMV-DNA 進(jìn)行PCR 定量驗(yàn)證，結(jié)果顯示3 例羊水樣本中均檢出CMV，病例1 病毒載量為1 227.76 Copies/mL，病例2 病毒載量為11 639.00 Copies/mL，病例 3 病毒載量為 13 754.60 Copies/mL （表3）。

表3 孕婦羊水CNV-seq 產(chǎn)前診斷與CMV 檢測結(jié)果Tab 3 Prenatal diagnosis and CMV test results of CNV-seq in amniotic fluid of pregnant women

2.2 妊娠結(jié)局及新生兒隨訪情況

3 例孕婦妊娠期間均未見明顯臨床癥狀，且未予抗病毒對癥治療。其中病例1 與病例3 孕婦分別因“胎兒宮內(nèi)窘迫、胎兒生長受限、羊水過少”和“胎膜早破”經(jīng)剖宮產(chǎn)術(shù)分娩出早產(chǎn)兒，病例2 孕婦足月經(jīng)陰道順產(chǎn)。3 名新生兒出生時(shí)阿普加評分均滿分、外觀未見明顯異常。結(jié)合3 例孕婦或新生兒血清學(xué)特異性CMV 抗體、尿液CMV-DNA、CNV-seq定性檢測CMV 與PCR 定量驗(yàn)證CMV 的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可考慮臨床診斷為妊娠期巨細(xì)胞病毒感染或先天性巨細(xì)胞病毒感染。同時(shí)對新生兒進(jìn)行長期隨訪至今未發(fā)現(xiàn)生長發(fā)育與同齡人有差別，聽力檢測及其他神經(jīng)系統(tǒng)檢測均未見明顯異常（表4），病例3 患兒于 2022 年 01 月、2022 年 05 月因“先天性心臟病復(fù)雜畸形”在外院行“體-肺動(dòng)脈分流術(shù)、室間隔缺損修補(bǔ)術(shù)Ⅰ期、Ⅱ期分期手術(shù)”，術(shù)后恢復(fù)好，同時(shí)其喂養(yǎng)和生長發(fā)育較同齡人無差別。

表4 患者妊娠結(jié)局及新生兒隨訪情況Tab 4 Pregnancy outcomes and neonatal follow-up of patients

3 討論

本研究通過關(guān)鍵詞“CNV-seq 和/或CMV”、“高通量測序和/或巨細(xì)胞病毒”在PubMed、中國知網(wǎng)、萬方等文獻(xiàn)平臺進(jìn)行檢索，共計(jì)獲取65 篇CNV-seq 與CMV 的相關(guān)文獻(xiàn)，但其主要集中于高通量測序技術(shù)或CNV-seq 在CMV 基因組圖譜分析或CMV 遺傳多樣性等方面的研究。既往研究通過收集臨床已經(jīng)確診為CMV 感染患者的不同樣本，對不同樣本進(jìn)行CMV 病毒分離，隨后對該病毒進(jìn)行基因組測序以獲取病毒基因組圖譜進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析等。目前暫未發(fā)現(xiàn)CNV-seq 或其他高通量測序技術(shù)對CMV 進(jìn)行直接定性或定量檢測的研究。然而，本研究則是在CNV-seq 進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)前診斷的同時(shí)對CMV 進(jìn)行序列比對定性檢測，在此基礎(chǔ)上對CNV-seq 檢出的CMV 進(jìn)行PCR 定量驗(yàn)證，并且PCR 與CNV-seq 結(jié)果一致。

CMV 感染在人與人之間傳播且對于宿主具有明顯的物種屬別特異性，其感染率因地域文化等因素而呈現(xiàn)差異。CMV 具有嗜神經(jīng)性，屬于最常見的病毒性感染之一，可導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局及不同程度的出生缺陷［8，9］。由于妊娠各個(gè)時(shí)期均有感染CMV 的可能，且隨著國家二胎、三胎生育計(jì)劃的不斷推進(jìn)，高危孕產(chǎn)婦的數(shù)量逐漸增多，CMV 感染局勢不容樂觀。然而大多數(shù)妊娠期CMV 感染孕婦或先天性CMV 感染新生兒并無明顯臨床癥狀，這增加了CMV 感染的診治難度［10］。

既往研究認(rèn)為第一次懷孕的女性與2 年內(nèi)有過生育史的抗體初篩陰性女性在妊娠前3 個(gè)月早期原發(fā)性CMV 感染及胎兒出生后相關(guān)后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)分別達(dá)到了一般人群的19 倍和5 倍［11］。在有臨床癥狀的新生兒中，約25% 會出現(xiàn)遠(yuǎn)期后遺癥；其中65%～80%的存活者可并發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［12-14］。目前常規(guī)CMV 檢測方法主要包括ELISA法檢測血清特異性IgG/IgM 抗體、Q-PCR 技術(shù)定量檢測尿液與血液等樣本病毒DNA、PP65 抗原檢測及影像學(xué)檢查（如超聲、MRI）等。其中血清學(xué)特異性抗體常作為CMV 初篩方法，尿液與血液等樣本CMV-DNA 為CMV 診斷金標(biāo)準(zhǔn)，影像學(xué)結(jié)果則作為輔助診斷依據(jù)。然而血清學(xué)CMV-IgM 陽性率低，CMV-IgG 陽性診斷價(jià)值不高，PCR 檢測CMV-DNA 對尿液樣本具有時(shí)間期限，以上檢測方法因其各自的局限性均不能避免CMV 感染漏診情況。本研究中病例1 和病例3 孕婦的血清IgG 為陽性，但是IgM 為陰性；且其新生兒尿液的CMV-DNA 載量均高于弱陽性數(shù)值范圍下限即2.50×104Copies/mL。盡管患者血清學(xué)結(jié)果陰性，但是并不能明確是否存在CMV 感染，仍然存在漏診可能。本研究病例1 和病例3 在結(jié)合血液學(xué)特異性抗體結(jié)果與超聲異常結(jié)果后對新生兒進(jìn)一步檢查尿液的CMV-DNA，發(fā)現(xiàn)存在新生兒先天性CMV 感染。然而本研究病例2 孕婦血清特異性抗體結(jié)果與病例1 和病例3 一致，其超聲篩查同樣提示異常，但由于未對新生兒尿液CMV-DNA 進(jìn)行檢測，因此病例2 無法排除CMV 感染可能。

近年來高通量測序技術(shù)迅猛發(fā)展，不僅在產(chǎn)前診斷中占據(jù)重要地位，同樣對于各種臨床樣本病原體的研究也逐漸增多。其中CNV-seq 作為我國一線產(chǎn)前診斷技術(shù)應(yīng)用于遺傳疾病病或基因疾病檢測的同時(shí)也應(yīng)用于臨床樣本中的病原微生物全基因組遺傳信息分析等方面。2017 年Hage 等［15］應(yīng)用NGS 高通量測序技術(shù)對從臨床CMV 感染的不同樣本包括器官移植與先天性CMV 感染兒童的血液、尿液、病變組織等分離CMV 進(jìn)行CMV 全基因組測序并對富含CMV 靶點(diǎn)的序列分析，揭示了CMV 基因組變化的多樣性與抗病毒耐藥性的突變特性。與此同時(shí)，針對于CMV 全基因組的高通量測序技術(shù)也在不斷的優(yōu)化，有研究團(tuán)隊(duì)通過對高品質(zhì)CMV-DNA 制備的研發(fā)、NGS 測序流程的優(yōu)化等過程來助力于CMV 基因譜的完善［14］。尤其在針對先天性CMV 感染患兒尿液中的CMV 高通量測序研究中發(fā)現(xiàn)，使用高度敏感的深度測序方法可以有助于了解CMV 基因分型與臨床遺傳的多樣性［16］。然而以上研究重點(diǎn)在于從臨床樣本中分離CMV 病毒后進(jìn)行CMV 基因組測序，并未涉及高通量測序技術(shù)對樣本中CMV-DNA 載量的研究。既往有研究對造血干細(xì)胞移植患者外周血進(jìn)行高通量測序，通過靶向富集方法發(fā)現(xiàn)了CMV 感染病毒株譜出現(xiàn)基因變異并且檢測出較低載量的CMV-DNA［17］。另一項(xiàng)關(guān)于全基因組單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因分型分析的研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)CNV 區(qū)域與HIV-1 病毒載量有相關(guān)性［18］。近期，華大公司已開展了高通量測序技術(shù)CNV-seq 對病原體檢測的生物信息學(xué)分析，該技術(shù)利用兩種宏基因組學(xué)工具即Metaphan2 與Kraken 來構(gòu)建病原體微生物檢測的生物信息學(xué)流程［19，20］。本研究中3 例病例均采用上述CNV-seq 技術(shù)檢測CMV，通過對測序數(shù)據(jù)中檢出序列數(shù)/總序列數(shù)比值分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 例患者的羊水樣本中均存在CMV，其比對值分別為179/2 048 166 （0.000 087）、15 619/1 815 815 （0.008 602）、13 227/2 736 964 （0.004 833）。為了證實(shí)CNV-seq 對CMV 檢測的結(jié)果，使用巨細(xì)胞病毒核酸檢測試劑盒對CMV-DNA 進(jìn)行核酸定量，結(jié)果提示3 例患者CMV病毒載量分別為1 227.76 Copies/mL、11 639.00 Copies/mL、13 754.60 Copies/mL。既往有研究認(rèn)為羊水巨細(xì)胞病毒載量與胎兒預(yù)后相關(guān)的可能性大，認(rèn)為CMV-DNA 載量大于103Copies/mL 時(shí)，可預(yù)測母嬰傳播的概率，而CMV-DNA 載量大于105Copies/mL，可預(yù)測有癥狀的感染［21］。本研究3例患者及其新生兒隨訪過程中均未見明顯臨床表現(xiàn)，與以上研究結(jié)果一致。

CNV-seq 技術(shù)作為目前應(yīng)用廣泛的產(chǎn)前基因檢測技術(shù)，不僅可以在診斷CMV 宮內(nèi)感染或新生兒先天性CMV 感染的同時(shí)可以檢測胎兒染色體異常或基因異常情況。這對于CMV 感染的產(chǎn)前診斷具有重要的臨床意義，不僅可以明確CMV 感染早期診斷以指導(dǎo)臨床診治改善預(yù)后，同樣可以盡早發(fā)現(xiàn)因CMV 感染可能導(dǎo)致的出生缺陷或其他遺傳因素等所致的出生缺陷情況。綜合上述研究結(jié)果認(rèn)為CNV-seq 可能對CMV 感染的臨床診斷具有一定的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)可為CMV 感染的一站式產(chǎn)前診斷平臺的構(gòu)建提供相應(yīng)的臨床依據(jù)；但后續(xù)需繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，同時(shí)亦需要在多個(gè)產(chǎn)前診斷中心開展前瞻性隨機(jī)對照研究，為妊娠期巨細(xì)胞病毒感染的診斷提供依據(jù)，更好地應(yīng)用于產(chǎn)前診斷領(lǐng)域。