李慧慧 陳燕娥 李青蔓 康海藝 朱思明 陳起運 張海英，2，3# 劉 輝，2，3△

（1 海南省熱帶腦科學(xué)研究與轉(zhuǎn)化重點實驗室；海南醫(yī)學(xué)院，2 人體解剖學(xué)教研室，3 科學(xué)實驗中心，4 第一附屬醫(yī)院，5 第二附屬醫(yī)院，?？?570100）

心肌由工作心肌和心傳導(dǎo)系統(tǒng)（cardiac conduction system，CCS）組成。心傳導(dǎo)系統(tǒng)由特殊的心肌細胞構(gòu)成，主要是發(fā)生沖動并傳導(dǎo)到心各部分，使心房肌和心室肌均按照一定的節(jié)律收縮[1]。心傳導(dǎo)系統(tǒng)包括竇房結(jié)（sinoatrial node，SAN），房室結(jié)（atrioventricular node，AVN），房室束，左、右束支（left bundle branch，LBB；right bundle branch，RBB）和浦肯野纖維（PF）等，竇房結(jié)和房室結(jié)分別是起搏點和傳導(dǎo)緩慢的心肌區(qū)域；房室束，左、右束支和浦肯野纖維是快傳導(dǎo)心肌細胞[2]。目前國內(nèi)、外關(guān)于豬心傳導(dǎo)系統(tǒng)細胞的形態(tài)學(xué)研究還較少，而心傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病是心律失常和致心源性猝死的原因之一，但因心傳導(dǎo)系統(tǒng)體積小，肉眼不易辨認，較難準確取材，而且關(guān)于豬的心傳導(dǎo)系統(tǒng)的定位和形態(tài)結(jié)構(gòu)的文獻也很少，對豬的快傳導(dǎo)系統(tǒng)研究極少。為了更好地了解心傳導(dǎo)系統(tǒng)細胞的定位和形態(tài)學(xué)特點，本實驗通過Masson 染色觀察豬心傳導(dǎo)系統(tǒng)細胞，再用結(jié)蛋白（desmin）做免疫熒光實驗進一步驗證傳導(dǎo)系統(tǒng)細胞。結(jié)蛋白是一種肌細胞特異性中間絲蛋白，是細胞骨架的重要結(jié)構(gòu)[3]，它已經(jīng)被Orlandi 等[4]證明可以在人的心傳導(dǎo)系統(tǒng)中表達，本研究將它作為心傳導(dǎo)系統(tǒng)的生物標記物，從細胞水平上為探討心臟疾病的病理生理學(xué)機制提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 標本制備

將豬處死后，取出新鮮的心置于冰上保存，并盡快送往實驗室。確定上腔靜脈（superior vena cava，SVC）和右心耳（right atrial appendage，RAA）的位置，SVC 的根部和RAA 交匯處是竇房結(jié)（圖1A），在此區(qū)域取1 cm×2 cm 大小的組織塊，再將此組織塊沿長軸切成約1.5 mm 厚的6～7個組織塊，并分別標記。沿SVC 方向切開右心房，沿冠狀竇口（coronary sinus ostium，CSO）內(nèi)緣、三尖瓣（tricuspid valve，TV）附著緣和Todaro 腱之間有一個三角形區(qū)域，此區(qū)域為Koch 三角，沿著冠狀竇口向上大約1 cm 處為房室結(jié)區(qū)；Koch 三角上方可見一片最薄且透亮的區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)有房室束通過（圖1B），用局部解剖學(xué)的方法切下房室結(jié)、房室束及左束支，右束支一般會從隔緣肉柱（moderator band，MB）穿過，取一段MB；浦肯野纖維經(jīng)過心尖部，所以取一塊心尖組織。最后把這些組織塊修成多個1 cm×1 cm 的組織塊放到包埋框里并標記好，置于4%多聚甲醛中固定48 h 以備做石蠟切片。

圖1 豬心竇房結(jié)、房室結(jié)、房室束和左、右束支大致解剖學(xué)位置。A：上腔靜脈根部和右心耳交匯處：SAN（黑色方框內(nèi)區(qū)域）：竇房結(jié)；SVC：上腔靜脈；RAAC：右心耳嵴；B：Koch 三角上方區(qū)域：AVN（紅色橢圓形區(qū)域）：房室結(jié)；LBB：左束支；RBB：右束支；CSO：冠狀竇口；TV：三尖瓣：MB：隔緣肉柱.

1.2 試劑

Masson 染色試劑盒（Abcam，ab150686）；驢血清作為封閉液（索來寶科技有限公司，北京）；一抗：結(jié)蛋白鼠抗人抗體（1∶100，Abcam，ab6322）；二抗：Alexa 594（驢抗小鼠594）（1∶200，Abcam，ab150108）。用倒置熒光顯微鏡（TCS SP5 Ⅱ，Leica）觀察并拍照。

1.3 石蠟切片

將切下的所有組織塊修剪到合適的大小，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，自來水沖掉固定液后經(jīng)梯度乙醇常規(guī)脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋后作連續(xù)切片（片厚5 μm）。先切3 張，取第1 張切片做Masson 染色，等確認是心傳導(dǎo)系細胞時，取第2 張切片做免疫熒光實驗，之后也會切20 張連續(xù)切片保存。對連續(xù)切片作Masson 染色和免疫熒光實驗后在顯微鏡下觀察拍照。

1.4 Masson 染色

石蠟切片烤片3 h，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟復(fù)水后置于蒸餾水中靜置15 min。Bouin 固定液放入60℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，切片放入預(yù)熱好的Bouin 固定液中固定1 h。取出切片，晾干，用蒸餾水沖洗。取鐵木素A 液和B 液等體積混合后配置成鐵蘇木精工作染液，對切片染色5 min，蒸餾水沖洗。酸性品紅染色30 s 后蒸餾水沖洗，磷鉬酸溶液分化直到組織膠原纖維在鏡下不再呈現(xiàn)紅色時就棄去磷鉬酸溶液，加入苯胺藍溶液，隨后分別用自來水和蒸餾水沖洗。將醋酸溶液（1%）滴在載玻片上3 min 后棄去冰醋酸溶液，依次用95%乙醇溶液、無水乙醇脫水、二甲苯透明，在組織切片上滴加中性樹脂封片，最后用光鏡觀察拍照。

1.5 免疫熒光顯色

石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟復(fù)水后，放入盛滿檸檬酸鹽修復(fù)液的大燒杯中，并放在微波爐上做熱修復(fù)（95℃）16 min，1×PBST（0.01 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液+5%的Tween 20）沖洗。用10%的驢血清封閉1 h，1 h 后棄去驢血清，加入結(jié)蛋白鼠抗體（1∶100），將切片置于濕盒里放在4℃冰箱過夜。第2 天棄去一抗，用PBST 漂洗后加入驢抗鼠Alex 594（1∶200）二抗，在濕盒內(nèi)室溫孵育90 min。棄去二抗，用PBST 漂洗，漂洗后加入抗熒光衰減封片劑，用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。為比較竇房結(jié)、房室結(jié)、左束支和心肌的熒光強度，同一批次做免疫熒光實驗，切片在同一曝光度下（204.8 ms）拍照，每張照片隨機選擇10 個區(qū)域用以統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

用Image J 測量平均熒光強度，用SPSS 26.0軟件和GraphPad Prism 軟件來分析作圖。用方差分析（單因素）比較竇房結(jié)、房室結(jié)、左束支與心房肌之間的平均熒光強度，方差不齊時采用Welch’s ANOVA 比較。以P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 竇房結(jié)的位置和形態(tài)

豬心的竇房結(jié)大致位于右心耳嵴和上腔靜脈根部的交界處，在光鏡下可以觀察到竇房結(jié)細胞被結(jié)締組織包裹且被竇房結(jié)動脈（sinoatrial node artery，SNA）穿過，它與心外膜之間有一薄層脂肪組織相隔，其間尚有一般心肌組織。豬心的竇房結(jié)細胞比周圍的工作心肌細胞小而致密，呈不規(guī)則的橢圓形，排列雜亂、成團分布且與工作心肌細胞沒有明確的界限（圖2A、圖2B）。倒置熒光顯微鏡顯示與普通心肌細胞（cardiac myocytes，CM）相比，竇房結(jié)細胞只表達了少部分的結(jié)蛋白（圖2C、圖2D）。

圖2 豬心竇房結(jié)定位及驗證。A，B：Masson 染色；A：×4，標尺=1 mm；B：×10，標尺=100 μm（紅色為心肌細胞，藍色是纖維結(jié)締組織）；C，D：免疫熒光染色，×10，標尺=100 μm。CM：普通心肌細胞；SAN：竇房結(jié)；SNA：竇房結(jié)動脈.

2.2 房室結(jié)的位置和形態(tài)

房室結(jié)位于Koch 三角區(qū)內(nèi)，緊靠中心纖維體（central fibrous body，CFB）。Masson 染色觀察到房室結(jié)細胞與普通心肌細胞旁邊有明顯的轉(zhuǎn)換區(qū)細胞（transition cells，TRC），AVN 位于心房與CFB 之間，可見脂肪組織以及房室結(jié)動脈（artrioventricular node artery，AVNA）穿行其中，房室結(jié)細胞呈圓形或橢圓形且被致密的纖維結(jié)締組織包饒，這些結(jié)締組織雜亂排列，將結(jié)細胞分隔成許多大小不等的細胞團。結(jié)細胞排列無序，細胞間界限不清且比普通心肌細胞?。▓D3A、圖3B）。倒置熒光顯微鏡顯示與普通的心肌組織相比，房室結(jié)細胞只表達了少量結(jié)蛋白（圖3C、圖3D）。

2.3 房室束的位置及形態(tài)學(xué)特點

房室束又稱希氏束（HIS 束），在正常心中，它提供心房和心室肌之間的連接，負責(zé)將電脈沖從心房傳輸?shù)叫氖仪遗c浦肯野細胞相連。用局部解剖學(xué)的方法分區(qū)找到房室束，它分為中心纖維體部、未分叉部和分叉部等3 段，在光鏡下顯示房室束細胞外周有大量的纖維結(jié)締組織，與鄰近的普通心肌細胞分界較清，排列雜亂且比普通工作心肌細胞大，呈細長條狀（圖4A、圖4B）。倒置熒光顯微鏡顯示房室束細胞不僅被結(jié)蛋白抗體大量標記，而且比周圍普通心肌細胞表達更強（圖4C）。

圖4 豬心房室束定位及驗證。A，B：Masson 染色；A：×4，標尺=1 mm；B：×10，標尺=100 μm（紅色為心肌細胞，藍色是纖維結(jié)締組織）；C：免疫熒光染色，×10，標尺=100 μm。HIS：希氏束.

2.4 左、右束支的位置及形態(tài)學(xué)特點

左束支是由房室束向左的延伸，起始段的細胞形態(tài)與房室束一致，左束支末段會延伸至浦肯野細胞網(wǎng)。左束支位于左心室心內(nèi)膜下，肌纖維粗大、核周圍有空暈、細胞淡染，細胞呈2～3 行規(guī)律排列在心內(nèi)膜下（圖5A、圖5B）；右束支在房室束分支部分的末端以一條細長而獨特的束到達右乳頭肌的底部[7]，它走行于室間隔右側(cè)心內(nèi)膜下，延伸至室間隔乳頭肌基部，越過右心室腔到達前乳頭肌基部[8]。右束支一般從右心室內(nèi)的隔緣肉柱中通過，光鏡下細胞深染、不規(guī)則分布，并且比工作心肌細胞大，它被纖維結(jié)締組織包繞，很容易與普通工作心肌細胞辨別（圖6A、圖6B）。熒光顯微鏡顯示左、右束支細胞表達大量的結(jié)蛋白，而且比周圍的普通心肌細胞表達更強（圖5C、圖6C）。

圖5 豬心左束支定位及驗證。A，B：Masson 染色；A：×4，標尺=1 mm；B：×10，標尺=100 μm（紅色為心肌細胞，藍色是纖維結(jié)締組織）；C：免疫熒光染色，×10，標尺=100 μm。LBB：左束支.

圖6 豬心右束支定位及驗證。A，B：Masson 染色；A：×4，標尺=1 mm；B：×10，標尺=100 μm；C：免疫熒光染色，×10，標尺=100 μm。RBB：右束支.

2.5 浦肯野細胞的位置及形態(tài)學(xué)特點

左、右束支向心室延伸形成浦肯野纖維網(wǎng)，浦肯野細胞又稱束細胞，一般在心尖部的心內(nèi)膜下走行。光鏡下顯示浦肯野細胞比普通心肌細胞大得多，它的細胞核也比心肌細胞核大，染色質(zhì)濃縮較少、淡染，細胞呈單行柱狀排列于心內(nèi)膜下，肌原纖維似乎以無序方式位于細胞周圍[9]（圖7A、圖7B）。熒光顯微鏡顯示浦肯野細胞被結(jié)蛋白抗體標記，且比普通心肌細胞表達更強（圖7C）。

圖7 豬心浦肯野定位及驗證。A，B：Masson 染色；A：×4，標尺=1 mm；B：×10，標尺=100 μm（紅色為心肌細胞，藍色是纖維結(jié)締組織）；C：免疫熒光染色，×10，標尺=100 μm。PF：浦肯野纖維.

2.6 豬心傳導(dǎo)系統(tǒng)細胞中結(jié)蛋白的表達

免疫熒光染色實驗顯示在竇房結(jié)和房室結(jié)細胞中只表達少量結(jié)蛋白，而在快傳導(dǎo)細胞中結(jié)蛋白大量表達，并且熒光強度顯著高于普通心肌細胞（圖8）。隨后用半定量的方法作統(tǒng)計學(xué)分析，將SAN周圍的右心房心肌命名為CM。比較了SAN、AVN、LBB與心房肌之間結(jié)蛋白的平均熒光強度，用Welch’s ANOVA檢驗，結(jié)果顯示4者之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表示結(jié)蛋白在傳導(dǎo)系細胞中的表達與普通心肌細胞之間均有差異，且表達量為：LBB＞心房肌細胞＞SAN＞AVN（圖8）。

圖8 結(jié)蛋白在快傳導(dǎo)系統(tǒng)與SAN、AVN、CM 之間的平均熒光強度的分析

3 討論

據(jù)報道，世界首例轉(zhuǎn)基因豬心的移植手術(shù)于2022 年1 月7 日進行，患者存活2 個月后去世，這是一場歷史性的突破，也證實了豬心的研究具有極大的前景。目前對豬心傳導(dǎo)系統(tǒng)細胞的形態(tài)學(xué)研究還不是很全面，本研究用Masson 染色定位心傳導(dǎo)系統(tǒng)細胞，最后用結(jié)蛋白驗證了豬心傳導(dǎo)系統(tǒng)。

雖然各種動物之間竇房結(jié)位置和形態(tài)略有差異[10-12]，但基本可以定位竇房結(jié)在上腔靜脈根部和右心耳嵴的交界處。光鏡下，竇房結(jié)呈不規(guī)則橢圓形且有結(jié)動脈穿過，它與心外膜之間有一轉(zhuǎn)換區(qū)；房室結(jié)屬于慢傳導(dǎo)細胞，在很多動物中位置比較恒定[13-14]，約90%是位于冠狀竇口、三尖瓣附著緣和Todaro 腱構(gòu)成的Koch 三角內(nèi)。光鏡下房室結(jié)細胞呈不規(guī)則橢圓形且被致密的纖維結(jié)締組織包繞；房室束位于Koch 三角上方最薄的部位，它向下延續(xù)分成左、右束支，最后在心尖部匯集成浦肯野纖維網(wǎng)，用于心室的快速同步激活[11]；左、右束支沿室間隔左側(cè)延伸，在室間隔大約上1/3 處，通常分為前、后2 支或前、中、后3 支，分布于前、中、后乳頭肌根部和室間隔，后分散成浦肯野纖維[12]；右束支在希氏束分支部分的末端以一條細長而獨特的束到達右乳頭肌的底部[13]，它走行于室間隔右側(cè)心內(nèi)膜下，延伸至室間隔乳頭肌基部，越過右心室腔到達前乳頭肌基部[14]。光鏡下觀察到快傳導(dǎo)細胞比普通心肌細胞大且周圍有結(jié)締組織包圍。前人的研究表明結(jié)蛋白在心快傳導(dǎo)系統(tǒng)細胞的表達高于普通心肌細胞[15-16]，在熒光顯微鏡下可見結(jié)蛋白在竇房結(jié)及房室結(jié)中的表達均弱于普通心肌細胞，快傳導(dǎo)系統(tǒng)細胞中結(jié)蛋白表達均高于普通心肌細胞。另外，結(jié)蛋白突變會導(dǎo)致多種疾病，包括傳導(dǎo)阻滯和心源性猝死等[4，17-20]，這也從側(cè)面說明了結(jié)蛋白在房室束、左、右束支、浦肯野細胞中的高表達可能是引起心傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病的生理基礎(chǔ)。

本實驗進行了豬心的心傳導(dǎo)系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)研究，并且進一步證明了結(jié)蛋白在心傳導(dǎo)系統(tǒng)中的差異性分布，為研究心臟疾病提供了相關(guān)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。