朱 薇 張建華# 孟繁亮 章學(xué)文 王 俊 陳思思 張金萍

（1 湖州市第三人民醫(yī)院，湖州 313000；2 紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，紹興 312000）

睪丸扭轉(zhuǎn)多發(fā)生于青春前期和青春期男性，是導(dǎo)致男性不育的常見原因之一，常需急診手術(shù)進(jìn)行復(fù)位，即使早期手術(shù)復(fù)位成功，患者仍會(huì)出現(xiàn)精子總量減少、畸形率增高等異?，F(xiàn)象[1-2]。近年來，研究證實(shí)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位的損傷主要是缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，I/R）[3]。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythriod 2-related factor 2，Nrf2）是調(diào)控細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其介導(dǎo)Nrf2/ARE 通路為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路之一[4]。已有實(shí)驗(yàn)證明姜黃素對腦、心臟等的缺血再灌注損傷均有保護(hù)作用[5，6]，但對睪丸缺血再灌注損傷后睪丸組織Nrf2 的表達(dá)有無影響尚未見報(bào)道。本研究從姜黃素對睪丸缺血再灌注損傷后生精保護(hù)作用，探討其對Nrf2 表達(dá)調(diào)控的作用機(jī)制，為臨床治療睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能低下提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF 級4 周齡雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量90～100 g，清潔級，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供（合格證編號：20170005056712）。正式進(jìn)入實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，動(dòng)物房室內(nèi)溫度為21℃～25℃。相對濕度為50%～65%，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食水，周圍環(huán)境安靜。

1.2 主要藥品、試劑

姜黃素（Sigma-Aldrich 上海貿(mào)易有限公司提供，批號：C1386-5G）；舒泰50（批號：BN7VU4）；RNAStore 樣本保存液（天根，DP408-02）；RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN，批 號：74134/50rxn/）；FastKing RT Kit（With gDNase）（天根，KR116-02）；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（天根，F(xiàn)P205-02）。

1.3 動(dòng)物模型建立與分組

SD 健康雄性大鼠32 只隨機(jī)分為假手術(shù)組、生理鹽水組、姜黃素單次給藥組、姜黃素連續(xù)給藥組，每組8 只。所有動(dòng)物模型按組分籠飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均術(shù)前12 h 禁食，術(shù)前4 h 禁水。睪丸扭轉(zhuǎn)模型采用Turner 法[7]建立。假手術(shù)組：應(yīng)用舒泰50（50 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后將左側(cè)陰囊切開，游離左側(cè)睪丸后縫合陰囊切口。生理鹽水組：應(yīng)用舒泰50（50 mg/kg）腹腔注射麻醉成功后將左側(cè)陰囊切開，游離左側(cè)睪丸后，繞精索順時(shí)針扭轉(zhuǎn)睪丸720°后，用1 號絲線固定睪丸，縫合陰囊，關(guān)閉切口。2 h 后，第2 次切開左側(cè)陰囊，將扭轉(zhuǎn)的睪丸復(fù)位固定，可見睪丸組織由暗紅色逐漸恢復(fù)紅潤。于復(fù)位前30 min，灌胃法灌注生理鹽水（200 mg/kg）。姜黃素單次給藥組：步驟同生理鹽水組，于復(fù)位前30 min，灌胃法灌注姜黃素懸液（200 mg/kg，采用0.5%羥甲基纖維素鈉溶解成懸濁液）。姜黃素連續(xù)給藥組：步驟同生理鹽水組，于復(fù)位前30 min，灌胃法灌注姜黃素懸液（200 mg/kg），術(shù)后每天同等藥物灌胃1 次，連續(xù)7 d。

1.4 睪丸超聲觀察

術(shù)后1 周行左側(cè)睪丸超聲觀察。采用GE Voluson E8 彩色多普勒超聲診斷儀，使用11L-D 線陣變頻探頭，選用小器官睪丸模式，采用灰階頻率15.0～22.0 MHz。觀察各組睪丸形態(tài)、大小、回聲、內(nèi)部結(jié)構(gòu)等。

1.5 精子活動(dòng)率和精子計(jì)數(shù)的測定

各組大鼠于術(shù)后6 周處死，取左側(cè)附睪，剝除附睪附著組織，生理鹽水沖凈后拭干。取部分附睪，放入恒溫水浴箱盛有生理鹽水的試管中，眼科剪適當(dāng)剪碎，37℃恒溫孵育30 min，待附睪精子充分游離后，顯微鏡下記錄精子活動(dòng)率（200 個(gè)精子活動(dòng)情況）。此外按特定部位切取附睪，精密電子天平稱重，迅速放入EP 管中，參照范莉英等[8]的方法加入1 mL 冷生理鹽水，眼科剪充分剪碎，過濾后以4 000 r/min 離心5 min。離心期間配置精子固定液（碳酸氫鈉5g、4%甲醛1 mL，加蒸餾水配置到100 mL 總量）。取1 mL 精子固定液到每管濾液沉淀物中混勻，固定10 min 后，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，靜置3 min 后按常規(guī)方法計(jì)數(shù)。同時(shí)計(jì)算精子相對計(jì)數(shù)值（106個(gè)/100 mg 附睪重）。精子相對計(jì)數(shù)=附睪精子數(shù)/附睪重量×100%。

1.6 睪丸病理學(xué)觀察

各組大鼠于術(shù)后6周處死，切取各組左側(cè)睪丸組織，迅速放入4%多聚甲醛充分固定24 h以上，采用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋。沿睪丸組織作連續(xù)切片，切片厚度4 μm。H-E染色后在光鏡下觀察睪丸組織病理改變情況。

1.7 Nrf2 mRNA 表達(dá)量測定

將各組大鼠處死后，取各組左側(cè)適量睪丸組織，迅速放入RNAStore 樣本保存液中備用。取適量組織采用RNeasy Plus Mini Kit 試劑盒提取總RNA，用NanoDrop 2000 核酸分析儀測定RNA 濃度和純度，A260/A280 控制在1.8 至2.0 之間。采用TIANGEN FastKing RT Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行qPCR，Nrf2[9]上游引物序列為5′-GACAAACATTCAAGCCGATTAGAGG-3′，下游引物序列為5′-ACTTTATTCTTCCCTCTCCTGCG T-3′；內(nèi)參β-actin[10]上游引物序列為5′-CACGGCAT TGTAACCAACTG-3′，下游引物序列為5′-TCTCA GCTGTGGTGGTGAGG-3′。引物由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃30 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)40 次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因mRNA 相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way Anova），組間兩兩比較采用SNK 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 睪丸超聲表現(xiàn)

假手術(shù)組表現(xiàn)為睪丸形態(tài)大小正常，內(nèi)部回聲均勻，包膜光整（圖 1A）；生理鹽水組表現(xiàn)為睪丸外形縮小，內(nèi)部回聲不均勻，可見多量回聲增強(qiáng)區(qū)及小片狀低回聲區(qū)，包膜增厚（圖 1B）；姜黃素單次給藥組表現(xiàn)為睪丸外形略縮小，內(nèi)部回聲不均勻，可見少量回聲增強(qiáng)區(qū)，睪丸周圍見少量無回聲區(qū)，包膜略增厚（圖 1C）；姜黃素連續(xù)給藥組表現(xiàn)為睪丸形態(tài)尚可，內(nèi)部回聲欠均勻，內(nèi)可見少許強(qiáng)回聲，包膜尚光整（圖 1D）。

圖1 各組睪丸超聲表現(xiàn)。A：假手術(shù)組；B：生理鹽水組；C：姜黃素單次給藥組；D：姜黃素連續(xù)給藥組.

2.2 精子活動(dòng)率和精子計(jì)數(shù)的變化

與假手術(shù)組比較，生理鹽水組精子活動(dòng)率、精子計(jì)數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；與生理鹽水組比較，姜黃素連續(xù)給藥組精子活動(dòng)率、精子計(jì)數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；與姜黃素單次給藥組比較，姜黃素連續(xù)給藥組精子活動(dòng)率、精子計(jì)數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；與姜黃素連續(xù)給藥組比較，假手術(shù)組精子活動(dòng)率、精子計(jì)數(shù)均顯著升高（P＜0.0 5）（表1）。

表1 各組大鼠精子活動(dòng)率、精子計(jì)數(shù)的比較（n=8，±s）

表1 各組大鼠精子活動(dòng)率、精子計(jì)數(shù)的比較（n=8，±s）

*P＜0.05 vs 生理鹽水組；#P＜0.05 vs 姜黃素單次給藥組；▲P＜0.05 vs 姜黃素連續(xù)給藥組

組別精子活動(dòng)率（%） 精子計(jì)數(shù)（×106/100 mg）假手術(shù)組68.50±7.50*#▲36.50±2.20*#▲生理鹽水組35.38±5.5319.38±2.50姜黃素單次給藥組41.38±7.8022.50±3.42*姜黃素連續(xù)給藥組58.50±6.82*#31.13±2.70*#

2.3 睪丸組織病理形態(tài)學(xué)變化

假手術(shù)組睪丸生精小管結(jié)構(gòu)正常完整，細(xì)胞排列規(guī)則，生精上皮內(nèi)可見到發(fā)育不同階段的各級生精細(xì)胞，管腔內(nèi)可見到精子（圖 2A）；生理鹽水組較假手術(shù)組睪丸生精小管管腔體積明顯萎縮變小，各級生精細(xì)胞排列紊亂，生精細(xì)胞脫落，個(gè)別發(fā)生壞死，層次減少（圖 2B）；姜黃素單次給藥組較假手術(shù)組睪丸生精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞欠整齊，排列略顯紊亂，可見生精細(xì)胞脫落現(xiàn)象，但層次仍可辨認(rèn)（圖2C）；姜黃素連續(xù)給藥組較假手術(shù)組生精小管內(nèi)有少量生精細(xì)胞脫落，排列基本整齊有序，層次清楚（圖2D）。

2.4 睪丸組織Nrf2 mRNA 的表達(dá)

與假手術(shù)組Nrf2 mRNA（1.02±0.03）比較，生理鹽水組睪丸組織Nrf2 mRNA（1.31±0.06）表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與生理鹽水組Nrf2 mRNA 比較，姜黃素連續(xù)給藥組睪丸組織Nrf2 mRNA（1.78±0.05）表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與姜黃素單次給藥組Nrf2 mRNA（1.39±0.07）比較，姜黃素連續(xù)給藥組睪丸組織Nrf2 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與姜黃素連續(xù)給藥組睪丸組織Nrf2 mRNA 比較，假手術(shù)組睪丸組織Nrf2 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位是一個(gè)典型的缺血再灌注損傷過程，雖然扭轉(zhuǎn)后睪丸得到復(fù)位可以恢復(fù)血供，但睪丸在缺血的初期已經(jīng)發(fā)生損害，且在再灌注階段這種損傷反應(yīng)會(huì)加重。超聲檢查是睪丸扭轉(zhuǎn)首選的影像學(xué)檢查方法，不同程度的睪丸缺血損傷在超聲下有不同的影像學(xué)表現(xiàn)[11]，因此超聲可以對睪丸扭轉(zhuǎn)后的缺血程度進(jìn)行較為客觀的評估。氧自由基損傷是缺血再灌注損傷的病理生理基礎(chǔ)。扭轉(zhuǎn)后組織中抗氧化酶活性明顯降低，此時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基，活化黏附在小靜脈壁上的白細(xì)胞，通過釋放中間介質(zhì)，如溶酶體酶、花生四烯酸代謝產(chǎn)物、反應(yīng)性氧中間產(chǎn)物等，從而損害微血管系統(tǒng)以及睪丸實(shí)質(zhì)組織，因此清除氧自由基對減輕睪丸的氧化損傷至關(guān)重要。超氧化物歧化酶（SOD）是組織中清除體內(nèi)超氧離子自由基的抗氧化酶之一[12]，睪丸組織缺血、缺氧時(shí)該清除系統(tǒng)功能降低或喪失，再灌注后恢復(fù)血供，組織內(nèi)SOD 活性下降。過多的氧自由基引起生物膜不飽和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成丙二醛（MDA），反映組織中自由基含量及脂質(zhì)過氧化程度[13]。課題組前期研究[14]表明：在睪丸缺血再灌注損傷中，姜黃素通過上調(diào)Nrf2 蛋白，提高SOD 活性，清除氧自由基，降低組織內(nèi)MDA 含量，起到保護(hù)睪丸的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組可見睪丸生精小管縮小和壞死脫落細(xì)胞，層次結(jié)構(gòu)紊亂，而姜黃素單次給藥組和連續(xù)給藥組睪丸組織結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，連續(xù)給藥組較單次給藥組生精小管結(jié)構(gòu)更加完整，排列更整齊，層次更清楚，表明連續(xù)給藥效果明顯優(yōu)于單次給藥，與超聲改變相符。

Nrf2 是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[15]。正常生理狀態(tài)下，Nrf2 定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與胞漿蛋白伴侶分子Keap1（Kelch-like ECH associated protein1，Keap1）結(jié)合而處于活性抑制狀態(tài)[4]。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激源產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）或其他理化因子刺激時(shí)，Nrf2 蛋白與Keap1 解偶聯(lián)后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，在細(xì)胞核內(nèi)與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合形成Nrf2/ARE 信號通路[16]。一方面，氧化應(yīng)激ROS 造成Keap1-Nrf2 復(fù)合體解離，導(dǎo)致游離的Nrf2 增加，Nrf2 從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，并上調(diào)下游抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表達(dá)，降低氧化應(yīng)激[17]；另一方面，氧化應(yīng)激還能加速Nrf2 的mRNA 轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Nrf2 蛋白合成[18]。研究顯示，Nrf2/ARE 通路在心、腦、肝等多個(gè)臟器中均可發(fā)揮內(nèi)源性抗氧化作用[19]，通過激活A(yù)RE，啟動(dòng)受ARE 調(diào)控的下游一系列抗氧化因子基因如SOD、HO-1、NQO1 等的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，增加細(xì)胞抗氧化蛋白生成，減輕缺血再灌注損傷[20-21]。

姜黃素是一類從傳統(tǒng)中藥姜黃根莖中分離出的天然產(chǎn)物，為多酚類化合物，其脂溶性好，性質(zhì)穩(wěn)定[22]。姜黃素味苦、辛，性溫，歸脾、肝經(jīng)，具有破血行氣、通經(jīng)止痛功能[23]。近年來研究顯示姜黃素具有抗炎、抗氧化、清除自由基等多方面藥理作用。本研究結(jié)果顯示：生理鹽水組精子質(zhì)量明顯低于假手術(shù)組，而姜黃素單次給藥組和連續(xù)給藥組精子質(zhì)量較生理鹽水組明顯升高，且連續(xù)給藥組精子質(zhì)量優(yōu)于單次給藥組，說明睪丸I/R 時(shí)睪丸內(nèi)部損傷，導(dǎo)致生精功能明顯降低，姜黃素可減輕睪丸的缺血再灌注損傷，改善睪丸I/R 生精功能。I/R后睪丸較正常情況下Nrf2 的表達(dá)升高，而此期間睪丸在彩色多普勒超聲中表現(xiàn)為外形縮小、回聲不均勻，病理形態(tài)學(xué)損傷重，提示此期間睪丸內(nèi)對于應(yīng)激和氧化損傷雖然有保護(hù)性反應(yīng)，上調(diào)Nrf2 表達(dá)以對抗損傷，但是此作用不足以對抗此期間睪丸缺血再灌注所釋放的活性氧簇、炎癥因子和細(xì)菌性內(nèi)毒素的致?lián)p傷作用，睪丸組織損傷程度仍較重。姜黃素給藥組通過進(jìn)一步增加Nrf2 的表達(dá)水平，激活Nrf2/ARE 信號通路，從而誘導(dǎo)下游抗氧化應(yīng)激基因過表達(dá)，增強(qiáng)組織抗氧化應(yīng)激和清除活性氧自由基的能力，減輕睪丸組織損傷，且連續(xù)給藥組表達(dá)Nrf2 的水平明顯優(yōu)于單次給藥組。超聲能直觀、客觀反映睪丸扭轉(zhuǎn)后的大小、形狀、內(nèi)部回聲等相關(guān)情況，生理鹽水組睪丸外形縮小，內(nèi)部回聲不均勻，而姜黃素單次給藥組和連續(xù)給藥組睪丸外形尚可、內(nèi)部回聲較均勻，且連續(xù)給藥組超聲形態(tài)優(yōu)于單次給藥組，其與上述改變相符。

綜上所述，Nrf2 對大鼠睪丸缺血再灌注損傷后的生殖功能起到了一定的保護(hù)作用，而姜黃素可以提高睪丸組織Nrf2 的表達(dá)，通過激活Nrf2/ARE 通路，增加下游抗氧化蛋白的表達(dá)，提高睪丸清除氧自由基的能力，從而減輕睪丸缺血再灌注損傷，改善精子質(zhì)量。然而對于姜黃素調(diào)控睪丸Nrf2 的表達(dá)，從而對睪丸缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用的具體機(jī)制，尚需進(jìn)一步的探討研究。