馬 暢 趙迎峰 陳 莉 劉 彪 趙志剛 惲?xí)r鋒

(1.中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)療保障中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室,全軍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科普與倫理教育基地,全國科普教育基地,南京 210002)(2.中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院第三派駐門診部,南京 210002)

小鼠細(xì)小病毒(minute virus of mice,MVM)是嚙齒類動(dòng)物常見病原體,對腫瘤細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均具有較高親和力[1-2],是細(xì)胞培養(yǎng)中的常見污染源[3-4]。MVM穩(wěn)定性極強(qiáng),在4 ℃或37 ℃放置一周,感染滴度下降不超過1.2 Log[5]。因此MVM污染不易清除和滅活,已成為危害生物制品安全的一個(gè)重要因素。自然情況下,MVM感染成年小鼠不表現(xiàn)任何臨床癥狀,但能影響免疫系統(tǒng)、腫瘤接種和皮膚移植等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[2,6-7]。因此,表達(dá)出免疫原性較好的抗原蛋白,可為MVM VP2相關(guān)功能的研究和臨床診斷方法的建立提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng):草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞系(Spodoptera frugiperda cells 9, Sf9)由本實(shí)驗(yàn)室保存;Bac-To-Bac?桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)采購于Life technologies公司。

1.1.2主要試劑:硫酸慶大霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、IPTG、X-Gal(北京索萊寶科技有限公司);Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、免疫染色固定液及His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司);0.3%TritonX-100(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);PCR相關(guān)試劑(南京諾維贊生物科技有限公司);BAC/PAC DNA提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒(OMEGA公司);HiGene 轉(zhuǎn)染試劑(普利萊基因技術(shù)有限公司);BamHI和EcoRI【寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司】;I-Max昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)液(維森特生物技術(shù)有限公司);PCR引物和優(yōu)化基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.3序列優(yōu)化與引物合成:根據(jù)NCBI GenBank中公布的MVM株全基因(GenBank:J02275.1)中VP2序列(2792-4554),進(jìn)行編碼序列偏好性優(yōu)化,并在序列兩端增加酶切位點(diǎn)、C端添加His-tag,合成后插入pUC57,命名為pUC57-MVM VP2,由本實(shí)驗(yàn)室保存。pUC57-MVM VP2和VP2特異引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.1.4重組桿狀質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定:質(zhì)粒pUC57-MVM VP2作為模板,利用特異引物進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。擴(kuò)增體系:稀釋后的質(zhì)粒模板1 μL,MVM VP2-F/R引物(10 μmol/L)各1 μL,2× Phanta Max Master Mix 12.5 μL,滅菌水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃ 30 s預(yù)變性,擴(kuò)增片段35個(gè)循環(huán)(變性95 ℃ 15 s,退火56 ℃ 15 s,延伸72 ℃ 55 s),徹底延伸72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,切下目的片段回收和純化?；厥掌谓?jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后,插入pFastBac1載體中,構(gòu)建pFastBac1-MVM VP2重組質(zhì)粒。提取質(zhì)粒,取1 μg轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,涂布藍(lán)白斑篩選LB平板,恒溫培養(yǎng)箱37 ℃避光培養(yǎng)。藍(lán)白斑篩選兩次后,挑選出白色單克隆用MVM VP2-F/R、pUC/M13-F/R引物進(jìn)行PCR鑒定,擴(kuò)大培養(yǎng)后提取Bacmid桿粒,獲得重組Bacmid-MVM VP2,經(jīng)再次PCR鑒定后備用。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作說明書進(jìn)行。

1.1.5重組桿狀病毒的獲得:參照HiGene轉(zhuǎn)染試劑說明書,利用HiGene轉(zhuǎn)染試劑將Bacmid-MVM VP2 轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞,27 ℃溫箱培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí),1 200 r/min、4 ℃低溫離心5 min,棄去細(xì)胞和碎片沉淀,上清液即為第一代重組病毒rBac-MVM VP2(P0),按1∶10接毒比例傳至第三代,測定病毒滴度(TCID50)后避光存放于4 ℃或分裝凍存于-80 ℃冰箱。

1.1.6IFA鑒定蛋白表達(dá):rBac-MVM VP2(MOI=1)感染Sf9細(xì)胞,同時(shí)設(shè)空白Sf9作對照,27 ℃恒溫箱培養(yǎng)。分別于48、72 h后棄除細(xì)胞培養(yǎng)液,加入免疫染色固定液室溫固定10 min,PBST洗滌3次;TritonX-100室溫透膜10 min,PBST清洗,加入1∶500稀釋的MVM鼠源單克隆抗體(由本實(shí)驗(yàn)保存),37 ℃孵育1 h,PBST清洗;加入1∶500稀釋的Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗小鼠IgG,37 ℃避光孵育45 min,PBST清洗后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.1.7Western blot檢測蛋白表達(dá):重組病毒感染Sf9細(xì)胞,操作同步驟1.6,27 ℃、90 r/min恒溫?fù)u床懸浮培養(yǎng),于48、72 h分別收集細(xì)胞,使用MVM鼠源單克隆抗體作為一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG作為二抗,進(jìn)行Western blot檢測。

1.1.8蛋白純化:Sf9細(xì)胞同1.1.5方法接種重組桿狀病毒,72 h后1 200 r/min低速離心收集細(xì)胞,去除培養(yǎng)液加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液4 ℃作用30 min。超聲破碎處理,超聲條件:超聲功率300 W,每次超聲10 s,間隔10 s,共超聲破碎10 min。細(xì)胞裂解液10 000 r/min、4 ℃低溫離心10 min,上清液經(jīng)0.45 μm蛋白低吸附針頭濾器過濾后進(jìn)行純化。純化過程嚴(yán)格遵照試劑盒說明書進(jìn)行,SDS-PAGE檢測純化蛋白。

2 結(jié)果

2.1 重組桿狀質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以pUC57-MVM VP2質(zhì)粒為模板,利用特異性引物成功擴(kuò)增出MVM VP2條帶,與預(yù)期大小1 781 bp一致(圖1A)。再用限制性內(nèi)切酶(BamHI和EcoRI)酶切純化后的目的條帶,酶切片斷再次純化后插入pFastBac1載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac1-MVM VP2。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,藍(lán)白斑篩選后用PCR方法對Bacmid-MVM VP2菌液進(jìn)行鑒定(擴(kuò)增片斷大小為2 300 bp+插入片段1 781 bp)。結(jié)果顯示(圖1B),第1、2、4、6號為陽性,選取4號Bacmid-MVM VP2重組菌提取重組桿粒,經(jīng)再次PCR鑒定后(圖1C)進(jìn)行Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

注:A.M:DL5000 DNA Marker;1.特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物MVM VP2;2.重組質(zhì)粒pFastBac1-MVM VP2經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切;3.重組質(zhì)粒pFastBac1-MVM VP2;B.M:DL5000 DNA Marker;1-8.pUC/M13引物對Bacmid-MVM VP2重組菌鑒定;9.陰性對照;C.M:DL5000 DNA Marker;1.pUC/M13引物鑒定Bacmid-MVM VP2 4號質(zhì)粒;2.重組Bacmid-MVM VP2桿粒;3.陰性對照

2.2 重組桿狀病毒rBac-MVM VP2的獲得

將重組桿狀質(zhì)粒Bacmid-MVM VP2 轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞,27 ℃恒溫培養(yǎng),每天觀察細(xì)胞狀態(tài),直至出現(xiàn)病變,低溫離心收集細(xì)胞上清液,獲得重組桿狀病毒P0代。與空白組相比,感染病毒后的Sf9細(xì)胞體積變大,核區(qū)擴(kuò)增明顯并向內(nèi)凹陷,細(xì)胞邊緣模糊顏色變暗,且有較多細(xì)胞碎片漂浮在培養(yǎng)液中。繼續(xù)感染Sf9細(xì)胞,進(jìn)行病毒增殖,收集病毒液并測定病毒滴度,P3株滴度可達(dá)到2.52×108TCID50/mL(圖2)。

注:A.正常Sf9細(xì)胞; B.感染重組桿狀病毒 rBac-MVM VP2 后病變的Sf9細(xì)胞

2.3 IFA鑒定蛋白表達(dá)

于接毒后48和72 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),分別收集重組病毒感染(MOI=1)的Sf9細(xì)胞,IFA鑒定蛋白表達(dá)。如圖3所示,感染rBac-MVM VP2 的Sf9細(xì)胞出現(xiàn)特異性紅色熒光,而空白組無熒光。熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,72 h感染細(xì)胞的熒光數(shù)量明顯多于48 h的熒光數(shù)量(P<0.01)。表明接毒48和72 h后,Sf9細(xì)胞中均成功表達(dá)VP2重組蛋白,且在感染72 h后時(shí)蛋白表達(dá)量較高。

注:A.正常Sf9細(xì)胞; B.重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞48 h; C.重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞72 h; D.熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖,*P<0.01

2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)

于48和72 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),分別收集病毒感染(MOI=1)的Sf9細(xì)胞蛋白,Western blot檢測蛋白表達(dá)情況。如圖4所示,重組VP2蛋白在Sf9細(xì)胞中得到高效表達(dá),能與MVM鼠源單克隆抗體結(jié)合出現(xiàn)特異條帶,大小約64 kU。且病毒感染72 h后胞內(nèi)重組VP2蛋白的表達(dá)量明顯較48 h高(P<0.01)。結(jié)果表明,感染病毒的Sf9細(xì)胞表達(dá)出的MVM VP2重組蛋白可與MVM單克隆抗體特異性結(jié)合,且在感染72 h后蛋白表達(dá)量較高。

注:M.蛋白Marker; 1.正常Sf9細(xì)胞; 2.重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞48 h; 3.重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞72 h;*P<0.01

2.5 重組蛋白純化結(jié)果

重組桿狀病毒感染(MOI=1)Sf9細(xì)胞,懸浮培養(yǎng)72 h后低速離心收集細(xì)胞。加入適量預(yù)冷細(xì)胞裂解液,冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞,裂解液經(jīng)低溫離心后收集上清進(jìn)行蛋白純化,SDS-PAGE檢測純化前后的蛋白純度。如圖5所示,經(jīng)過多次洗滌后,可以得到純度較高的VP2重組蛋白,大小約64 kU,蛋白大小符合預(yù)期。

注:M.蛋白Marker; CP.細(xì)胞沉淀; CL.細(xì)胞裂解上清; FT.上樣穿流液;W1～W5.洗滌液1-5; E1～E2.洗脫液1-2

3 討論

細(xì)小病毒(MVM株)是嚙齒類動(dòng)物常見的感染性病原體,在歐洲、美國和澳大利亞等國家都有較高的感染率。我國也曾報(bào)道,在普通小鼠群體中MVM感染非常普遍[8],MVM已被列為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)中要求排除的感染性病原體。MVM對新生小鼠可以誘發(fā)致命性腎出血,但在自然條件下,MVM對成年小鼠常呈隱性感染,不表現(xiàn)任何臨床癥狀。但研究報(bào)道,在涉及免疫系統(tǒng)、腫瘤移植的實(shí)驗(yàn)中,感染MVM可增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體對誘發(fā)性或自發(fā)性腫瘤的抵抗力,直接降低腫瘤生長速度[9],還會干擾淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)和腹水的產(chǎn)生,改變異體皮膚移植的排斥反應(yīng)[2]。此外,由于MVM在外界環(huán)境中呈高度穩(wěn)定性[10-11],所以設(shè)施內(nèi)動(dòng)物之間傳播可能性很大。因此,建立針對MVM血清學(xué)和病原學(xué)的檢測方法,表達(dá)出敏感性好、特異性高的抗原蛋白顯得尤為重要。

MVM,細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬,無包膜單鏈DNA病毒,基因組總長度約5 000 bp,呈二十面體對稱結(jié)構(gòu),直徑約26 nm[12]?；蚪M攜帶有5’ORF和3’ORF兩個(gè)開放閱讀框(open reading frame, ORF),前者編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2,而后者編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2[13]。與VP1相比,VP2為主體衣殼蛋白(約占衣殼總蛋白的85%),主要參與病毒外殼的組裝,并在入胞時(shí)介導(dǎo)病毒與受體蛋白的互作。所以,MVM VP2常作為免疫檢測方法中的特異檢測蛋白。

昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)作為表達(dá)外源基因的有效途徑,具有表達(dá)產(chǎn)量高、保持蛋白天然生物學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn)。除此,Sf9、High5等昆蟲細(xì)胞具有培養(yǎng)操作簡便、成本較低、易于擴(kuò)大培養(yǎng)的特性,常廣泛運(yùn)用于重組蛋白的高效表達(dá)[14-15]。為此,本研究將MVM VP2目的序列優(yōu)化為桿狀病毒偏愛密碼子序列,利用分子克隆技術(shù)將 MVM VP2 基因片斷插入pFastBac1質(zhì)粒。用雙酶切方法驗(yàn)證重組質(zhì)粒,再將其轉(zhuǎn)化至DH10Bac細(xì)胞中進(jìn)行重組,得到Bacmid-MVM VP2重組桿粒。重組桿粒用經(jīng)典PCR方法驗(yàn)證正確后,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至呈對數(shù)期生長的Sf9細(xì)胞。通過Sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),成功獲得重組桿狀病毒rBac-MVM VP2。將此病毒感染Sf9細(xì)胞48和72 h后,分別進(jìn)行IFA和Western blot驗(yàn)證。IFA結(jié)果顯示感染rBac-MVM VP2的Sf9細(xì)胞48 h時(shí)出現(xiàn)VP2蛋白的特異性熒光,且在感染72 h時(shí)特異性熒光明顯增多。同樣,Western blot結(jié)果顯示,感染 rBac-MVM VP2 的細(xì)胞48 h后即可被MVM鼠源單克隆抗體特異性識別,具有良好的免疫活性,且72 h時(shí)蛋白表達(dá)量明顯升高。蛋白純化SDS-PAGE結(jié)果顯示,多次洗滌后,可洗脫下純度較高的MVM VP2蛋白,蛋白大小與Western blot檢測結(jié)果相同,符合預(yù)期。

綜上,本研究利用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)成功表達(dá)MVM VP2蛋白,經(jīng)鑒定重組VP2蛋白表現(xiàn)出良好的生物學(xué)構(gòu)象,免疫原性較好,可為MVM VP2相關(guān)功能的研究和診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。