李曉娟 孫巖峰 修 葉 李興杰 李瑞生

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部研究所,北京 100039)(2.中國人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心兒科,北京 100039)(3.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝病醫(yī)學(xué)部研究所,北京 100039)(4.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福州 350122)

近年來惡性腫瘤的發(fā)病率呈持續(xù)增長趨勢已成為嚴(yán)重的社會(huì)問題[1]。隨著研究的不斷突破,以PD-1/PD-L1為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療成為熱點(diǎn),通過抑制PD-1/PD-L1通路,從而恢復(fù)機(jī)體免疫功能并產(chǎn)生抗腫瘤作用[2]。眾所周知,動(dòng)物模型在實(shí)驗(yàn)研究中擔(dān)負(fù)起不可取代的重要作用,研究者多通過基因修飾的技術(shù),將小鼠體內(nèi)的相關(guān)基因替換成人的相關(guān)基因從而建立人源化小鼠模型,能夠更好的在動(dòng)物模型中模擬人類疾病并進(jìn)行研究,此類人源化小鼠廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫藥物研發(fā)、藥物臨床前評估、人基因功能研究等生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究[3-5]。本實(shí)驗(yàn)擬采用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)來構(gòu)建PD-1人源化小鼠,為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用PD-1人源化小鼠(h-PD-1)作為藥物篩選及評價(jià)來提供良好的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:本實(shí)驗(yàn)委托賽業(yè)模式生物研究中心(太倉)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(蘇)2018-0003】。采用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù),將C57BL/6J小鼠中PD-1的胞外區(qū)替換為相應(yīng)的人源片段,同時(shí)完整保留小鼠PD-1的胞內(nèi)部分,將構(gòu)建好的受精卵通過顯微注射法送回到代孕鼠輸卵管中,最終獲得陽性F0鼠。對F0鼠進(jìn)行配繁,將性成熟的陽性F0鼠與野生型鼠配繁一代,獲得F1代鼠,并經(jīng)鼠尾基因組DNA的PCR檢測PD-1的基因表達(dá)。因此公司提供了4只SPF級(jí)F1代小鼠,其中2只雌性和2只雄性,品系:C57BL/6J,基因型(KI/+),體質(zhì)量20～24 g,8～9周齡。

1.1.2人源化小鼠的飼養(yǎng)與繁殖:將獲得的4只F1代小鼠按照SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),采用1(雄鼠)∶1(雌鼠)配比的方式進(jìn)行繁殖。動(dòng)物飼養(yǎng)在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(軍)2017-0016】,屏障環(huán)境按國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)管理,飼料墊料購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2019-0010】。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷,通過了解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審查,倫理審批號(hào):IACUC-2021-0020。

1.1.3主要試劑與儀器:小鼠基因型快速鑒定試劑盒(北京陽光英銳生物科技有限公司,貨號(hào):C190801);上樣緩沖液&DNA染料(即用型)(北京陽光英銳生物科技有限公司,貨號(hào):C081911);50 bp DNA Ladder(北京金克隆生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):MD0050);PCR擴(kuò)增儀(PeQlab,型號(hào):PEQSTAR 2X)。

1.2 方法

1.2.1小鼠基因組DNA提取:將獲得的F1代飼養(yǎng)繁殖的F2代小鼠雌雄分籠后,分別剪取小鼠尾部一小段(0.2～0.5 cm)置入1.5 mL Eppendorf管中,參照小鼠基因型快速鑒定試劑盒抽提基因組DNA。

1.2.2PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳基因型鑒定:兩組引物設(shè)計(jì):(1)野生型:上游引物:5′-TTCCTTTCCGCTACAGACAACTC-3′,下游引物:5′-CTTCACAGAGAGGGACACAGAAGA-3′;(2)純合子:上游引物:5′-GAATGGTGACCGGCATCTCTG-3′,下游引物:5′-GCTTTTGTAGTGGTCAGAGTGTGT-3′。PCR 反應(yīng):下列反應(yīng)物構(gòu)成20 L的反應(yīng)體系。上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,2×Hot Taq Mix 10 μL,DNA 模板(Diluted Template)2 μL,加H2O補(bǔ)足20 μL。采用基因擴(kuò)增儀進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增:預(yù)變性,95 ℃ 5 min;變性,95 ℃ 30 s;退火,55 ℃ 30 s;延伸,72 ℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán),最后再延伸10 min。電泳鑒定:分別取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL,在2.0%瓊脂糖凝膠中以120 V電泳30 min后于凝膠成像儀中觀察拍照。小鼠尾部組織瓊脂糖凝膠電泳基因型片段為:野生型:434 bp;純合型:410 bp;雜合型:434 和410 bp,按此基因條帶鑒別各個(gè)基因型小鼠。

1.2.3繁育與純合型小鼠篩選鑒定:對F2代小鼠進(jìn)行基因型鑒定,分別記錄各基因型數(shù)量以及純合型數(shù)量,計(jì)算純合率。然后采用經(jīng)典育種與PCR相結(jié)合的方法對基因敲除小鼠純合型再次進(jìn)行篩選。出生21 d后仔鼠行PCR檢測,選出純合型小鼠。成年F2代純合型與純合型、野生型與野生型進(jìn)行交配,對繁殖的F3代仔鼠再進(jìn)行基因型鑒定,確定基因型的穩(wěn)定性后,繼續(xù)將純合型小鼠穩(wěn)定擴(kuò)群。

2 結(jié)果

2.1 人源化小鼠F2代配繁及生長情況

截至目前,F2代小鼠共繁殖5窩,每窩成活率均>95%。母鼠孕期為21 d左右,幼鼠由母鼠母乳喂養(yǎng),哺乳期 21 d 左右,產(chǎn)后3周離乳。隨著產(chǎn)仔窩數(shù)的增加,仔鼠的數(shù)量逐漸減少,母鼠的生育能力呈逐漸降低的狀態(tài)。前4窩仔鼠雄性數(shù)量均比雌性數(shù)量多(表1)。

表1 F2代繁育結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 人源化小鼠F2代基因鑒定結(jié)果

將人源化小鼠出生21 d的F2代小鼠進(jìn)行編號(hào),部分小鼠鼠尾基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖1。根據(jù)僅在410 bp左右位置可見條帶為PD-1人源化小鼠純合型,僅434 bp位置可見條帶為野生型,在410和434 bp位置同時(shí)存在條帶的小鼠為雜合型的判斷原則,圖中1號(hào)、4號(hào)、7號(hào)為純合型小鼠;2號(hào)、5號(hào)為雜合型小鼠;3號(hào)、6號(hào)、8號(hào)為野生型小鼠。

注:M.marker, 1～8分別為8只F2代小鼠

2.3 F2代交配繁育的F3代鑒定結(jié)果

根據(jù)PCR鑒定結(jié)果,將F2代中鑒定的雜合型與雜合型,純合型與純合型小鼠按雌雄1∶1的比例進(jìn)行配繁。將純合型交配繁殖的F3代小鼠用上述相同的方法進(jìn)行鑒定,條帶均為410 bp,說明均為純合型,符合鑒定結(jié)果(圖2),可繼續(xù)進(jìn)行繁殖擴(kuò)群。純合型與野生型小鼠外觀上未見明顯差異(圖3)。

注:M.marker, 1～4分別為4只F3代純合型小鼠

注:A.腹部對比圖;B.背部對比圖

3 討論

基因工程動(dòng)物模型在生物醫(yī)學(xué)研究中是非常重要的研究載體,由于小鼠體型小,方便實(shí)驗(yàn)操作,又易于飼養(yǎng)繁殖,價(jià)格便宜,因此成為了基因工程動(dòng)物模型的首選[6]。研究者可以對新出現(xiàn)的熱點(diǎn)基因敲入各種品系的小鼠體內(nèi),以便進(jìn)行不同疾病信號(hào)通路的研究。有研究[7]穩(wěn)定的繁殖了AMPKα2基因敲除小鼠純合子,為以后在糖尿病研究中提供了很好的動(dòng)物平臺(tái);有研究[8]成功構(gòu)建了前列腺癌免疫人源化小鼠模型,為下一步構(gòu)建良好的前列腺癌免疫治療臨床前模型奠定了基礎(chǔ);有研究[9]構(gòu)建PD-L1基因敲除小鼠品系,為 PD-L1體內(nèi)基因功能研究提供了新的小鼠模型。而有關(guān)PD-1的基因工程小鼠報(bào)道甚少,人源化PD-1的基因型小鼠尚未見報(bào)道。

因此,本實(shí)驗(yàn)采用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù),將C57BL/6J小鼠中PD-1的胞外區(qū)替換為相應(yīng)的人源片段,同時(shí)完整保留小鼠PD-1的胞內(nèi)部分,將構(gòu)建好的受精卵通過輸卵管胚胎移植法送回代孕鼠輸卵管中,獲得陽性F0鼠。再將性成熟的陽性F0鼠與野生型鼠配繁一代,獲得F1代鼠,并經(jīng)鼠尾基因組DNA的PCR鑒定小鼠的基因型。本實(shí)驗(yàn)室把F1代進(jìn)行交配獲得F2代仔鼠,共繁殖5窩,分別記錄了每窩的生仔數(shù)、基因型數(shù)以及純合率。根據(jù)孟德爾遺傳定律,采用雜合子互交,子代小鼠可能出現(xiàn)野生型(PD-1+/+)、雜合子(PD-1+/-)和純合子(PD-1-/-)3種基因型,其比例接近1∶2∶1,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除第5窩外,前4窩均雜合型數(shù)量最多,野生型與純合型數(shù)量較少且接近,三者比例接近1∶2∶1,因此符合孟德爾遺傳定律的特征。隨后實(shí)驗(yàn)中的雜合型小鼠可用于保種,而野生型小鼠可用于實(shí)驗(yàn)陰性對照組,該繁育方法同時(shí)滿足了實(shí)驗(yàn)與保種的需求[10]。隨著繁殖窩數(shù)的增多,F1代鼠的產(chǎn)仔數(shù)逐漸減少,說明其生育能力逐漸降低,因此實(shí)驗(yàn)要盡快開展,將F2代鼠鑒定完畢后,盡快繁殖下一代,確保純合型得到穩(wěn)定擴(kuò)群。由于PD-1人源化小鼠的各基因型從外觀上很難區(qū)分,因此從基因水平進(jìn)行鑒定是實(shí)驗(yàn)的首要任務(wù)。眾所周知,PCR法是非常成熟且廣泛應(yīng)用的鑒定基因型的方法,我們設(shè)計(jì)了分別針對野生型與純合型的兩對特異性引物,能夠增加鑒定不同基因型的準(zhǔn)確性和可靠性[11]。根據(jù)PCR的鑒定結(jié)果,我們嚴(yán)格按照SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)對小鼠進(jìn)行飼養(yǎng)和繁殖[12],在子代中挑選幾對雜合型與雜合型配繁保持種群穩(wěn)定性,其余挑選純合型與純合型再進(jìn)行繁育,結(jié)果其F3代仔鼠全部為純合型,而且后續(xù)再生的兩窩仔鼠基因型鑒定也均為純合型,說明其基因型保存完整。同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)PD-1人源化小鼠純合型配繁后的懷孕率及生仔數(shù)均不低,我們知道在小鼠繁殖過程中噪音對繁殖也起到關(guān)鍵的影響作用,如果噪音過大或者來往人員過密,就會(huì)造成母鼠煩躁不哺乳,進(jìn)而引起仔鼠死亡,同時(shí)多項(xiàng)研究結(jié)果也顯示各種基因工程小鼠都存在食仔現(xiàn)象[13]。因此每天進(jìn)行觀察的時(shí)候要盡量保持安靜,再給予蛋黃等營養(yǎng)食物,能夠明顯的緩解食仔現(xiàn)象[14],這樣可明顯提高母鼠的產(chǎn)仔率和仔鼠的成活率,為下一步實(shí)驗(yàn)研究提供良好的動(dòng)物保障。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù),所構(gòu)建的PD-1人源化小鼠動(dòng)物模型,在免疫檢查點(diǎn)抑制劑研究中具有獨(dú)特的研究價(jià)值,通過對其基因型鑒定并有效地進(jìn)行了擴(kuò)群,為今后相關(guān)小分子抑制劑體內(nèi)藥效評價(jià)實(shí)驗(yàn)提供有力的保障。