亓 妙 徐晨曦 呂玲娟 楊志宏 楊潤(rùn)梅

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理研究中心,北京 100193)

高脂血癥是一種以機(jī)體血液脂質(zhì)水平異常為特征的常見代謝性疾病,也是引起動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病及脂肪肝等的重要致病因素。它對(duì)人體的損害是隱蔽、逐步、進(jìn)行性的,是一種全身性的疾病。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變,高脂血癥的發(fā)病率明顯上升,成為了目前常見臨床疾病[1],而且由其誘發(fā)的各類疾病已嚴(yán)重威脅人類身體健康。建立穩(wěn)定、理想的高脂血癥模型是研究疾病的重要基礎(chǔ),也是降脂新藥研發(fā)的需要。

大鼠是目前最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,具備飼養(yǎng)方便、成本較低、取血量大等特點(diǎn),也常用于建立高脂血癥動(dòng)物模型,廣泛的用于降脂藥物的研究[2-3]。通過(guò)文獻(xiàn)[4-6]調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)大鼠的高脂飼料配方種類眾多,建模效果也不穩(wěn)定。因此本實(shí)驗(yàn)在飼料中添加不同比例的膽固醇、豬油、蔗糖、果糖和酪蛋白等常用造模劑,目的在于找到一個(gè)能誘導(dǎo)穩(wěn)定高脂血癥模型的大鼠高脂飼料配方,為降脂藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量200～220 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2016-0006】。飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動(dòng)物中心屏障環(huán)境【SYXK(京)2017-0020】中。溫度:21～25 ℃,濕度:40%～60%,12 h光照陰暗交替。所有實(shí)驗(yàn)操作均按照該中心的操作指南執(zhí)行,并得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的許可,倫理審批號(hào):SLXD-20200918027。

1.1.2實(shí)驗(yàn)飼料:普通飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供,高脂飼料從河南省環(huán)宇禾康生物科技有限公司自行訂購(gòu),總共有五種配方。配方見表1。

表1 高脂飼料配方表(%)

1.1.3試劑:血清總膽固醇(total cholesterol, TC)檢測(cè)試劑盒,批號(hào)191671,有效期至2021-06-23;甘油三酯(triglyceride, TG)檢測(cè)試劑盒,批號(hào)191051,有效期至2021-08-26;低密度脂蛋白-膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)檢測(cè)試劑盒,批號(hào)191321,有效期至2020-09-26;高密度脂蛋白-膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)檢測(cè)試劑盒,批號(hào)191211,有效期至2020-10-13,以上試劑盒均來(lái)源于中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 方法

大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后開始實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為正常組、模型1組、模型2組、模型3組、模型4組、模型5組,10只/組。正常組給予普通飼料,其余各模型組給予相應(yīng)配方的高脂飼料,配方見表1。自由飲水,連續(xù)喂養(yǎng)6周。每日記錄大鼠進(jìn)食量,每周稱重。分別于造模1、2、4及6周后,禁食不禁水12 h,大鼠麻醉后眼眶內(nèi)眥后靜脈叢采血約0.5 mL,血樣4 ℃下靜置2 h、3 500 r/min離心15 min取血清,測(cè)定TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。過(guò)量麻醉處死大鼠,剖取肝,檢測(cè)肝中TG、TC的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 進(jìn)食量

與正常對(duì)照組大鼠相比,模型2組、模型3組和模型5組大鼠的進(jìn)食量明顯減少,其中,模型2組從造模第1周持續(xù)至第6周,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,模型3組大鼠在造模第1、3、4、5和6周差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,模型5組大鼠在造模第3、4和6周差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余模型組大鼠進(jìn)食量與正常組比較無(wú)明顯差異(表2)。

表2 各組大鼠進(jìn)食量

2.2 體質(zhì)量

造模前各組大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異。與正常組大鼠相比,造模1周后開始,持續(xù)至6周,模型3組大鼠體質(zhì)量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;其余各模型組大鼠體質(zhì)量與正常組大鼠比較無(wú)明顯差異(圖1)。

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.3 血清脂質(zhì)含量

與正常組大鼠相比,造模1周后至6周,各模型組大鼠的總膽固醇(TC)含量,與正常組相比都有所升高,但只有模型2和模型3組大鼠與正常組的差異一直有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2);造模1周后持續(xù)至6周,各模型組大鼠血清中的低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)含量與正常組相比均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖3);各模型組大鼠血清中的高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)含量與正常組相比均有所降低,其中模型4組和5組從造模1周后持續(xù)至6周,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4);與正常組相比,造模1周后持續(xù)至4周,模型1、2、3組和5組大鼠血清甘油三酯(TG)含量均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

注:與正常組比較,*P<0.001

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.4 肝指標(biāo)

與正常組大鼠相比,各模型組大鼠肝中的甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量明顯升高(圖6),肝重系數(shù)明顯增大(圖7),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)在解剖過(guò)程中可以觀察到,正常組大鼠肝呈表面暗紅,邊緣光滑銳利且彈性好,而各模型組大鼠的肝與正常組大鼠相比,均呈淡黃色,無(wú)光澤,體積均勻性增大,肝質(zhì)地較硬,邊緣鈍圓,彈性變差。

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.001

注:與正常組比較,*P<0.01,**P<0.001

3 討論

機(jī)體內(nèi)膽固醇的來(lái)源主要有兩條途徑,一是內(nèi)源性的生物合成,二是外源性的飲食攝入[7]。根據(jù)參考文獻(xiàn)[8-9]可知,由于膽固醇結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)其無(wú)法在細(xì)胞內(nèi)被分解,過(guò)量攝入容易造成機(jī)體內(nèi)膽固醇代謝紊亂,最終導(dǎo)致非酒精性脂肪肝、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等。在飼料中添加膽固醇增加了大鼠的外源性膽固醇的攝入,能夠?qū)е缕湓诩?xì)胞內(nèi)或是血管內(nèi)累積,從而形成高膽固醇血癥和脂肪肝。豬油是一種動(dòng)物脂肪,主要由飽和脂肪酸甘油酯與不飽和脂肪酸甘油脂組成。膽鹽是膽汁酸分別與鈉或鉀結(jié)合形成的鹽類,有著能使脂肪變成細(xì)小的脂肪微滴的生理功能,大大增加了脂肪與酶的接觸面積,促進(jìn)了脂肪的分解與吸收[10],因此在高脂飼料中添加膽鹽,來(lái)促進(jìn)大鼠對(duì)脂肪的消化和吸收。與正常組相比,模型2和3組的血清總膽固醇含量在造模1至6周持續(xù)保持升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而其他組別的血清中總膽固醇的含量在造模2周達(dá)到峰值后,造模4周和6周后與正常組比較均無(wú)明顯升高。比較各高脂飼料的配方可發(fā)現(xiàn),各配方中膽固醇的添加量都是1%,表明膽固醇不是造成各模型組大鼠血清總膽固醇含量有差異的原因。配方2和3高脂飼料跟其他配方高脂飼料的共同差異在于添加了20%果糖和10%豬油,由此我們分析造成模型2和3組大鼠血清總膽固醇含量明顯升高的原因是在添加1%膽固醇和0.3%膽鹽基礎(chǔ)上,20%果糖和10%豬油共同發(fā)揮了作用。

根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]的研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充果糖的大鼠會(huì)出現(xiàn)高甘油三酯血癥,骨骼肌和內(nèi)臟白色脂肪組織中的VLDL受體和脂蛋白脂肪酶表達(dá)降低。有研究[12]發(fā)現(xiàn)喂食高蔗糖(68%)和高果糖(60%)飲食的Wistar大鼠在3周和8周后TG水平分別增加了4倍。上述文獻(xiàn)表明,飲食中添加果糖和蔗糖都能夠成功建立大鼠高甘油三酯血癥模型,所以本實(shí)驗(yàn)我們?cè)诓煌M別中分別添加了果糖和蔗糖來(lái)進(jìn)行誘導(dǎo)造模。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)各模型組大鼠血清中TG含量一直沒(méi)有升高,反而呈下降趨勢(shì),與文獻(xiàn)報(bào)道并不一致。推測(cè)可能是因?yàn)楦咧暳险T導(dǎo),外源性脂肪和膽固醇的大量攝入,對(duì)大鼠內(nèi)源性甘油三酯合成形成了抑制,或同時(shí)抑制了甘油三酯從肝向血液的釋放[13]。且大鼠血漿TG清除率較高,不易建立穩(wěn)定的高TG模型[14]。

同時(shí),此次實(shí)驗(yàn)中,模型2組“20%果糖+10%豬油+1%膽固醇+0.3%膽鹽+5%酪蛋白+63.7%基礎(chǔ)飼料”、模型3組“20%果糖+10%豬油+1%膽固醇+0.3%膽鹽+68.7%基礎(chǔ)飼料”和模型5組“20%蔗糖+10%豬油+1%膽固醇+0.3%膽鹽+5%酪蛋白+68.7%基礎(chǔ)飼料”的大鼠進(jìn)食量低于正常組大鼠且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能是這三個(gè)配方飼料中都添加了10%豬油,飼料口感油膩,導(dǎo)致適口性下降,大鼠進(jìn)食量減少。

各模型組中只有模型3組大鼠體質(zhì)量與正常組大鼠比較有明顯下降,可能是因?yàn)榕浞?高脂飼料中未添加酪蛋白,而酪蛋白是動(dòng)物乳汁中含量最高的蛋白質(zhì),可為機(jī)體提供生命活動(dòng)和生長(zhǎng)所需要的必需氨基酸。有研究[15]表明,酪蛋白對(duì)于大鼠的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用,所以我們推測(cè)由于模型3組大鼠未添加酪蛋白,大鼠攝入的蛋白質(zhì)較低,可能影響到大鼠身體發(fā)育生長(zhǎng),從而導(dǎo)致配方3組體質(zhì)量增長(zhǎng)率低。

綜上所述,本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組大鼠相比,通過(guò)單純的高脂飼料誘導(dǎo),造模6周后,模型2和模型3組大鼠血清中總膽固醇(TC)含量顯著升高,各模型組大鼠血清中的低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)含量均顯著升高;且與正常組大鼠相比,各模型組大鼠肝中的甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量也顯著增加,表明配方2和配方3高脂飼料能夠成功建立穩(wěn)定的大鼠高膽固醇血癥模型。本研究為降脂藥物篩選和評(píng)價(jià)提供了一種操作簡(jiǎn)便、低成本、穩(wěn)定的動(dòng)物模型,特別是針對(duì)治療高膽固醇血癥的藥物。