董 浩 劉志國 李 楠 邢 進 許中衎 邢壯壯 馮育芳 馬麗穎

(中國食品藥品檢定研究院 國家嚙齒類實驗動物資源庫,北京 102629)

大腸埃希菌是兔腸道內(nèi)的常見菌,在正常情況下并不會引起動物的發(fā)病,但是在飼養(yǎng)管理不善或氣候環(huán)境突變等應(yīng)激因素的作用下,常會導(dǎo)致兔的腸道菌群紊亂,機體抵抗力降低而引發(fā)大腸埃希菌病。發(fā)病兔排出的大腸埃希菌污染了飼料、飲水和環(huán)境等,又經(jīng)消化道等途徑感染同群健康兔,嚴重時可以造成大批死亡。各種年齡和性別的兔均有易感性,尤其是仔兔和幼兔最易感,發(fā)病率、死亡率都較高。

目前,在臨床上兔大腸埃希菌病的報道較多,尤其是大腸埃希菌與球蟲共感染的情況比較常見[1-3],但是屏障設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)的SPF級實驗兔感染大腸埃希菌的報道卻并不多見。在前期研究中,對本單位屏障設(shè)施內(nèi)飼養(yǎng)的發(fā)生腹瀉的SPF級實驗兔進行剖檢,從病變臟器中分離到了一株大腸埃希菌[4]。鑒于大腸埃希菌是引起兔腹瀉的病原菌之一,因此對該細菌的生化特性、遺傳譜系、毒力基因、消毒液敏感性、抗生素敏感性、以及細菌攜帶的耐藥基因進行較為全面的研究,為屏障設(shè)施內(nèi)有效預(yù)防實驗兔的大腸埃希菌感染提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1試劑與耗材:新潔爾滅消毒液(山東安捷高科消毒科技有限公司),消毒液原液的苯扎溴銨含量為2.7%～3.3 %(W/V);健之素消毒泡騰片(北京長江脈醫(yī)藥科技有限責任公司),有效氯含量為(35±3.5)%;百毒殺消毒液(癸甲溴銨溶液)(上海派斯德生化有限公司),規(guī)格為100 mL:10 g;百勝-30(碘酸混合溶液3.0 %)由Evans生產(chǎn)廠生產(chǎn),成分為醇乙氧基化物20%～25%,硫酸5%～10%,磷酸5%～10%,碘1%～3%;75 %乙醇(北京鴻志偉達工貿(mào)有限公司)。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(Trypticase Soy Broth)、D/E中和肉湯培養(yǎng)基和吐溫80(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)。藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)。2×Taq PCR StarMix(北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司);DNA marker DL2000(大連寶生物公司)。大腸埃希菌耐藥基因和毒力基因的擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2菌株:大腸埃希菌(ILAREc-01)分離自中國食品藥品檢定研究院動物實驗室飼養(yǎng)的一只腹瀉的SPF級實驗兔。

1.1.3主要儀器:生物安全柜(Nuaire公司);恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司);全自動細菌鑒定儀(BD公司);Veriti 96孔PCR儀(Applied Biosystems公司);電泳儀和凝膠成像儀(伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1細菌的生化鑒定:將凍存的ILAREc-01菌株在TSA培養(yǎng)基上劃線復(fù)蘇,使用全自動細菌鑒定儀進行細菌各項生化指標的鑒定。

1.2.2細菌的遺傳譜系分析:根據(jù)文獻[5]報道的Clermont四重PCR方法對分離到的ILAREc-01菌株進行遺傳譜系分析。根據(jù)文獻[5]進行引物合成,以滅活的ILAREc-01菌液為模板,進行PCR擴增。PCR反應(yīng)程序為:預(yù)變性94 ℃ 4 min;變性94 ℃ 5 s, 退火59 ℃ 20 s, 延伸72 ℃ 30 s,30個循環(huán);延伸72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物使用1 %的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.3消毒劑敏感性分析

1.2.3.1消毒劑的配置:百毒殺消毒液:將百毒殺原液進行600倍稀釋;健之素消毒液:1片健之素泡騰片(250 mg)加入500 mL蒸餾水中混勻;新潔爾滅消毒液:按照使用說明將新潔爾滅消毒液原液與蒸餾水按照1∶4的比例混合;75%乙醇:直接使用產(chǎn)品原液;百盛-30消毒液:使用蒸餾水將百盛-30原液進行1 000倍稀釋。

1.2.3.2懸液定量殺菌實驗:參考《消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法》(GB/T 38502—2020),略有改動。取0.3 mL的大腸埃希菌ILAREc-01細菌懸液分別加入1.2 mL的百毒殺消毒液、健之素消毒液、新潔爾滅消毒液、75 %乙醇和百盛-30消毒液中,混勻后室溫孵育1.5、5 和10 min。隨后,分別取出0.5 mL的上述混合液加入4.5 mL D/E中和肉湯培養(yǎng)基,并進行充分混勻。室溫放置10 min后,進行細菌涂板,16～24 h培養(yǎng)后計數(shù)。上述實驗進行3次重復(fù)。

1.2.4藥物敏感性分析:參照衛(wèi)生行業(yè)標準《抗菌藥物敏感性試驗的技術(shù)要求》(WS/T 639—2018)的要求,將ILAREc-01菌液濃度調(diào)整至1×108CFU/mL,均勻涂布與MH固體培養(yǎng)基上,依次貼藥敏紙片,37 ℃培養(yǎng)18 h后測量抑菌環(huán)的直徑。結(jié)果判定按照杭州微生物試劑有限公司官網(wǎng)提供的藥敏實驗紙片法的抑菌范圍解釋標準執(zhí)行。

1.2.5耐藥基因和毒力基因的PCR檢測:根據(jù)相關(guān)參考文獻[6-7],分別合成了耐藥基因和毒力基因的擴增引物。其中,耐藥基因的檢測包括耐受氨基糖苷類抗生素基因aacC2、aph(3’)-Ia、aadA1和aadB;耐受β-內(nèi)酰胺類抗生素基因blaTEM、blaSHV和blaCTX-M;耐受四環(huán)素類抗生素基因tetA、tetB和tetC;耐受喹諾酮類抗生素基因qnrA、oqxAB、aac(6’)-Ib和gyrA;耐受磺胺類抗生素基因sul1、sul2和sul3。毒力基因包括產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌黏附素K88、K99、F41和987P基因,腸致病性大腸埃希菌的毒力基因eaeA和bfpA,腸出血性大腸埃希菌的特征性毒力因子基因stX1和stX2。PCR擴增體系為:模板2 μL,PCR mix 25 μL,上下游引物各0.5 μL,加入雙蒸水補齊50 μL體系。PCR反應(yīng)程序為:預(yù)變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s, 退火54 ℃ 30 s, 延伸72 ℃ 45 s,30個循環(huán);延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物使用1 %的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 分離細菌的生化鑒定

采用BD公司的全自動細菌鑒定儀進行大腸埃希菌ILAREc-01的生化特性鑒定,全自動細菌鑒定儀共進行了16 h的檢測,實驗結(jié)果如表1所示。

表1 大腸埃希菌ILAREc-01的生化鑒定結(jié)果

2.2 細菌的遺傳譜系分析

基于Clermont四重PCR方法對ILAREc-01菌株進行遺傳譜系分析,PCR擴增結(jié)果如圖1所示,未擴增出chuA和yjaA基因的目的條帶,而擴增獲得TspE4.C2和arpA基因相應(yīng)大小的PCR產(chǎn)物。上述結(jié)果表明,ILAREc-01屬于大腸埃希菌的B1型遺傳譜系。

注:M.DL2000 Marker;1.chuA基因的PCR擴增結(jié)果;2.yjaA 基因的PCR擴增結(jié)果;3.TspE4.C2基因的PCR擴增結(jié)果;4.arpA基因的PCR擴增結(jié)果

2.3 毒力基因的PCR擴增結(jié)果

對產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌黏附素K88、K99、F41和987P基因,腸致病性大腸埃希菌的毒力基因eaeA和bfpA,腸出血性大腸埃希菌的特征性毒力因子基因stX1和stX2進行PCR擴增的結(jié)果如圖2所示,在ILAREc-01菌株中只擴增到了eaeA基因,而其他毒力基因的擴增結(jié)果均為陰性。由于eaeA基因是腸致病性大腸埃希菌的標志性毒力基因,因此,ILAREc-01菌株是一株腸致病性大腸埃希菌。

注:M.DNA maker DL2000; 1～8.eaeA基因、bfpA基因、stX1基因、stX2基因、黏附素K88、K99、F41和987P基因的擴增結(jié)果

2.4 不同消毒液對大腸埃希菌的消毒效果

為了檢測不同消毒液對引起家兔腹瀉的大腸埃希菌的殺滅效果,將大腸埃希菌從單菌落接種至TSB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h后稀釋至1×109CFU/mL,測試5種消毒液在室溫下對大腸埃希菌的殺菌效果。5種消毒液在作用1.5、5 和10 min后,取200 μL涂板,經(jīng)過16～24 h培養(yǎng)后培養(yǎng)基上沒有任何菌落生長,此時細菌的濃度小于5 CFU/mL,這5種消毒液的殺滅效果均符合《消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法》(GB/T 38502—2020)的要求,說明5種消毒液對該大腸埃希菌的殺滅效果均比較理想。

2.5 藥物敏感性實驗結(jié)果

藥敏實驗的結(jié)果按照杭州微生物試劑有限公司官網(wǎng)提供的藥敏實驗紙片法的抑菌范圍解釋標準判定如下:ILAREc-01菌株對于青霉素、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾霉素、紅霉素、麥迪霉素、萬古霉素、復(fù)方新諾明等11種抗生素耐藥(R),對哌拉西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮、丁胺卡那、慶大霉素、氧氟沙星等9種抗生素敏感(S)(表2)。

表2 大腸埃希菌ILAREc-01的藥物敏感性實驗結(jié)果

2.6 耐藥基因的PCR擴增結(jié)果

對17種抗生素耐藥基因的PCR擴增結(jié)果如圖3所示,白色箭頭從左向右依次指示了ILAREc-01中耐受氨基糖苷類抗生素基因aadA1,耐受喹諾酮類抗生素基因gyrA,耐受磺胺類抗生素基因sul1和耐受四環(huán)素類抗生素基因tetA等4個耐藥基因的PCR陽性產(chǎn)物的電泳結(jié)果。第1泳道的aacC2基因的PCR擴增產(chǎn)物略大于目的片段(697 bp)長度,經(jīng)過測序分析為非特異性擴增產(chǎn)物。其他11個耐藥基因均未擴增出目的片段大小的產(chǎn)物。

注:1～17:aacC2、aph(3′)-Ia、aadA1、aadB、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、qnrA、oqxAB、acc(6)-Ib、gyrA、sul1、sul2、sul3、tetA、tetB、tetC基因的擴增結(jié)果; M:DL2000 Marker

3 討論

兔的大腸埃希菌病是危害家兔養(yǎng)殖業(yè)的主要傳染病之一[8],研究表明,在自然感染病例中該病的發(fā)病率為50%～68%,病死率可以達到50%～92.3%[9]。兔大腸桿菌病的主要臨床癥狀主要表現(xiàn)有腹瀉型、敗血型和混合型3種。病程短的在1～2 d內(nèi)死亡,長的經(jīng)7～8 d死亡。急性發(fā)病的病例突然死亡而不顯示任何癥狀?；疾⊥脮霈F(xiàn)精神沉郁、被毛粗亂、脫水、消瘦、腹脹、劇烈腹瀉、肛門和后肢被毛常沾有大量黏液或水樣糞便,有時會排除兩頭尖的干糞球,最終往往因衰竭而死亡[10]。在本研究中,SPF級實驗兔發(fā)病后也出現(xiàn)了精神沉郁、食欲和飲水明顯下降、脫水、消瘦和排出水樣糞便等臨床癥狀,未經(jīng)過及時治療的實驗兔發(fā)生腹瀉后72 h內(nèi)以死亡轉(zhuǎn)歸。經(jīng)過對腹瀉死亡實驗兔進行剖檢,從病變臟器中分離到了一株大腸埃希菌(ILAREc-01)。經(jīng)過大腸埃希菌毒力因子鑒定,發(fā)現(xiàn)ILAREc-01中含有eaeA基因,表明其屬于腸致病性大腸埃希菌,而這一類大腸埃希菌是引起兔大腸桿菌病的主要病原體。

在同一個環(huán)境內(nèi)長期使用一種消毒劑,會使細菌產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致消毒效果下降[11],在臨床養(yǎng)殖環(huán)節(jié)和食品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)都有耐受不同類型消毒劑的大腸埃希菌的相關(guān)報道[12-13]。為了測定ILAREc-01菌株是否對設(shè)施中常用的幾種消毒劑具有耐受性,本實驗參考《消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法》(GB/T 38502—2020)進行了殺菌效果的測試,結(jié)果表明新潔爾滅、百毒殺、健之素泡騰片、百勝-30和75%乙醇均可以有效殺滅大腸埃希菌ILAREc-01。使用上述消毒劑加強設(shè)施環(huán)境的消毒,可以有效切斷ILAREc-01菌株的傳播,保護易感動物。

由于抗生素濫用,使得臨床上分離到的致病性大腸埃希菌常具有多重耐藥性。有研究[14]從肉雞舍中分離到的大腸埃希菌對林可霉素、青霉素、卡那霉素、磺胺異噁唑的耐藥性較高。有研究[15]對一株引起仔豬腹瀉的大腸埃希菌進行耐藥性分析,發(fā)現(xiàn)其對四環(huán)素和環(huán)丙沙星具有耐藥性。有研究[16]對某奶牛場引起犢牛腹瀉的大腸埃希菌進行研究發(fā)現(xiàn),其對阿莫西林、紅霉素、四環(huán)素、青霉素、利福平、林可霉素、頭孢噻呋具有耐藥性。在本研究中,通過藥敏實驗發(fā)現(xiàn),ILAREc-01菌株對9種抗生素敏感,對多達11種抗生素耐藥。

針對ILAREc-01菌株耐藥基因檢測結(jié)果表明,該菌株攜帶了耐受氨基糖苷類抗生素基因aadA1,耐受四環(huán)素類抗生素基因tetA,耐受喹諾酮類抗生素基因gyrA和耐受磺胺類抗生素基因sul1,上述結(jié)果與該菌株對于部分四環(huán)素類抗生素(四環(huán)素、多西環(huán)素和米諾環(huán)素)和磺胺類抗生素(復(fù)方新諾明)耐藥存在一定關(guān)聯(lián)。有研究[17]對28株河南省分離的兔源大腸埃希菌氨基糖苷類、四環(huán)素類和磺胺類耐藥基因檢測結(jié)果也發(fā)現(xiàn),tetA基因的陽性率為85.71%,sul1基因的檢出率為100%。有研究[8]對兔源大腸埃希菌、喹諾酮藥物耐藥性及質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因進行了檢測,發(fā)現(xiàn)acc(6)-Ib基因檢出率最高為80.4%,qnrD、qnrS、oqxA和oqxB檢出率分別為59.8%、59.8%、63.9%和51.5%,未檢出qnrA、qnrB、qnrC、qnrVC和qepA,但是該研究未進行喹諾酮類抗生素耐藥基因gyrA的檢測。有研究[18]對15株水貂源致病性大腸埃希菌的喹諾酮類藥物耐藥基因檢測表明,耐藥基因gyrA、gyrB、qnrA和pare檢出率高達為100%。有研究[19]對216株禽致病性大腸埃希菌的氨基糖苷類耐藥基因的分子流行病學檢測表明,aadA1基因的陽性率高達49.1%。由此可見,在本研究中ILAREc-01菌株檢測出的4個耐藥基因,在臨床上分離的致病性大腸埃希菌中分布也是十分普遍的。

考慮到本研究中分離的大腸埃希菌為一株B1型遺傳譜系的腸致病性大腸埃希菌且具有多重耐藥性,因此進行了菌株的初步溯源分析。使用PCR方法對18份采自SPF兔生產(chǎn)群的新鮮糞便樣品進行了eaeA基因檢測,結(jié)果均為陰性(該數(shù)據(jù)未展示)。由此分析該腸致病性大腸埃希菌并非來自SPF兔的生產(chǎn)群,而有可能是由實驗人員或其攜帶物品帶入動物實驗室屏障設(shè)施。