賀艷紅，艾仁達(dá)，黃鎮(zhèn)楊，張 洋，劉小龍，袁智勇

（1.西南林業(yè)大學(xué)，云南省高校極小種群野生動物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明，650224；2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715）

Quasipaa delacouri（Angel，1928）隸屬兩棲綱（Amphibia）無尾目（Anura）叉舌蛙科（Dicroglossidae）棘胸蛙屬（Quasipaa）［1］。該物種于1928年由Angel［2］首次報道和描述，模式產(chǎn)地為越南北干?。˙ac Kan Province，Vietnam）。目前僅分布在越南北部（老街省、北干省、山羅省、永福省、河江省、和平省、義安省、清化省、承天順化省和峴港市）及鄰近的老撾等地區(qū)，在中國境內(nèi)未發(fā)現(xiàn)分布［1］。2022 年7 月，在對中國云南省文山麻栗坡老山省級自然保護(hù)區(qū)的調(diào)查中，于保護(hù)區(qū)內(nèi)兩處地點(diǎn)共采集到4 號棘胸蛙屬物種標(biāo)本，標(biāo)本現(xiàn)保存于西南大學(xué)淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。采集到的棘胸蛙屬物種標(biāo)本經(jīng)外部形態(tài)特征對比及分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，鑒定為Q.delacouri，是中國兩棲動物分布新紀(jì)錄。本研究描述了采集地生境、物種形態(tài)特征、分子數(shù)據(jù)及系統(tǒng)發(fā)育分析，為該物種的后續(xù)深入研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與形態(tài)學(xué)測量

2022年7月3日，在中國云南省文山麻栗坡老山省級自然保護(hù)區(qū)內(nèi)兩處地點(diǎn)（22°50′21.41″ N，104°40′36.16″ E，海 拔1 100 m；22°50′15.90″ N，104°43′10.91″ E，海拔1 405 m）共采集到4號棘胸蛙屬物種標(biāo)本（標(biāo)本號：SWU 0002320、SWU 0002321、SWU 0002322、SWU 0002323）。取肝臟、大腿肌肉和少許腳趾樣品儲存于95%乙醇中，-24 ℃保存，用于后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。整體標(biāo)本固定于75%乙醇溶液中。

參考Pham 等［3］的測量方法，用電子數(shù)顯卡尺測量標(biāo)本的外部形態(tài)（測量精度為0.1 mm）。測量參數(shù)主要包括頭體長（snout-vent length，SVL）、頭長（head length，HL）、頭寬（head width，HW）、吻 長（snout length，SL）、眼間距（interorbital space，IOS）、鼻眼距（nostril-eye length，NEL）、鼻間距（internasal space，INS）、眼徑（diameter of eye，ED）、上眼瞼寬（width of upper eyelid，UEW）、鼓膜徑（diameter of tympanum，TD）、前臂及手長（length of lower arm and hand，LAHL）、脛長（tibia length，TIB）、足長（foot length，F(xiàn)T）、后肢全長（hind limb length，HLL）、指長（finger length，F(xiàn)L）及趾長（toe length，TL）。同時基于Angel 對Q.delacouri的形態(tài)描述［2］與本例標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)比較。

1.2 分子實(shí)驗(yàn)與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

采用Thermo Fisher Scientific 公司提供的DNA提取試劑盒對新采集的4 號標(biāo)本的肌肉組織進(jìn)行全基因組DNA 提取，DNA 樣品-24 ℃保存。使用PCR對線粒體細(xì)胞色素b（Cyt b）基因片段擴(kuò)增，引物 為Cytbyf1（5′-TTTCCGTAGACAACGCCACCCT-3′）和Cytbyf3（5′-CTAGGTTTTGATGAGGC-3′）［4］。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)熱5 min；94 ℃變性45 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后由北京擎科生物科技有限公司對擴(kuò)增產(chǎn)物 雙向測序。使用LaserGene 7.0 軟件包中的SeqMan對所得序列質(zhì)量檢測和人工校對，生成一致序列［5］。

根據(jù)Yan 等［6］對棘胸蛙屬系統(tǒng)發(fā)育的研究結(jié)果，選取虎紋蛙［Hoplobatrachus chinensis（Osbeck，1765）］作為外群，并從GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中下載該屬其他類群物種序列，共27 條（表1）。使用MEGA 7.0 對每個線粒體Cyt b序列進(jìn)行比對和編輯［7］?；谧畲笏迫环ǎ∕L）和貝葉斯法（BI）重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。由于線粒體Cyt b基因?yàn)榫幋a基因，在此基礎(chǔ)上，使用DAMBE 軟件篩選密碼子［8］，并使用jModelTest 2 中的AIC 標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算序列的最佳進(jìn)化模型［9］。第一位密碼子和第二位密碼子的最佳模型為TPM+G，第三位密碼子的最佳模型為TrN+G。使用RAxML 8.2.4［10］構(gòu)建最大似然樹，基于默認(rèn)參數(shù)，自展1 000 次估算節(jié)點(diǎn)支持率。使用MrBayes 3.1.2［11］進(jìn)行貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育分析。根據(jù)計(jì)算的最佳模型，在默認(rèn)熱值下使用馬爾可夫鏈蒙特卡洛鏈（MCMC）執(zhí)行獨(dú)立運(yùn)算4次，每1 000代抽樣1 次，執(zhí)行500 萬代，散頻率平均標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.01 達(dá)到穩(wěn)定?；谑諗壳闆r，拋棄前25%的樹。使用來自MrBayes 的分裂頻率平均標(biāo)準(zhǔn)差（ASDSF）和潛在尺度縮減因子（PSRF）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)評估拓?fù)涫諗啃院头种чL度收斂性。然后使用Tracer v.1.5［12］檢查各運(yùn)行參數(shù)值是否收斂（ESS 值＞200）。最后使用MEGA 7.0［7］中的p-distance 雙參數(shù)模型計(jì)算棘胸蛙屬物種間的遺傳距離。

表1 樣品分子分析信息Tab.1 Sample information used for the molecular analysis

2 結(jié)果

2.1 生境

云南省文山麻栗坡老山省級自然保護(hù)區(qū)屬南亞熱帶高原季風(fēng)氣候［13］，本次采集到的標(biāo)本發(fā)現(xiàn)于海拔1 100～1 500 m 的山澗溪流中，水流急，兩側(cè)植被豐富，主要以灌木、草本植物和季風(fēng)常綠闊葉林為主。在采集地附近還發(fā)現(xiàn)了河口湍蛙（Amolops shihaitaoi）、沙巴臭蛙（Odorrana chapaensis）、長吻臭蛙（O.nasica）和大角蟾（Xenophrys major）。

2.2 形態(tài)特征

標(biāo)本各部位數(shù)據(jù)見表2。共采集到4 號棘胸蛙屬標(biāo)本，其中2 號為雄性成體標(biāo)本（SWU 0002320，SWU 0002321），2 號為亞成體（SWU 0002322，SWU 0002323），未采集到雌性標(biāo)本。新采集到的標(biāo)本體型較大，成體雄性頭體長為76.2～77.3 mm。頭寬大于頭長；吻端鈍圓，突出于下唇；吻長小于眼徑；鼓膜小，不明顯。指端略膨大，指關(guān)節(jié)下瘤大，指式為Ⅲ＞Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅱ。后肢長，左右跟部重疊。趾端膨大呈圓形吸盤，趾間全蹼，趾關(guān)節(jié)下瘤大，趾式為Ⅳ＞Ⅲ≈Ⅴ＞Ⅱ＞Ⅰ。

表2 麻栗坡老山省級自然保護(hù)區(qū)采集的棘胸蛙屬標(biāo)本形態(tài)量度Tab.2 Morphological measurement of Quasipaa specimens collected in Malipo Laoshan Provincial Nature Reserve mm

背部皮膚光滑，整體呈黑褐色，無明顯褶皺。背上部分布有圓條狀黑色斑紋；背下部、肛周圍及兩股均分布有小疣粒，肛部及周圍分布有黑色角質(zhì)刺。體側(cè)部有5或6個較大的白色圓疣。咽喉部有淺棕色斑（圖1）。

圖1 德氏棘蛙形態(tài)（麻栗坡老山省級自然保護(hù)區(qū)，SWU 0002321，雄性）Fig.1 Morphology of Quasipaa delacouri（Malipo Laoshan Provincial Nature Reserve，SWU 0002321，male）

2.3 分子數(shù)據(jù)及系統(tǒng)發(fā)育分析

研究新獲得4 條長度為433 bp 的線粒體Cyt b序列（GenBank 序列號為OR042806，OR042807，OR042808，OR042809）（表1），結(jié)合從GenBank 下載的23 條數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)142 個簡約信息位點(diǎn)和165 個變異位點(diǎn)。基于ML 和BI 法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這里僅展示貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹。在文山麻栗坡老山省級自然保護(hù)區(qū)內(nèi)采集到的4 號棘胸蛙屬物種標(biāo)本與越南承天順化?。═hua Thien Hue，Vietnam）和越南峴港市（Danang，Vietnam）的Q.delacouri標(biāo)本聚為一支（圖2）。使用p-distance 雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離結(jié)果顯示，新采集的4 號標(biāo)本與Q.delacouri的遺傳距離為6.5%。

圖2 基于線粒體Cyt b基因構(gòu)建的棘胸蛙屬貝葉斯樹Fig.2 Bayesian inference tree of Quasipaa derived from Cyt b sequences

3 討論

本次新采集到的4 號棘胸蛙屬物種標(biāo)本形態(tài)學(xué)鑒定特征與越南北干?。˙ac Kan Province，Vietnam，模式產(chǎn)地）的Q.delacouri的鑒定特征基本符合。頭寬大于頭長；鼓膜小，不明顯；指端略膨大，指關(guān)節(jié)下瘤大；第一指略長于第二指；后肢長，左右跟部重疊；趾端膨大，趾間全蹼，趾關(guān)節(jié)下瘤較大。背部呈黑棕色，皮膚光滑，無明顯褶皺；肛部及周圍有黑色角質(zhì)刺。與模式標(biāo)本（頭體長120 mm）相比，新采集的成體雄性標(biāo)本整體形態(tài)?。^體長76.2～77.3 mm），吻長（9.5～9.7 mm）略小于眼徑（11.1～11.2 mm），而模式標(biāo)本的吻長（17 mm）略長于眼徑（12 mm）［2］。由于描述的模式標(biāo)本并未記錄性別［2］，無法判斷該形態(tài)差異是否因雌雄性別差異所致，且本次未采集到雌性標(biāo)本，不能進(jìn)一步比較判斷這些差異是種群間的還是雌雄間的。同時系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果也支持新采集到的標(biāo)本為Q.delacouri，4 號標(biāo)本都與Q.delacouri標(biāo)本聚為一支（圖2）?；谝陨辖Y(jié)果，認(rèn)為新采集到的4 號標(biāo)本為Q.delacouri，依據(jù)其英文別名Tonkin Spiny Frog（Tonkin 為越南北干省曾用名）［14］，將該物種的中文名定為“德氏棘蛙”。

Quasipaa delacour最早被發(fā)現(xiàn)于越南北部北干?。?］，之后在老撾和越南義安省、清化省及河江省 等地先后被報道過，但少有該物種的圖片記錄及 生境描述，尚不清楚該物種的具體繁殖時間［15-18］。Q.delacour于2022 年7 月在中國云南省文山麻栗 坡老山省級自然保護(hù)區(qū)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，該保護(hù)區(qū)與相鄰的越南北部地區(qū)有著相似的物種組成，對動物地 理學(xué)研究有重要意義，但在采樣過程中未觀察到O.delacour的抱對現(xiàn)象，加之考察時間較短，尚不清楚其是否進(jìn)入繁殖期，因此該物種的繁殖生活史需進(jìn)一步研究。

致謝：感謝文山麻栗坡老山自然保護(hù)區(qū)的工作人員對野外工作給予的幫助。