楊 波 ，屈元元 ，桓宗錦，趙 波，張松蘭，董 禮，李登翯，朗舜筠，羅 波，李德生，鐘 義，黃 炎

（1.中國大熊貓保護研究中心，大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學(xué)國家林業(yè)和草原局重點實驗室，邛崍山、岷山瀕危野生動植物保護生物學(xué)國家長期科研基地，成都，610081；2.成都動物園（成都市野生動物研究所），成都，610081；3.中國野生動物保護協(xié)會，北京，100010）

黃頰長臂猿（Nomascus gabriellae）被IUCN 列為瀕危（EN）物種，分布于越南南部、老撾南部、柬埔寨東部的熱帶、亞熱帶常綠闊葉林區(qū)域［1-2］。我國曾引入人工飼養(yǎng)，截至2016 年底圈養(yǎng)種群數(shù)量為89 只［3］。圈養(yǎng)野生動物由于受到生存空間限制、人為干擾（展覽、施工、科研）和單一飼養(yǎng)模式等因素的長期影響，正常行為的表達受到干擾而易產(chǎn)生刻板行為，進而導(dǎo)致繁殖率和動物福利降低［4-5］。皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）屬于一種糖皮質(zhì)激素，參與糖類、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，也常用來專指“應(yīng)激激素”。皮質(zhì)醇逐漸成為衡量機體產(chǎn)生應(yīng)激效應(yīng)的指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用于野生動物生存壓力分析與環(huán)境豐容評估［6-7］。目前非人靈長類動物皮質(zhì)醇研究主要集中在恒河猴（Macaca mulatta）［8］、黑猩猩（Pan troglodytes）［9］、滇金絲猴（Rhinopithecus bieti）［10］、黃山短尾猴（Macaca thibetana）［11］和川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）［7，12］等，黃頰長臂猿皮質(zhì)醇代謝的相關(guān)研究未見報道。本研究通過追蹤測定1 對圈養(yǎng)黃頰長臂猿的糞便皮質(zhì)醇水平，分析皮質(zhì)醇代謝與游客干擾、季節(jié)和動物發(fā)情等因素的關(guān)系，以期為黃頰長臂猿圈養(yǎng)種群飼養(yǎng)與繁育管理提供一定的參考。

1 研究對象與飼養(yǎng)環(huán)境

試驗對象來源于成都動物園（1 雄1 雌），雄性呼名為“Pete”，雌性呼名為“Vivi”，基本信息見表1。每日08：00和15：00投食，食物主要為香蕉、蘋果、梨和葡萄等水果以及長臂猿窩窩頭、雞蛋和小葉女貞（Ligustrum quihoui）葉（自由采食）等。試驗期間，研究對象采食良好，身體健康。

表1 試驗對象基本信息Tab.1 Basic information of experimental subjects

飼養(yǎng)環(huán)境由室內(nèi)展廳和室外展廳組成。內(nèi)展廳呈五邊形，兩面玻璃、兩面水泥，另有一面為鐵門，面積約40 m2，高約5 m。廳內(nèi)設(shè)有供暖系統(tǒng)（冬季控溫10～15 ℃），還有平臺、繩梯和棲架等；室外展廳為不規(guī)則多邊形，兩面為玻璃，頂部為鐵絲網(wǎng)，其余面為水泥，總面積約60 m2，高約6 m。廳內(nèi)有繩梯、平臺、棲架和輪胎等，還種植有小葉女貞、南天竹（Nandina domestica）和花葉艷山姜（Alpinia zerumbet‘Variegata’）等。

2 研究方法

2.1 樣品采集與處理

2016 年4 月—2017 年4 月，每日08：00—11：30收集糞便樣品，每1～3 d 采樣1 次。共收集雌性糞樣199 份，雄性糞樣166 份。利用一次性PE 手套采樣后裝入自封袋，并記錄供者名稱與采樣時間，1 h 內(nèi)置于-20 ℃凍存。采用凍干研篩法預(yù)處理糞樣（凍干機型號為Telstar LyoQuest-55），糞便粉末置于-75 ℃凍存。

2.2 激素提取與測定

激素提取與測定參考唐丹等［13］的方法，利用90%乙醇溶液萃取糞便激素，并采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定糞便提取液中皮質(zhì)醇和雌激素（estrone-3-glucuronide，E1G）水平。

2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

ELISA精確度：批內(nèi)變異系數(shù)（Cv）≤5%，批間變異系數(shù)（Cv）≤10%。利用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)處理與分析，采用one sample Kolmogorov-Smirnov test進行正態(tài)分布檢驗。均不符合正態(tài)分布，故采用非參數(shù)檢驗（nonparametric tests Mann-WhitneyU）進行差異性分析。皮質(zhì)醇與雌激素的相關(guān)性利用Pearson法分析（雙尾檢驗）。統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，顯著性水平設(shè)α=0.05，極顯著性水平設(shè)α=0.01。

3 結(jié)果

3.1 假期對皮質(zhì)醇的影響

統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)（圖1），雌性Vivi在節(jié)假日（包括國家法定節(jié)假日和公休日）糞便皮質(zhì)醇為（146.9±118.1）ng/g（n=64），非節(jié)假日皮質(zhì)醇為（127.0±123.3）ng/g（n=135），兩者無顯著差異性（Z=-1.872，p=0.061）；雄性Pete 在節(jié)假日皮質(zhì)醇為（89.9±75.7）ng/g（n=54），非節(jié)假日皮質(zhì)醇為（117.1±111.6）ng/g（n=112），兩者也無顯著差異性（Z=-1.903，p=0.057）。雖然雌雄之間皮質(zhì)醇在非節(jié)假日無明顯差異（Z=-1.031，p=0.302），但在節(jié)假日存在顯著的性別差異，雌性皮質(zhì)醇水平明顯高于雄性（Z=-3.749，p＜0.001）。

圖1 假期與個體皮質(zhì)醇水平的關(guān)系Fig.1 The relationship between vacation and individual cortisol levels

3.2 皮質(zhì)醇的季節(jié)性變化

按氣象劃分法對季節(jié)進行劃分，春季為3—5月，夏季為6—8 月，秋季9—11 月，冬季12—2 月，黃頰長臂猿皮質(zhì)醇代謝隨季節(jié)變化情況如圖2 所示。雌性冬季皮質(zhì)醇水平［（219.4±140.4）ng/g，n=31］明顯高于春季［（117.9±82.6）ng/g，n=60，Z=-3.637，p＜0.001］、夏季［（92.5±48.1）ng/g，n=54，Z=-4.655，p＜0.001］、秋季［（103.8±53.9）ng/g，n=48，Z=-4.230，p＜0.001］，其他季節(jié)間無顯著差異（Z≥-1.351，p≥0.177）；雄性冬季皮質(zhì)醇［（196.4±194.2）ng/g，n=30］明顯高于春季［（85.7±62.2）ng/g，n=45，Z=-2.796，p=0.005］、夏季［（84.8±28.7）ng/g，n=42，Z=-2.557，p=0.011］、秋季［（88.6±69.3）ng/g，n=55，Z=-2.773，p=0.006］，其他季節(jié)間無顯著差異（Z≥-1.818，p≥0.069）；此外，處于同一季節(jié)皮質(zhì)醇水平存在性別差異，春季和秋季雌性皮質(zhì)醇要明顯高于雄性（Z=-2.273、-2.718，p=0.023、0.007），而夏季和冬季兩者間無顯著差異（Z=-0.262、-1.196，p=0.793、0.232）。

圖2 皮質(zhì)醇的季節(jié)性變化Fig.2 Seasonal variations in cortisol of two individuals

3.3 皮質(zhì)醇與發(fā)情的關(guān)系

分析發(fā)情期（以Vivi 雌激素E1G 作為發(fā)情程度指標(biāo)）2 只黃頰長臂猿皮質(zhì)醇水平變化（圖3），共發(fā)現(xiàn)8 個完整的發(fā)情期。雌性皮質(zhì)醇隨時間變化趨勢與雌激素相似，兩者呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（r=0.790，p=0.011）；而雄性皮質(zhì)醇與雌性雌激素間不存在相關(guān)性（r=0.027，p=0.944）。

圖3 發(fā)情期雌性與雄性的皮質(zhì)醇變化Fig.3 Cortisol changes in two individuals during estrus

4 討論

在野生動物遷地保護中，圈養(yǎng)動物的福利一直是熱點研究話題，為此“環(huán)境豐容”這一概念得以提出，并且從1982 年開始至今一直被應(yīng)用于野生動物飼養(yǎng)管理中［14］，如玩具豐容和食物豐容可以有效地增加圈養(yǎng)北白頰長臂猿（Nomascus leucogenys）的日常行為表達包括采食行為與探索行為，并顯著減少對游客的注意力以及減少刻板行為的發(fā)生［15-17］。環(huán)境豐容還可以顯著減少長期單籠飼養(yǎng)食蟹猴（Ma-caca fascicularis）的異常行為發(fā)生［18］，此外還被應(yīng)用于其他靈長類動物如川金絲猴［7］、黑猩猩［9］和北豚尾猴（Macaca leonina）［19］等種類，成效顯著。本研究發(fā)現(xiàn)黃頰長臂猿在節(jié)假日的皮質(zhì)醇水平與非節(jié)假日并未呈現(xiàn)出顯著性差異，一定程度上反映出游客干擾（投喂、喊叫、挑逗等）并未對其產(chǎn)生較大的應(yīng)激影響。究其原因，可能是2 只黃頰長臂猿長期處于動物園展區(qū)環(huán)境（至少有8 年的經(jīng)歷），已經(jīng)對游客干擾產(chǎn)生了一定適應(yīng)，在其他動物中也發(fā)現(xiàn)了類似的適應(yīng)特性［20］。但有研究發(fā)現(xiàn)，長期處于圈養(yǎng)狀態(tài)下的大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）卻并未產(chǎn)生這種適應(yīng)，仍對游客產(chǎn)生一定的應(yīng)激性［21］。李金燕等［22］也報道了在生態(tài)旅游開展中游客噪聲會對滇金絲猴產(chǎn)生一定的干擾。這種種間差異反映出動物對應(yīng)激源的認(rèn)知受生活經(jīng)歷、遺傳和行為等因素影響［23］。某些物種在長期處于某種特定環(huán)境下可能會對某一個或多個干擾因子產(chǎn)生適應(yīng)，進而不會將這些外來刺激當(dāng)作應(yīng)激源。

黃頰長臂猿皮質(zhì)醇代謝受季節(jié)影響，冬季皮質(zhì)醇水平明顯高于其他季節(jié)（圖2）。一般認(rèn)為，皮質(zhì)激素分泌的季節(jié)性模式與代謝有關(guān)，這種模式被歸因于冬眠期間儲存的脂肪和蛋白質(zhì)分解代謝的需求，如美國黑熊（Ursus americanus）在冬季和春季皮質(zhì)醇水平要明顯高于夏季水平［24］；對于不具有冬眠特征的物種如大熊貓也發(fā)現(xiàn)了相同的模式，被認(rèn)為可能是光周期觸發(fā)每年一次季節(jié)性繁殖模式，行為或生殖需求促進機體維持較高的皮質(zhì)醇水平［24-25］；小型動物還發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)和內(nèi)分泌因素均導(dǎo)致免疫功能發(fā)生季節(jié)性改變，冬季皮質(zhì)醇分泌與免疫功能增強有關(guān)［26］。皮質(zhì)醇季節(jié)性變化與動物的能量代謝、免疫、繁育、遺傳和光周期等諸多因素相關(guān)，各因素間又受協(xié)同作用的影響，因此本研究就該問題很難進行深入考究?？紤]到雌性與雄性未有繁育史，由此作簡單推測，黃頰長臂猿季節(jié)性分泌模式可能與冬季的嚴(yán)寒使得機體分泌皮質(zhì)醇促進蛋白質(zhì)、脂肪分解以滿足自身能量需求和增強免疫能力有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在寒冷的秋冬季節(jié)，長臂猿通過減少活動量以及提高采食量、增加采食時間的方式來補充能量損失以減少寒冷帶來的刺激［27］。

本研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)情期的雌性黃頰長臂猿皮質(zhì)醇變化趨勢與雌激素保持高度一致（圖3），與大熊貓的研究結(jié)果［28］一致，表明了腎上腺活動的變化很可能反映了與生殖階段相關(guān)的能量需求和發(fā)情相關(guān)活動水平。不僅如此，在嚙齒類動物身上也發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇可以增強雌性激素啟動，并促性腺激素分泌和排卵［29］。但雄性黃頰長臂猿并未表現(xiàn)出相似的情況，雄性與雌性未在皮質(zhì)醇水平上表現(xiàn)出同步性。就此作簡單推斷，雄性在此期間或許并未表現(xiàn)出明顯的性行為（試驗人員與飼養(yǎng)人員也未曾發(fā)現(xiàn)），導(dǎo)致這種原因可能與雄性自身繁殖能力、外界干擾有關(guān)。Lukas 等［30］研究指出雄性白頰長臂猿對人類產(chǎn)生強烈的依戀性，進一步降低了性熟練程度，或許最終會導(dǎo)致雄性性行為發(fā)育不良以至于交配能力的喪失。本研究也發(fā)現(xiàn)雄性黃頰長臂猿與白頰長臂猿具有相似的情況，雄性更容易被游客吸引（未做詳細(xì)記錄），這在一定程度上也解釋了在節(jié)假日雄性皮質(zhì)醇顯著低于雌性的原因（圖1）。李宏兵等［31］研究發(fā)現(xiàn)處于相對安靜繁殖區(qū)的白頰長臂猿的社會性行為頻次明顯高于喧鬧的展出區(qū)。喧鬧的環(huán)境會制約性行為的表現(xiàn)，這或許也是原因之一。本研究鑒于樣本量偏少，存在一定的不確切性，需要今后深入研究，僅為未來相關(guān)研究提供參考。鑒于以上結(jié)論，建議為參與繁育計劃的黃頰長臂猿提供一個安靜、舒適的飼養(yǎng)環(huán)境，減少游客干擾；盡量提供多元化食物，將投喂方式由定時改為不定時，并在秋冬季節(jié)適當(dāng)提供一些高能量的食物；持續(xù)開展環(huán)境豐容以進一步提高動物福利。