唐業(yè)剛 王文秀 陳培林 郭云貴 陳玉峰

摘要 以猴頭菌株猴杰2號母種為材料，研究其液體菌種最佳發(fā)酵條件，為其大規(guī)模栽培生產(chǎn)提供參考。采用單因子試驗結(jié)合正交優(yōu)化試驗，以發(fā)酵所得菌絲球平均干重為衡量指標，并對所有平行數(shù)據(jù)進行SPSS方差分析，研究猴杰2號菌株液體發(fā)酵的最佳碳源、氮源、無機鹽及生長因子營養(yǎng)組合，以及最佳初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝液量、搖瓶中玻璃珠數(shù)等搖床培養(yǎng)條件組合。結(jié)果表明，猴杰2號菌株液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組合為麥芽糖2%+蛋白胨0.3%+磷酸二氫鉀0.225%+硫酸鎂0.075%+維生素B1 20 mg/L，菌絲球平均干重可達8.33 g/L；最佳搖床培養(yǎng)條件組合為初始pH 5.0、轉(zhuǎn)速160 r/min、裝液量120 mL/250 mL、玻璃珠5顆/瓶，菌絲球平均干重可達8.50 g/L。

關(guān)鍵詞 猴杰2號；液體發(fā)酵；正交優(yōu)化；培養(yǎng)基組合；搖床培養(yǎng)條件

中圖分類號 S646.9? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）14-0043-05

基金項目 武漢生物工程學院2021年校級教學改革研究項目（2021J05）；2022年湖北省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（S202212362020X）。

作者簡介 唐業(yè)剛（1979—），男，湖北武漢人，副教授，碩士，從事食、藥用菌菌種的研發(fā)與應用。

收稿日期 2022-07-08

猴頭菌（Hericium erinaceus），又名刺猬菌、對臉蘑、山伏菌等，是著名的食、藥兼用珍稀食用菌［ 1］。其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，富含多種氨基酸和維生素［ 2-3］，素有“山珍猴頭、海味燕窩”之美稱。中醫(yī)認為猴頭性平味甘，利五臟，助消化，健脾胃，是著名的防治胃潰瘍、十二直腸炎等消化道黏膜損傷的滋補品［ 4］。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，猴頭中的多糖和多肽類物質(zhì)對小鼠肉瘤S-180和艾氏腹水瘤有明顯的抑制作用，經(jīng)常食用可提高人體免疫力［ 5-6］。目前，以猴頭菌片、猴頭餅干等為代表的猴頭食、藥系列產(chǎn)品的開發(fā)利用前景廣闊，以猴頭子實體或液體發(fā)酵產(chǎn)物中多糖、多肽等活性成分提取和純化等研究較多，利用成熟穩(wěn)定的猴頭液體發(fā)酵工藝進行大規(guī)模栽培生產(chǎn)，已成為目前猴頭菌市場開發(fā)的迫切需要。

使用猴頭固體菌種進行人工栽培，是目前國內(nèi)的主要栽培方式［ 7］。然而，固體菌種發(fā)菌時間長，菌絲產(chǎn)率低，菌齡不整齊，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)栽培的需要。液體菌種則具有發(fā)酵效率高、菌齡年輕且整齊一致的優(yōu)點，極其適合于大規(guī)模生產(chǎn)栽培的需要。

當前猴頭菇液體發(fā)酵的研究主要集中在發(fā)酵條件對其多糖、多肽等藥用活性成分的分離、提取及其藥理學研究上［ 6，8-9］，對其液體發(fā)酵的營養(yǎng)條件和搖床培養(yǎng)條件的報道則較少。且由于不同研究者使用的出發(fā)菌株不同、試驗條件亦不同等原因，目前關(guān)于猴頭菇液體發(fā)酵營養(yǎng)條件和搖床培養(yǎng)條件的研究結(jié)果［ 10-14］尚不一致。筆者在《食用菌栽培實驗》課程的教學過程中發(fā)現(xiàn)，華中農(nóng)業(yè)大學食用菌菌種保藏中心的猴杰2號菌株栽培性狀優(yōu)秀，出菇產(chǎn)量和質(zhì)量較好，有較大的大規(guī)模生產(chǎn)開發(fā)應用潛力。經(jīng)中國知網(wǎng)（CNKI）數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，目前尚未有對猴杰2號液體菌種發(fā)酵條件的相關(guān)報道。為此，筆者以猴杰2號菌株為對象，對其液體發(fā)酵的營養(yǎng)條件和搖床培養(yǎng)條件進行研究，以期為猴頭2號菌株液體菌種應用于大規(guī)模生產(chǎn)栽培以及其液體發(fā)酵產(chǎn)物中多糖、多肽等活性成分的提取、純化及其后續(xù)藥理學研究等開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要儀器設(shè)備

①供試猴頭母種。猴杰2號菌株，購自華中農(nóng)業(yè)大學食用菌菌種保藏中心。

②主要試劑。瓊脂粉、麥芽糖、VB1、可溶性淀粉、無水葡萄糖、蔗糖、硫酸鎂、乳糖、蛋白胨、酵母浸粉、尿素、硫酸銨、磷酸二氫鉀。③主要儀器設(shè)備。SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺、DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 、202-0B型干燥箱、P270A型普通搖床、手提式高壓滅菌鍋、PHS-3C型酸度計、電子天平、發(fā)酵用玻璃珠。

1.2 試驗方法

1.2.1 母種活化與擴繁。

將所購母種于25 ℃下暗培養(yǎng)3 d活化后，按1∶20于母種轉(zhuǎn)管培養(yǎng)基（PDA，5%檸檬酸調(diào)pH至6.0）［ 15］中轉(zhuǎn)管擴繁，每隔3 d觀察一次轉(zhuǎn)管結(jié)果，并挑選菌絲潔白、粗壯的滿管母種試管備用。

1.2.2 一級搖瓶種子的制備。

配制一級搖瓶液體種子培養(yǎng)基［ 12-14］：黃豆粉1%，蛋白胨0.1%，葡萄糖2%，KH2PO4 0.15%，MgSO4 0.075%，VB1 10 mg/L，pH 6.0，按120 mL/250 mL裝液量分裝于錐形瓶中。121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌30 min后，于超凈臺中將“1.2.1”所得母種，鉤取5塊盡量少帶瓊脂的菌絲塊，接入錐形瓶中。25 ℃暗光下靜置1 d后，暗光下于25 ℃、150 r/min搖床上發(fā)酵培養(yǎng)，6 d后觀察并記錄一級搖瓶種子培養(yǎng)結(jié)果，挑選發(fā)酵母液澄清、菌絲球直徑約2 mm且大小均勻的一級搖瓶種子備用。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源、氮源的單因子篩選。

以碳源（葡萄糖）3%＋氮源（酵母粉）0.2%＋KH2PO4 0.15%＋MgSO4 0.075%＋VB1 10 mg/L，pH 6.0為液體菌種的基本培養(yǎng)基，采用單因子試驗，篩選最佳碳源、氮源的種類。其中，供試碳源為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖。供試氮源為蛋白胨、酵母粉、尿素、（NH4）2SO4、麩皮（由于麩皮不溶于水，考慮到其有機氮的有效添加量，采用20 g/L濃度添加，具體方法為煮沸30 min后取濾液進行添加）。各試驗組均做5次平行重復，均采用120 mL/250 mL裝液量分裝，121 ℃高溫高壓滅菌30 min后備用。

取“1.2.2”所得一級液體搖瓶種子，按6％接種量分別接種到上述碳源、氮源培養(yǎng)基中，于25 ℃暗光下置于150 r/min搖床上培養(yǎng)。6 d后觀察搖瓶發(fā)酵結(jié)果，并用8層紗布過濾發(fā)酵液，所得菌絲球用蒸餾水反復沖洗后，于80 ℃烘箱中烘干2 d至恒重，稱重，計算各試驗組發(fā)酵所得的菌絲球平均干重（g/L）。

1.2.4 液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)基的正交優(yōu)化試驗。

為研究各營養(yǎng)因子的互作，以“1.2.3”所得最佳碳源（A）、最佳氮源（B）、磷酸二氫鉀（C）、維生素B1（D）為因子，按表1因素水平，進行L9（3）4正交優(yōu)化試驗設(shè)計，篩選最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

分別配制由表1所得的9種正交優(yōu)化培養(yǎng)基，均按120 mL/250 mL裝液量分裝，121 ℃高溫高壓滅菌30 min后，于超凈臺上分別按6%的接種量接入“1.2.2”所得一級搖瓶種子，于25 ℃暗光下，置于150 r/min搖床上搖瓶培養(yǎng)，6 d后結(jié)束發(fā)酵，并按“1.2.3”中的方法，記錄并測定各試驗組的菌絲球平均干重?? （g/L），上述9組培養(yǎng)基均做5次平行重復。

1.2.5 液體菌種搖床培養(yǎng)條件的單因子試驗。

以“1.2.4”所得最佳正交優(yōu)化培養(yǎng)基為配方，分別進行以下?lián)u床培養(yǎng)條件的單因子試驗。

（1）初始pH的篩選。分別調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH至4.0、5.0、6.0、7.0，每組pH均平行重復5次，均采用120 mL/250 mL裝液量分裝，121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌30 min后，均按“1.2.3”中的接種、培養(yǎng)和菌絲球平均干重測定方法，計算各組菌絲球平均干重（g/L）。

（2）搖瓶裝液量的篩選。分別在250 mL錐形瓶中分裝80、100、120、140 mL培養(yǎng)基，每組平行重復5次，各組初始pH均調(diào)至6.0，121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌30 min后，均按“1.2.3”中的接種、培養(yǎng)和菌絲球平均干重測定方法，分別按照不同裝液量換算，計算各組菌絲球平均干重（g/L）。

（3）搖床轉(zhuǎn)速的篩選。將培養(yǎng)基的初始pH均調(diào)至6.0，均采用120 mL/250 mL裝液量分裝，121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌30 min后，按“1.2.3”中的方法進行接種后，25 ℃暗光下，分別置于120、150、180、210 r/min搖床上發(fā)酵，每個梯度均平行重復5次，6? d后按“1.2.3”中的方法測定菌絲球平均干重（g/L）。

1.2.6 液體菌種搖床培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化試驗。

鑒于在搖瓶發(fā)酵液中添加玻璃珠有利于分散菌絲，造成更多萌發(fā)點［ 15］，同時結(jié)合“1.2.5”單因子試驗結(jié)果，以pH（A）、裝液量（B）、轉(zhuǎn)速（C）、搖瓶中的玻璃珠（直徑0.5 cm）顆數(shù)（D）為因子，按表2因素水平表，進行 L9（3）4正交優(yōu)化設(shè)計，考察各搖床培養(yǎng)條件之間的相互作用。上述9組試驗組均平行重復5次，篩選最佳搖床培養(yǎng)條件。

配制“1.2.4”中的優(yōu)化培養(yǎng)基，按由表2所得9組正交優(yōu)化試驗組合，分別調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH，并按不同裝液量分裝，121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌30 min后，分別按6%接種量接入“1.2.2”所得一級搖瓶種子，于25 ℃暗光下，置于不同轉(zhuǎn)速搖床上發(fā)酵培養(yǎng)，6 d后結(jié)束發(fā)酵，并按“1.2.3”中的方法，計算各組菌絲球平均干重（g/L）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗所得各平行數(shù)據(jù)，均采用SPSS 22.0軟件進行方差分析，判斷各試驗處理組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基碳源、氮源的篩選結(jié)果

由圖1可知，麥芽糖結(jié)果最優(yōu)，乳糖結(jié)果最差，但除乳糖外的其余4組碳源種類之間無顯著差異，這表明猴杰2號可以利用的碳源種類較多。從生產(chǎn)成本考慮，可選用價格相對低廉的可溶性淀粉作為碳源進行大規(guī)模發(fā)酵。

由圖2可知，蛋白胨和酵母粉的發(fā)酵結(jié)果均顯著高于其他組，且該2組之間無顯著差異，這表明猴杰2號可以高效利用動物源性和微生物源性有機氮。其余3組中，尿素組發(fā)酵結(jié)果顯著低于其他組，這可能與尿素在培養(yǎng)基滅菌中發(fā)生了分解有關(guān)［ 2］；硫酸銨組發(fā)酵結(jié)果也較差，僅顯著高于尿素，這表明猴杰2號難以利用無機氮。

麩皮組發(fā)酵結(jié)果顯著低于蛋白胨和酵母粉組，但又顯著高于無機氮組。這表明猴杰2號對植物源性有機氮的利用效果不及蛋白胨和酵母粉組。麩皮的發(fā)酵效果顯著高于無機氮組，一方面可能是猴杰2號菌株相較于無機氮，更偏好利用植物源性有機氮；另一方面，由于麩皮不能溶于水，需要在水中煮沸30 min后取其濾液添加到培養(yǎng)基中，考慮到其有效氮源添加量，對麩皮的添加量進行了放大處理。因此，也有可能是麩皮在試驗中的添加量（2%）高于尿素、硫酸銨（0.2%）所致，具體原因則有待于進一步研究。

綜上，分別選擇單因子試驗數(shù)據(jù)最高的麥芽糖和蛋白胨作為碳、氮源種類，參與后續(xù)的正交優(yōu)化試驗。

2.2 培養(yǎng)基的正交優(yōu)化試驗結(jié)果

由表3可知，3號試驗組（A1B3C3D3）的菌絲球平均干重最大，顯著高于其他組；由極差（R）值可知，各因子的主次優(yōu)先順序為B（蛋白胨）>D（維生素B1）>C（磷酸二氫鉀）> A（麥芽糖）；由k值可知，正交試驗的最優(yōu)結(jié)果為A3B3C3D3，這與3號試驗組（A1B3C3D3）的結(jié)果不一致，需進一步做二者對比的驗證試驗。

2.3 正交優(yōu)化試驗的驗證補充試驗

分別配制“2.2”中所得的需要進行驗證試驗的A1B3C3D3和A3B3C3D3這2種培養(yǎng)基（各5瓶），按“1.2.3”試驗方法，分別測定二者的菌絲球平均干重（g/L），并按“1.3”的方法，進行差異顯著性分析。

驗證試驗結(jié)果顯示，A1B3C3D3培養(yǎng)基的菌絲球平均干重為8.13 g/L，A3B3C3D3培養(yǎng)基所得菌絲球平均干重為7.85 g/L，進一步方差分析結(jié)果表明，A1B3C3D3顯著高于A3B3C3D3。

綜上，A1B3C3D3（麥芽糖2%+蛋白胨0.3%+磷酸二氫鉀0.225%+硫酸鎂0.075% +維生素B1 20 mg/L）為該試驗條件下的最佳培養(yǎng)基組合。

2.4 搖床培養(yǎng)條件的單因子試驗結(jié)果

由圖3可知，培養(yǎng)基初始pH為5.0時，發(fā)酵效果顯著高于其他組?？紤]到培養(yǎng)基滅菌后pH會下降約1.0，推測猴杰2號液體發(fā)酵的實際最適pH約為4.0。

由圖4可知，裝液量為120 mL/250 mL時，發(fā)酵效果顯著高于其他組。這表明猴杰2號液體發(fā)酵時的營養(yǎng)供應和150 r/min下的溶氧可達到最適平衡。

由圖5可知，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min時，發(fā)酵效果顯著高于其他組。120 r/min發(fā)酵效果顯著低于其他組，可能與低轉(zhuǎn)速下發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧不足以及低剪切力導致菌絲被切割后的萌發(fā)點過少有關(guān)；210 r/min的發(fā)酵效果顯著低于150、180r/min，這可能與高轉(zhuǎn)速下的較大剪切力使菌絲受到較大的損傷有關(guān)。180r/min顯著高于150r/min，這表明180 r/min時，搖瓶溶氧量及菌絲被切割時所受的損傷均優(yōu)于150 r/min組。

2.5 搖床培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化試驗結(jié)果

由表4可知，6號試驗組（A2B3C1D2）菌絲球平均干重最大，顯著高于其他組；由極差（R）可知，各因子的主次優(yōu)先順序為C（搖床轉(zhuǎn)速）>A（初始pH）>D（玻璃珠顆數(shù)）>B（裝液量），正交優(yōu)化的最優(yōu)結(jié)果為A2B3C1D2，與實際試驗中發(fā)酵效果最好的6號試驗組（A2B3C1D2）完全一致。

綜上，猴杰2號最佳搖床培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基初始pH 5.0、裝液量120 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速160 r/min、玻璃珠5顆/瓶，其菌絲球平均干重可達8.50 g/L。

3 討論

3.1 猴杰2號液體發(fā)酵營養(yǎng)條件組合篩選試驗

碳源種類單因子篩選試驗結(jié)果表明，猴杰2號對乳糖的利用效果較差，顯著低于其他碳源種類，這與黃蓓蓓［ 10］、劉靈霞［ 13］的研究結(jié)果相同，推測乳糖在代謝中可能生成了不利于猴杰2號生長代謝的物質(zhì)，具體原因則有待于進一步研究。此外，試驗還發(fā)現(xiàn)，可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖等不同種類的糖，猴杰2號均可較好利用，其中以麥芽糖的效果最好，但與其他糖類無顯著差異。

氮源種類單因子篩選試驗結(jié)果表明，猴杰2號對蛋白胨和酵母粉的利用效果較好，兩者的發(fā)酵結(jié)果均顯著高于10倍添加濃度下（考慮到麩皮的溶解性差，為求其有效氮源添加量，采用放大麩皮含量，將20 g/L的麩皮煮沸30 min后，取其濾液添加到發(fā)酵液中）的麩皮組。這表明猴杰2號對動物源性和微生物源性有機氮的利用效果，顯著優(yōu)于對植物源性的有機氮，這也與大多數(shù)學者的報道結(jié)果［ 12-13，15-16］相似。這表明猴杰2號對尿素和無機氮的利用效果較差，二者發(fā)酵效果均顯著低于其他氮源組，但硫酸銨發(fā)酵效果顯著高于尿素。這與劉靈霞［ 13］的尿素發(fā)酵效果優(yōu)于硫酸銨的結(jié)果不同。推測可能與試驗所用菌株不同以及試驗所用其他發(fā)酵條件不同等有較大關(guān)系，具體原因則有待于進一步研究。

3.2 猴杰2號液體發(fā)酵搖床培養(yǎng)條件組合篩選試驗

該研究搖床培養(yǎng)條件的單因子試驗結(jié)果表明，猴杰2號液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH在5.0時的發(fā)酵效果顯著高于4.0和6.0；且在后續(xù)的正交優(yōu)化試驗中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的最佳初始pH為5.5時，發(fā)酵效果最佳，這與黃蓓蓓［ 10］、劉靈霞［ 13］的研究結(jié)果相似。因培養(yǎng)基的pH在滅菌后會下降約1.0，初步推測猴杰2號作為嗜酸性食用菌菌株，其液體發(fā)酵所需最佳相對精準pH約為4.0。

該研究搖床培養(yǎng)條件的最佳裝液量、搖床轉(zhuǎn)速的單因子試驗結(jié)果分別為120 mL/250 mL、180 r/min，這與秦培鵬等［ 17］（100 mL/250 mL、140 r/min）、劉靈霞［ 13］（50 mL/250 mL）、劉偉民等［ 16］（137 r/min）等的報道結(jié)果不同，這可能與該試驗條件下?lián)u床的型號和性能以及試驗所用接種量等試驗條件不同等有較大關(guān)系。在后續(xù)的正交優(yōu)化試驗中則進一步發(fā)現(xiàn)，在該試驗搖床發(fā)酵條件下，猴杰2號相對精確的最佳裝液量和最佳搖床轉(zhuǎn)速分別為120 mL/250 mL、160 r/min。

基于通過在發(fā)酵液中添加玻璃珠，可有利于分散菌絲，造成更多萌發(fā)點，從而提高發(fā)酵產(chǎn)量的原因［ 15］，該研究采用在發(fā)酵液中添加0.5 cm直徑的玻璃珠，作為其中的一個因子參與正交優(yōu)化設(shè)計。結(jié)果表明，4個不同搖床培養(yǎng)條件因子中，搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵效果的影響最大，其次為培養(yǎng)基的初始pH和玻璃珠顆數(shù)，而裝液量的影響則最弱。優(yōu)化后的搖床發(fā)酵條件組合與實際進行試驗的9組組合中的最優(yōu)組合完全相同，均為A2B3C1D2（培養(yǎng)基初始pH 5.0、轉(zhuǎn)速160 r/min、裝液量120 mL/250 mL、玻璃珠5顆/瓶），這表明正交優(yōu)化設(shè)計非常成功。

4 結(jié)論

該試驗條件下，猴杰2號菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合為麥芽糖2%+蛋白胨0.3%+磷酸二氫鉀0.225%+硫酸鎂0.075%+維生素B1 20 mg/L；最佳搖床培養(yǎng)條件為初始pH 5.0、轉(zhuǎn)速160 r/min、裝液量120 mL/250 mL、玻璃珠5顆/瓶。

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