王璽惠 陳依 俞衛(wèi)鋒

凋亡是生物體內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行的自發(fā)、有序的死亡過程，它在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖周期中發(fā)揮重要作用[1]。細(xì)胞凋亡不僅存在于胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、組織再生、器官發(fā)生等各個(gè)生理階段，也發(fā)生于腫瘤、免疫缺陷、器官萎縮等病理過程中[2]。細(xì)胞凋亡伴隨著細(xì)胞核固縮、碎裂向細(xì)胞質(zhì)釋放，隨后形成含固縮核碎片的囊泡分泌到細(xì)胞外，同時(shí)凋亡細(xì)胞也會(huì)分泌一種僅包含細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)致密的圓形囊泡。它們被巨噬細(xì)胞或鄰近細(xì)胞吞噬或隨細(xì)胞外液向遠(yuǎn)處傳遞[3]。在隨后的研究中，人們發(fā)現(xiàn)這些囊泡可以作為凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的重要細(xì)胞通信載體，參與調(diào)節(jié)凋亡細(xì)胞對(duì)自身和周圍細(xì)胞的凋亡和再生過程，以及影響病理狀態(tài)下組織的炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)展[4]。細(xì)胞外囊泡是細(xì)胞分泌的各種球狀或杯狀的含有質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡，可分為外泌體、微囊泡和凋亡小體3 種類型[5]。凋亡胞外囊泡（apoptotic extracellular vesicles，Apo-EVs）是微囊泡的一種特殊亞型，與其他囊泡在形成、結(jié)構(gòu)和功能等方面均有差異。盡管Apo-EVs 在直徑上與外泌體有部分重疊，但它們的分泌方式并不相同，相比于外泌體需要通過內(nèi)吞體分選復(fù)合體機(jī)制和腔內(nèi)囊泡機(jī)制分泌到細(xì)胞外，Apo-EVs 可以直接從凋亡細(xì)胞的質(zhì)膜脫落產(chǎn)生[6]。此外，Apo-EVs 與凋亡小體均產(chǎn)生于凋亡細(xì)胞，但是凋亡小體的直徑通常＞1 μm，并且包含大量核糖體RNA，而Apo-EVs 直徑0.05～1 μm，主要包含非核糖體非編碼RNA 比如內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄因子RNA、非編碼RNA 以及Alu 重復(fù)序列等[7]。Apo-EVs作為凋亡細(xì)胞的特有產(chǎn)物，一方面攜帶與凋亡相關(guān)的標(biāo)志物，一方面攜帶供體細(xì)胞的蛋白、脂質(zhì)、核酸以及細(xì)胞器[8]。因此，Apo-EVs 既可以協(xié)助巨噬細(xì)胞清除凋亡產(chǎn)物[9]，也可以轉(zhuǎn)運(yùn)生物活性分子（如蛋白質(zhì)和核酸）或?qū)⒐w細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行傳遞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞間交流[10]，在凋亡細(xì)胞清除、細(xì)胞再生、免疫反應(yīng)調(diào)控、腫瘤生長調(diào)節(jié)等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。

1 Apo-EVs 的形成與分泌調(diào)節(jié)

1.1 Apo-EVs 的形成 細(xì)胞凋亡程序通過半胱氨酸蛋白酶（Caspase）激活啟動(dòng)[11]，當(dāng)細(xì)胞收到凋亡信號(hào)后，會(huì)發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化：細(xì)胞收縮、細(xì)胞核和染色質(zhì)凝結(jié)、細(xì)胞核和細(xì)胞器破裂、細(xì)胞膜脫落和囊泡形成[12]。凋亡囊泡的形成發(fā)生在細(xì)胞凋亡末期，分為3 個(gè)階段。第一階段：凋亡囊泡形成的啟動(dòng)階段，該階段涉及多個(gè)凋亡相關(guān)的信號(hào)通路的調(diào)控作用，具體機(jī)制尚不明確，已經(jīng)確定的有Caspase 介導(dǎo)的ROC 相關(guān)激酶-Ⅰ（Rho-associated kinase-Ⅰ，ROCK-Ⅰ）和p21活化蛋白激酶-2 裂解，激活下游效應(yīng)因子Rho 和Rac/Cdc42，參 與 囊 泡 的 形 成[13]。Caspase-3 通 過 切 割ROCK-Ⅰ，促使LIM 激酶1 磷酸化激活，進(jìn)而誘導(dǎo)絲切蛋白磷酸化，以調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白重組[13-14]。第二階段：囊泡形成階段，信號(hào)分子促使肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白系統(tǒng)產(chǎn)生收縮力，協(xié)助DNA 片段從核區(qū)域進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。伴隨細(xì)胞局部靜水壓力的改變，細(xì)胞膜局部膨大突起，細(xì)胞特異性細(xì)胞質(zhì)在質(zhì)膜上形成紡錘形結(jié)構(gòu)[15]。同時(shí)，功能微管促進(jìn)核收縮，使核內(nèi)或胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)入突起膜泡結(jié)構(gòu)成為核周多囊內(nèi)體[16]。第三階段：Apo-EVs 分泌階段，質(zhì)膜與肌動(dòng)蛋白皮質(zhì)分離并繼續(xù)擴(kuò)張，與此同時(shí)肌動(dòng)蛋白皮質(zhì)在質(zhì)膜下迅速重新組裝，阻止質(zhì)膜的持續(xù)膨脹。在這種擴(kuò)張和收縮的雙重調(diào)節(jié)下，細(xì)胞碎片被包裝成凋亡囊泡[17]。此外，凋亡囊泡的生物形成還伴隨著細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層磷脂酰絲氨酸的外翻并與Annexin V 結(jié)合[18]。因此，Apo-EVs 表面會(huì)特異性表達(dá)與凋亡相關(guān)的信號(hào)分子，如磷脂酰絲氨酸、Annexin V、Caspase 3、鈣網(wǎng)蛋白和核纖層蛋白B1[19]。

1.2 Apo-EVs 的分泌調(diào)節(jié) Apo-EVs 的分泌主要依賴于細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)信號(hào)或肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)抑制劑等。Caspase 抑制劑能夠抑制與凋亡發(fā)展相關(guān)的核變化，并且不增加細(xì)胞膜的通透性，表明抑制Caspase 不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)向壞死，而是通過抑制凋亡的方式減少Apo-EVs 的產(chǎn)生[20]。ROCK-Ⅰ通過激活肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白收縮來驅(qū)動(dòng)Apo-EVs 形成，因此，使用ROCK 抑制劑可以通過抑制該過程，進(jìn)而抑制Apo-EVs 形成。此外，肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑和非肌肉肌球蛋白Ⅱ抑制劑作為干擾肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白收縮的藥物，也能抑制Apo-EVs 分泌。

2 Apo-EVs 的生物學(xué)功能

2.1 招募巨噬細(xì)胞和清除凋亡細(xì)胞及產(chǎn)物 細(xì)胞在凋亡過程中會(huì)釋放可溶性的“find-me”信號(hào)，驅(qū)使巨噬細(xì)胞向凋亡細(xì)胞遷移，同時(shí)也會(huì)釋放“eat-me”信號(hào)，促使巨噬細(xì)胞吞噬分解產(chǎn)物[21]。Apo-EVs 作為凋亡細(xì)胞釋放的囊泡，會(huì)攜帶部分“find-me”和“eat-me ”信號(hào)，協(xié)助凋亡細(xì)胞清除、減輕炎癥反應(yīng)以及維持穩(wěn)態(tài)[22]。據(jù)報(bào)道，飽和脂肪酸刺激的脂肪細(xì)胞會(huì)釋放Apo-EVs，它們刺激并趨化單核細(xì)胞和原代巨噬細(xì)胞，促使肥胖相關(guān)的巨噬細(xì)胞大量浸潤，這提示了Apo-EVs 可攜帶“find-me”信號(hào)在趨化巨噬細(xì)胞中起作用[23]。1-棕櫚酰-2-亞油酰-3-乙酰甘油（1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol，PLAG）作為中性粒細(xì)胞分泌的Apo-EVs 所攜帶的“find-me”信號(hào)，促使巨噬細(xì)胞中P2Y2 受體從脂筏（一種富含膽固醇和鞘磷脂并與膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)分選密切相關(guān)的微結(jié)構(gòu)域）轉(zhuǎn)向非脂筏質(zhì)膜域，激活巨噬細(xì)胞向中性粒細(xì)胞遷移，進(jìn)而清除凋亡的中性粒細(xì)胞，減弱過度激活的免疫反應(yīng)以及繼發(fā)的慢性炎癥[24]。此外黏附分子、乳脂球表皮生長因子等也被證實(shí)是Apo-EVs 攜帶的“find-me”信號(hào)之一[25-26]。

Apo-EVs 也攜帶有“eat-me”信號(hào)的載體，促使凋亡細(xì)胞被清除。2 型糖尿病患者的間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌Apo-EVs，可攜帶鈣網(wǎng)蛋白作為一種重要的“eatme”信號(hào)，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)吞Apo-EVs，促使巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上轉(zhuǎn)化為2 型糖尿病肝臟中的抗炎表型。最終可減緩包括葡萄糖不耐受和胰島素抵抗在內(nèi)的2 型糖尿病表型的疾病進(jìn)展[27]。

2.2 促進(jìn)組織再生 組織再生常伴隨著細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。其中，凋亡在組織形態(tài)重塑中起到至關(guān)重要的作用[28]。凋亡細(xì)胞如干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、前體細(xì)胞、成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生的胞外囊泡可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)生物活性分子，或者通過調(diào)節(jié)增殖相關(guān)信號(hào)通路的方式促進(jìn)皮膚、骨骼、肌肉組織再生[29]。Ma 等[19]研究表明，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在皮膚和毛發(fā)發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，而皮膚和毛囊的間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的Apo-EVs 可以激活Wnt/β-catenin 通路，促進(jìn)皮膚和毛囊代謝，加速傷口愈合和毛發(fā)生長。乳牙牙髓干細(xì)胞中的Apo-EVs 攜帶線粒體Tu 翻譯延伸因子，被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化后上調(diào)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的能力，促進(jìn)牙髓血管重建和組織再生[30]。在病理情況下，Apo-EVs 也有促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)的作用。凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞釋放富含腫瘤易感基因101 和翻譯控制腫瘤蛋白的Apo-EVs，它們?cè)谘芷交〖?xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶依賴的抗凋亡作用，并促進(jìn)血管修復(fù)[31]。宮頸癌細(xì)胞系Hela 細(xì)胞，釋放富含CT10 相關(guān)激酶Ⅰ的Apo-EVs，并將其傳遞給鄰近細(xì)胞，通過激活c-Jun 氨基末端激酶的方式發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用[32]。總之，凋亡細(xì)胞分泌的Apo-EVs不僅有助于組織的生長和修復(fù)，還會(huì)影響腫瘤的生長。

2.3 調(diào)控炎癥反應(yīng) 死亡細(xì)胞或損傷組織介導(dǎo)的損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）可以刺激周圍的細(xì)胞或組織誘發(fā)非感染性炎癥（即無菌性炎癥）。過去人們認(rèn)為DAMPs 是細(xì)胞壞死導(dǎo)致的，然而最新的研究發(fā)現(xiàn)，在特定條件下，尤其是當(dāng)組織發(fā)生大量繼發(fā)性凋亡或免疫原性細(xì)胞死亡時(shí)，凋亡細(xì)胞也會(huì)誘導(dǎo)炎癥或免疫原性反應(yīng)[33]，并且這種作用與凋亡細(xì)胞釋放的Apo-EVs 有關(guān)[10]。

Apo-EVs 攜帶凋亡細(xì)胞的抗原，如自身免疫抗原、病原體抗原、腫瘤相關(guān)抗原，將其傳遞給免疫細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。由于Apo-EVs 高表達(dá)磷脂酰絲氨酸，所以其可以更高效地被遞呈細(xì)胞吞噬[34]。在自身免疫性疾病中，Apo-EVs 通過微管結(jié)構(gòu)和肌球蛋白輕鏈激酶的作用，負(fù)載來自供體細(xì)胞的自身免疫病相關(guān)抗原[16]。通過這種方式，Apo-EVs 使自身抗體在體內(nèi)積累，導(dǎo)致免疫耐受功能失調(diào)，炎癥反應(yīng)加重。比如，干燥綜合征患者分泌的Apo-EVs，攜帶抗α-胞襯蛋白抗體、抗SS-A 抗體以及自身抗原h(huán)y1-RNA，并將其轉(zhuǎn)移給樹突狀細(xì)胞，進(jìn)而影響參與非特異性免疫的Toll 樣受體-7/9的表達(dá)和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[35]。

感染細(xì)胞釋放的Apo-EVs 通過將感染因子抗原傳遞給抗原遞呈細(xì)胞，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。比如，結(jié)核分枝桿菌使CD1 陰性的巨噬細(xì)胞失去抗原遞呈能力并且誘導(dǎo)其凋亡，這些凋亡的巨噬細(xì)胞會(huì)釋放包含病原體抗原的Apo-EVs，并將其傳遞給未感染的樹突狀細(xì)胞以及活化的CD8 T 細(xì)胞，兩者作為抗原遞呈細(xì)胞，激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[36]。在病毒感染時(shí)，Apo-EVs 攜帶感染性病毒，并轉(zhuǎn)移給鄰近細(xì)胞，從而加快病毒的繁殖并保護(hù)其免受免疫系統(tǒng)攻擊或者導(dǎo)致免疫反應(yīng)異常并產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)?；卓涎挪《靖腥镜腍ela 細(xì)胞凋亡并分泌攜帶病毒抗原的Apo-EVs，感染鄰近巨噬細(xì)胞，抑制其發(fā)揮炎癥保護(hù)作用，這提示了攜帶病原體抗原的Apo-EVs 不僅可以促使免疫細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，也能促使機(jī)體對(duì)病原體形成免疫耐受[37]。

Apo-EVs 會(huì)觸發(fā)抗移植物抗體產(chǎn)生，加速排斥反應(yīng)。例如，凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生Apo-EVs，通過攜帶20S 蛋白酶體誘導(dǎo)抗移植抗體的產(chǎn)生，增強(qiáng)了主要組織相容性復(fù)合體形成，并促進(jìn)主動(dòng)脈移植小鼠中抗移植抗體的產(chǎn)生和同種異體移植炎癥的形成[38]。

Apo-EVs 也可以通過攜帶免疫調(diào)節(jié)因子，直接作用于炎癥細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的不同過程。比如，微血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的Apo-EVs 通過激活內(nèi)皮細(xì)胞NFκB 相關(guān)通路，促使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)與細(xì)胞死亡、炎癥、分化和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的基因，從而產(chǎn)生抑制凋亡，改善傷口閉合，降低血管生成活性以及減少與內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的內(nèi)皮標(biāo)志物表達(dá)的作用[39]。凋亡細(xì)胞釋放的Apo-EVs 通過攜帶的DNA 等與人漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞上Toll 樣受體9 結(jié)合，促使其分泌干擾素-α，最終調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[40]。另有研究發(fā)現(xiàn)多核中性粒細(xì)胞釋放的Apo-EVs 協(xié)同TNF-α 參與促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化和炎癥反應(yīng)發(fā)生[41]。與之相反的是，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的Apo-EVs 通過AMPK/SIRTI/NF-κB 通路抑制促炎巨噬細(xì)胞極化以及TNF-α 分泌，抑制鄰近破骨細(xì)胞的形成[42]。間充質(zhì)干細(xì)胞來源的Apo-EVs 被巨噬細(xì)胞吞噬清除，隨后在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞重編程，調(diào)控肝巨噬細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗炎癥表型轉(zhuǎn)化，從而延緩2 型糖尿病發(fā)展[27]。Hela 細(xì)胞釋放的Apo-EVs 攜帶鞘氨醇-1-磷酸受體1 和3 與巨噬細(xì)胞接觸后，誘導(dǎo)IL-1β分泌，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生[10]。

2.4 影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展 在腫瘤組織中，Apo-EVs攜帶供體細(xì)胞內(nèi)容物或表面標(biāo)志物，通過胞吞的方式將特異的信號(hào)傳遞給受體細(xì)胞，發(fā)揮調(diào)控腫瘤生長的作用。Apo-EVs 可以通過直接調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖或凋亡，或者間接地通過調(diào)節(jié)腫瘤間質(zhì)細(xì)胞或免疫細(xì)胞，改變腫瘤生長微環(huán)境的方式，影響腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。

Apo-EVs 直接作用于鄰近的腫瘤細(xì)胞，改變受體細(xì)胞增殖能力。膠質(zhì)母細(xì)胞分泌的Apo-EVs 富含各種剪接體成分RNA 結(jié)合基序蛋白11，它們具有改變受體細(xì)胞中的RNA 剪接的作用。因此，Apo-EVs 通過改變受體細(xì)胞RNA 剪接，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其耐藥性[43]。

通過調(diào)節(jié)腫瘤生長微環(huán)境的方式，間接調(diào)節(jié)腫瘤生長也是Apo-EVs 的作用方式之一。上皮性卵巢癌細(xì)胞分泌的Apo-EVs 含有豐富的CD147，可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶形成，分解細(xì)胞外基質(zhì)，最終產(chǎn)生促進(jìn)血管生成，加速惡性腫瘤發(fā)展的作用[44]。在實(shí)體瘤和白血病分泌的Apo-EVs 中含有凝血調(diào)節(jié)劑——組織因子，導(dǎo)致血液抗凝能力降低，促使血液形成高凝狀態(tài)，增加癌栓形成和腫瘤定植風(fēng)險(xiǎn)[45]。同樣，黑色素瘤產(chǎn)生的Apo-EVs 也被證明有外源性促凝作用，其形成凝血酶原復(fù)合物會(huì)激活早期階段的凝血反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤形成癌栓[34]。

Apo-EVs 對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用，也是影響腫瘤生長的重要因素。淋巴瘤細(xì)胞衍生的Apo-EVs 攜帶了腫瘤相關(guān)抗原，并被脾臟CD169+巨噬細(xì)胞亞群捕獲，抑制樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的體內(nèi)細(xì)胞毒性反應(yīng)，最終建立免疫耐受[46]。Apo-EVs 也可以通過促進(jìn)異位生發(fā)中心形成，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用。實(shí)體腫瘤患者在內(nèi)皮細(xì)胞的血管損傷后，會(huì)產(chǎn)生攜帶活性20S 蛋白酶體的Apo-EVs，其將信號(hào)傳遞給γδT 細(xì)胞，促使γδT 細(xì)胞遷移到損傷部位并產(chǎn)生有助于損傷部位三級(jí)淋巴樣結(jié)構(gòu)形成和成熟的細(xì)胞因子IL-17，使局部產(chǎn)生活躍的免疫反應(yīng)，加強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的清除能力[47]。

3 小結(jié)和展望

細(xì)胞凋亡是組織生長以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要程序。Apo-EVs 形成作為細(xì)胞凋亡的環(huán)節(jié)之一，Apo-EVs 攜帶DNA、RNA 和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，并且含有特異性蛋白標(biāo)志物的膜結(jié)構(gòu)，可將特異性的內(nèi)容物運(yùn)送至靶器官或靶細(xì)胞，在組織發(fā)育和再生、炎癥和腫瘤等疾病中發(fā)揮重要作用。與細(xì)胞直接釋放細(xì)胞因子和生長因子到組織間隙相比，Apo-EVs 傳遞的信號(hào)減少了“信號(hào)稀釋效應(yīng)”，使生物活性分子可以更高效地作用于鄰近的細(xì)胞或遠(yuǎn)處的組織。然而，對(duì)于Apo-EVs 的作用方式及細(xì)胞間通訊的機(jī)制仍未完全明確。關(guān)于Apo-EVs 的研究存在一些挑戰(zhàn)，首先，凋亡細(xì)胞釋放的Apo-EVs 與正常細(xì)胞釋放的外泌體在技術(shù)層面上很難區(qū)分。其次，由于Apo-EVs 共同表達(dá)與凋亡相關(guān)的標(biāo)志蛋白，并且可能不攜帶供體細(xì)胞特有的標(biāo)記蛋白，因此很難區(qū)分體液中Apo-EVs 的來源。此外，由于壞死細(xì)胞也會(huì)釋放一些囊泡，因此很難辨別囊泡來源于凋亡細(xì)胞還是壞死細(xì)胞。綜上所述，關(guān)于Apo-EVs 的形成和作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步探索，Apo-EVs 向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化任重而道遠(yuǎn)。