李章春 孫海波 楊政敏 黨榮敏 李 珀

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,2 公共課教學(xué)部,3 藥學(xué)系,貴州省都勻市 558000;4 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科,貴州省貴陽市 550004)

慢性前列腺炎是男科的常見疾病,全球有3%～16%的成年男性受其困擾[1],我國慢性前列腺炎的發(fā)病率高達17.2%～24.6%[2],其中慢性非細菌性前列腺炎(chronic abacterial prostatitis,CAP)的占比達90%以上。CAP患者的主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)3個月以上的盆腔區(qū)域疼痛,并伴隨性生活和排尿功能改變,如勃起功能障礙、排尿異常等,常用的治療方法為口服非甾體抗炎藥、α1受體阻滯劑等,然而上述藥物存在視力改變、胃腸道癥狀等副作用,影響患者的療效及生活質(zhì)量[3]。近年來,隨著祖國醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,中醫(yī)藥以療效好、副作用少等優(yōu)勢逐漸應(yīng)用于CAP的治療[4-5]。五香血藤是我國貴州省民間的特色苗藥,具有抗腫瘤、抗氧化、活血消腫等功效,可用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打腫痛、無名腫毒等[6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),炎癥因子、氧化應(yīng)激反應(yīng)在CAP的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,并認為CAP的發(fā)生可能與機體自身免疫反應(yīng)有關(guān)[7]。因此,本研究探討苗藥五香血藤對CAP大鼠模型前列腺組織白細胞計數(shù)及卵磷脂小體密度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:60只雄性健康SD大鼠[長沙市天勤生物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK(湘)2019-0013],體質(zhì)量200～220 g。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,自由飲水、進食,保持12 h光暗循環(huán)。

1.1.2 主要藥物與儀器:前列舒通膠囊(保定天浩制藥有限公司,國藥準字Z20027140),25%消痔靈注射液(吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司,國藥準字Z22026175),光學(xué)顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司, 型號:BK500)。干五香血藤購自貴州省都勻市藥材市場,由黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系楊政敏博士進行鑒定、質(zhì)控和提取。取干五香血藤15 kg,粉碎后加入萃取釜(溫州中翔輕工機械廠,型號:WTD100)中,用80 L 80%乙醇萃取3次,制得浸膏1.2 kg,再經(jīng)0.5%羥甲基纖維素溶液超聲溶解,制成五香血藤醇提物。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型建立:按隨機數(shù)字表法將60只大鼠分為正常對照組、CAP模型對照組(模型組)、陽性藥物對照組(陽性藥物組)、五香血藤醇提物低劑量組(低劑量組)、五香血藤醇提物中劑量組(中劑量組)、五香血藤醇提物高劑量組(高劑量組),每組10只。參照文獻[8-9]的方法建立CAP大鼠模型:除正常對照組大鼠外,采用乙醚麻醉其余各組大鼠,將大鼠仰臥位固定于操作臺上,常規(guī)消毒、鋪巾,在大鼠下腹正中部位做2 cm縱向切口,進入腹腔后找到膀胱及兩側(cè)的前列腺,分別于兩側(cè)前列腺背葉注射0.1 mL 25%消痔靈注射液,然后逐層縫合。參照文獻[10]對CAP大鼠模型制備情況進行鑒定,本研究50只CAP大鼠模型均建模成功。

1.2.2 給藥方案:建模7 d后進行灌胃給藥。陽性藥物組灌胃20 mL/kg前列舒通膠囊水溶液[9],低劑量組、中劑量組、高劑量組分別灌胃63 mg/kg、126 mg/kg、252 mg/kg五香血藤醇提物,模型組和正常對照組灌胃20 mL/kg無菌生理鹽水。每組灌胃1次/d,連續(xù)灌胃28 d。

1.2.3 實驗取材:末次灌胃2 h后,將各組大鼠稱重,股動脈取血后處死大鼠,剝離兩側(cè)前列腺組織,將右側(cè)前列腺組織置于4%多聚甲醛中固定備用,左側(cè)前列腺組織用于前列腺組織白細胞數(shù)計數(shù)及卵磷脂小體密度實驗。

1.2.4 前列腺組織白細胞數(shù)計數(shù)及卵磷脂小體密度實驗:參照文獻[11]的方法,使用電子天平稱取每只大鼠左側(cè)前列腺組織0.15 g,加入4 μL/mg的無菌生理鹽水充分研磨至勻漿液,放入試管內(nèi)。另準備一支試管,加入0.38 mL白細胞稀釋液(上海博湖生物科技有限公司,批號:BH-S1062),用微量移液器準確吸取上述制備好的勻漿液,擦去吸頭外部的勻漿液,將吸頭插入稀釋液的底部,輕輕釋放勻漿液,然后將吸頭上移并吸取上層清液,漱洗吸管2次,用手搖動試管混合;充池,靜置2～3 min,待白細胞下沉;計算低倍鏡(南京尼康江南光學(xué)儀器有限公司,型號:E200MV)下計數(shù)池四角4個大方格內(nèi)的白細胞總數(shù)。白細胞數(shù)計數(shù)(個/mL)=4個大方格內(nèi)的白細胞總數(shù)/4×20×107。低倍鏡下選取一個最佳視野評估卵磷脂小體密度,卵磷脂小體密度依據(jù)臨床標準進行分級:1級為觀察到1/4視野的卵磷脂小體,2級為觀察到1/2視野的卵磷脂小體,3級為觀察到3/4視野的卵磷脂小體,4級為觀察到滿視野的卵磷脂小體。根據(jù)鏡下白細胞、卵磷脂小體形態(tài)不同對兩者進行區(qū)分,即白細胞體積大,可見細胞內(nèi)細胞核;卵磷脂小體為脂肪成分,折光性強,體積小,呈類圓形。

1.2.5 HE染色:取4%多聚甲醛固定的大鼠右側(cè)前列腺組織進行沖洗、酒精梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,將切片烤干后進行脫蠟處理,然后置入不同濃度的酒精中脫水3 min,使用蘇木精染色5 min后流水清洗3次,使用鹽酸酒精分化處理30 s,充分清洗之后使用0.5%伊紅液染色1～3 min,使用酒精脫水處理后進行脫蠟處理,使用中性樹膠封固。在光學(xué)顯微鏡(上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)用光學(xué)儀器廠,型號:XB-K-25)下觀察前列腺組織的病理學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;等級資料的比較采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠前列腺組織白細胞計數(shù)和卵磷脂小體密度的比較 與正常對照組比較,模型組、陽性藥物組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的前列腺組織白細胞計數(shù)均升高,卵磷脂小體密度均降低(均P<0.05);與模型組比較,陽性藥物組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的前列腺組織白細胞計數(shù)均降低,卵磷脂小體密度均升高,且陽性藥物組、高劑量組大鼠的前列腺組織白細胞計數(shù)均低于低劑量組與中劑量組,卵磷脂小體密度均高于低劑量組與中劑量組(均P<0.05);而陽性藥物組與高劑量組、低劑量組與中劑量組大鼠的前列腺組織白細胞計數(shù)和卵磷脂小體密度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠前列腺組織HE染色結(jié)果的比較 正常對照組大鼠的前列腺組織結(jié)構(gòu)未見異常;模型組大鼠的前列腺組織有明顯的慢性炎癥改變,有大量淋巴細胞等炎癥細胞浸潤,腺體上皮細胞及纖維組織增生;與模型組相比,陽性藥物組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的前列腺組織慢性炎癥病變均有不同程度改善,炎癥細胞浸潤范圍縮小,腺體上皮細胞及纖維組織增生程度減輕,以高劑量組及陽性藥物組的改善程度更為明顯。見圖1。

3 討 論

CAP的發(fā)病機制目前尚未完全明確,有研究表明,盆底肌收縮功能異常、相關(guān)肌群活動異常等因素可使尿道張力增大,尿液中的化學(xué)物質(zhì)、有害物質(zhì)等經(jīng)腺管口逆流侵襲前列腺,進而引發(fā)自身免疫性炎癥反應(yīng),導(dǎo)致CAP。此外,代謝異常、雄激素缺乏、心理問題等因素均會導(dǎo)致CAP的發(fā)生[12-13]。既往臨床上多采用口服抗生素、非甾體抗炎藥等治療CAP,但其副作用較大,且停藥后容易復(fù)發(fā)[14-15]。隨著對CAP治療藥物的不斷探索,中醫(yī)藥在CAP的治療方面展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢?！秶鴦?wù)院關(guān)于印發(fā)中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要(2016—2030年)的通知》[16]指出,要加強對慢性病、多發(fā)病、常見病中醫(yī)藥科學(xué)防治的研究,尋找新的中醫(yī)候選藥物,根據(jù)疾病的藥物靶標進行治療研究。這為CAP的藥物治療提供了新的研究方向。五香血藤為常綠木質(zhì)藤本植物,隸屬木蘭科五味子屬,為貴州省民間常用的民族草藥,具有抗氧化、保肝、解熱、抗?jié)兊人幚碜饔肹17]。研究表明,五香血藤提取物能夠降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清炎癥因子水平,并抑制人結(jié)腸癌細胞增殖[18-19]。

前列腺液由前列腺組織分泌,當(dāng)前列腺出現(xiàn)炎癥時,前列腺液的成分也發(fā)生相應(yīng)改變。正常情況下,前列腺液涂片鏡檢的白細胞數(shù)量較少,卵磷脂小體呈均勻分布;當(dāng)前列腺組織受到感染或非感染因素刺激時,血液中的白細胞滲出并堆積在前列腺組織內(nèi),進而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生,而當(dāng)前列腺組織發(fā)生炎癥時,卵磷脂小體的分泌和合成均減少[20]。因此,前列腺組織中的白細胞計數(shù)和卵磷脂小體密度可以在一定程度上反映前列腺炎癥細胞的浸潤程度[21]。本研究結(jié)果顯示,與正常對照組比較,模型組大鼠前列腺組織的白細胞計數(shù)升高,卵磷脂小體密度降低(均P<0.05),提示CAP大鼠模型的前列腺組織存在炎癥病變;與模型組比較,陽性藥物組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的前列腺組織白細胞計數(shù)均降低,卵磷脂小體密度均升高,且陽性藥物組、高劑量組大鼠的前列腺組織白細胞計數(shù)均低于低劑量組與中劑量組,卵磷脂小體密度均高于低劑量組與中劑量組(均P<0.05);HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠的前列腺組織有明顯的慢性炎癥改變;與模型組相比,陽性藥物組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠前列腺組織的慢性炎癥病變均有不同程度改善,其中以高劑量組、陽性藥物組的改善程度更為明顯。這提示,五香血藤醇提物能減少CAP大鼠前列腺組織的白細胞數(shù)量,提高卵磷脂小體密度,對前列腺組織慢性炎癥病變起到明顯的緩解作用。三萜和木脂素是五香血藤的主要活性成分,三萜類化合物尤其是其主要成分環(huán)阿爾廷類三萜的藥理活性非常豐富,能夠發(fā)揮抗炎作用[22],而木脂素也具有抗病毒的作用[6],這可能是五香血藤醇提物緩解CAP大鼠模型前列腺組織慢性炎癥的機制之一。本研究中,相比于低劑量(63 mg/kg)與中劑量(126 mg/kg)五香血藤醇提物,高劑量(252 mg/kg)五香血藤醇提物對于CAP大鼠模型前列腺組織慢性炎癥病變的改善效果更佳,但是其具體機制、最佳劑量、最佳干預(yù)時間等仍需要進一步研究。

綜上所述,五香血藤醇提物能夠降低CAP大鼠模型前列腺組織的白細胞計數(shù),升高卵磷脂小體密度,改善前列腺組織的炎癥病變,以252 mg/kg五香血藤醇提物的干預(yù)效果更優(yōu)。由于CAP病因復(fù)雜,五香血藤醇提物對CAP的治療作用及其具體機制仍有待深入研究和探索。