甘 婷，李文文，李 男，鄧澤元，鄭溜豐

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室 南昌 330047）

慢性代謝性疾病嚴重危害現(xiàn)代人類健康，特別是肥胖和糖尿病的發(fā)病率急劇增加[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球有超過10 億人肥胖及5 億人患糖尿病。肥胖和胰島素作用異常與一系列健康問題相關，包括2 型糖尿病、脂肪肝、肝膽和膽囊疾病、心血管病理、神經(jīng)退行性疾病、哮喘和各種癌癥的風險也顯著增加[2]。雖然其發(fā)病機制復雜，但是炎癥被認為是包括肥胖和糖尿病在內的多種慢性代謝性疾病發(fā)生的典型特征之一[3]。通過靶向抑制炎癥，是緩解這些代謝性疾病發(fā)生、發(fā)展的有效解決方案[4-6]。除了NF-κB 這條經(jīng)典的炎癥信號通路之外[5]，最新的研究表明，表觀遺傳修飾與炎癥反應有關，其修飾的異常是多種慢性病發(fā)生的重要誘因[7]。

N6-甲基腺苷（m6A）是RNA 分子最常見和最豐富的表觀遺傳修飾。m6A 修飾受酶催化的動態(tài)調節(jié)，由甲基轉移酶復合物（包括WTAP、METTL3 和METTL14）催化生成，并可在去甲基化酶FTO 和ALKBH5 的作用下被“擦除”[8]。研究表明，m6A 可調節(jié)葡萄糖/脂質代謝和免疫/炎癥反應，其異常升高是肥胖、2 型糖尿病和心血管疾病等代謝性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要誘因[9]。為此，通過激活去甲基化酶活性來“擦除”m6A，降低其水平，可能是預防多種代謝性疾病的新策略[10]。與脂肪含量和肥胖相關的蛋白FTO 是關鍵的去甲基化酶，該酶功能的紊亂會導致肥胖及癌癥等多種疾病的發(fā)生，有望成為諸多慢性代謝性疾病預防的新靶點[11-17]。目前基于晶體結構的化合物設計等手段，合成了影響FTO 活性的小分子，如FB23-2[18-19]，而膳食中的活性成分是否會直接靶向FTO 發(fā)揮功能效應尚未見報道。

植物化學物對代謝性疾病的預防作用在細胞培養(yǎng)、動物活體及人體臨床試驗中得到很好的證實[20]。同時從植物化學物庫中也相繼鑒定出一些新的抗炎活性天然產(chǎn)物[21-22]。目前，以天然產(chǎn)物作為先導化合物的起點已成為現(xiàn)代醫(yī)學藥物開發(fā)的重要研究領域，在批準上市的藥物中有相當數(shù)量含有天然產(chǎn)物片段[23-24]。近年來，黃酮類化合物是被公認的具有有效生物活性的植物化合物，其功效包括抗氧化、抗炎、降膽固醇、降血壓等[25-28]。從膳食中鑒定出的具有抗炎功效的黃酮類化合物包括：姜黃素、高良姜素及漆黃素等[29-35]。然而，這些黃酮類化合物是否靶向FTO 并影響RNA m6A 甲基化修飾需要進一步研究。

本研究利用藥物親和反應目標熒光猝滅分析（MARFQ）、細胞熱位移（CETSA）、藥物親和反應靶向穩(wěn)定性分析（DARTS）等非標記的生物分子互作技術[36]，研究3 種常見的黃酮類化合物（姜黃素、高良姜素及漆黃素）與FTO 蛋白的相互作用，并采用計算機分子對接技術揭示其機理，明確其中的氨基酸結合位點。在體外低水平細胞炎癥模型下，探究這種相互作用對RNA m6A 甲基化修飾的影響，以期為黃酮類化合物預防代謝性疾病的作用靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高良姜素、漆黃素和姜黃素標準品（≥98%），北京索萊寶科技有限公司；FTO 蛋白，武漢三鷹生物技術有限公司；鏈霉蛋白酶E（7 000 U/g），北京索萊寶科技有限公司；人臍靜脈內皮細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司；炎癥細胞因子IL-17、腫瘤壞死因子TNFα，美國PeproTech 公司；BCA 試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；細胞總RNA 提取試劑盒、RT-PCR 試劑盒、qPCR 試劑盒，日本Takara 公司；FTO 抗體，上海艾博抗貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

JY-86-2-50 型-80 ℃冰 箱、Neofuge 15R 型臺式高速冷凍離心機，香港力康發(fā)展有限公司；Agilent 6430 QQQ 三重串聯(lián)四極桿質譜儀，安捷倫科技有限公司；AR1140 電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司；TC512 型梯度PCR 儀，英國TECHNE 公司；CFX96 Touch 型熒光定量PCR儀、DYCP-31DN 型電泳儀，美國伯樂公司；EXL800 全自動酶標儀，美國Biotek Instruments有限公司；F-4600 型熒光分光光度計，日立高新技術公司。

1.3 方法

1.3.1 藥物親和反應目標熒光猝滅分析 高良姜素、漆黃素和姜黃素用二甲亞砜（DMSO）配制成50 mmol/L 的儲備液，置于4 ℃冰箱密封、避光保存，在試驗過程中根據(jù)需求稀釋成相應濃度。FTO蛋白保存于-80 ℃冰箱內，試驗時用PBS 緩沖液將FTO 配成濃度為1.43×10-5mol/L 的溶液備用。所用緩沖溶液為含0.1%NaCl 的PBS 緩沖液（0.1 mol/L）。

向1 cm 的石英比色皿中依次加入300 μL 的PBS 緩沖溶液和20 μL 的FTO 蛋白稀釋液，加水至2 mL，再向溶液中依次等體積加20 μL 黃酮儲備液。掃描前均充分混合并在37 ℃恒溫水浴鍋中放置10 min，以保證體系反應達到平衡。激發(fā)波長為275 nm，掃描范圍為280～450 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm。

1.3.2 細胞熱位移分析 細胞接種在15 cm 直徑的大皿中，用50 μmol/L 的高良姜素、姜黃素和漆黃素分別處理12 h。用PBS 清洗2 次，再用消化液消化細胞（2 mL），倒掉消化液，加入10 mL 培養(yǎng)基將細胞吹下來，收集細胞，1 200 r/min 離心5 min，倒掉培養(yǎng)基，加入含有1%蛋白酶抑制劑的800 μL 的PBS 重懸細胞。將細胞等量分裝在200 μL PCR 管中，每管100 μL，然后在PCR 儀中以不同溫度（37，47，52，57，62，67，72，77 ℃）加熱5 min，室溫冷卻3 min。再將細胞裂解液轉移到1.5 mL EP 管中，在液氮和室溫反復凍融裂解細胞，每次10 min，12 000 r/min 離心15 min 提取蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白質濃度，然后用抗FTO 抗體進行免疫印跡。免疫印跡的條帶強度被量化并隨溫度繪制（每組初始值設為100%）。

1.3.3 藥物親和反應靶向穩(wěn)定性分析

1）細胞收集和裂解 將培養(yǎng)好的細胞用預冷PBS 清洗2～3 次，然后加入預冷的M-PER 裂解緩沖液，要盡量避免使用含有強變性劑的放射免疫沉淀試驗（Radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液。同時，反應中最好含有合適的蛋白酶抑制劑，防止細胞裂解液自身降解。用細胞刮鏟將細胞輕輕刮下，置于預冷的離心管內，上下顛倒幾次，混勻后于冰上靜置裂解10 min。

2）制備細胞裂解液 將預冷的細胞液于12 000 r/min，4 ℃高速離心15 min，將上清液轉移至新的離心管中，用BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度。然后用預冷的肌鈣蛋白C（Troponin C，TNC）緩沖液稀釋蛋白，調節(jié)質量濃度至約2 g/L。

3）化合物與裂解液孵育結合 每管200 μg蛋白，兩個對照管中加入等體積的TNC 緩沖液，藥品管中加入不同濃度的黃酮（50，200，500 μmol/L，TNC 緩沖液稀釋），混勻后于室溫孵育1 h。

4）蛋白酶解 預先配好蛋白酶儲存液（10 g/L），臨用前用TNC 緩沖液稀釋至適當濃度（根據(jù)蛋白酶與裂解液中總蛋白質的比例為1∶1 500 進行稀釋）。按比例加入蛋白酶，室溫孵育30 min（對照組不加蛋白酶）。30 min 后加入十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液終止反應，將反應管置于沸水中煮10 min 使蛋白變性。

5）結合蛋白的鑒定 需依據(jù)試驗要求采用Western Blot 蛋白質印跡等多種方法檢測并鑒定結合蛋白。GAPDH 作為陰性對照。

1.3.4 FTO 與黃酮的分子對接 從PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫中下載人源FTO 蛋白的三維結構，PDB ID為3LFM，去除蛋白模型中的固有小分子及水分，添加極性氫。高良姜素、漆黃素及姜黃素的結構則從小分子結構數(shù)據(jù)庫ChemSpider 中下載。采用分子對接軟件AutoDockTools 對FTO 與CLB 進行對接，使用Flexible Docking 模塊，計算結合的對接能及作用三維模型?；诖四Ｐ?，通過Protein-Ligand Interaction Profiler 工具描繪黃酮與FTO的作用方式及作用位點[37]。

1.3.5 細胞內m6A 水平分析 按照操作說明書介紹使用通用RNA 提取試劑盒從細胞中分離總RNA。用S1 核酸酶（2 U）在含有2.5 μL S1 核酸酶緩沖液（10×）的25 μL 反應體系中酶切5～10 μg mRNA，37 ℃反應2 h，然后加入4 μL 堿性磷酸酶緩沖液（10×）和堿性磷酸酶（0.5 U），37 ℃孵育2 h。最后將樣品稀釋至總體積為1 mL，0.22 μm 孔徑過膜。采用Agilent 6430 QQQ 三重串聯(lián)四極桿質譜儀檢測RNA 中m6A 的總量。根據(jù)測定濃度計算m6A 與腺嘌呤（Adenine，A）的比值。

色譜條件：液相色譜柱型號為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A 液為甲醇，B 液為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫條件為0～2.5 min，4%A；2.5～2.7 min，4%～31%A；2.7～6 min，31%A；6～6.2 min，31%～95%A；6.2～9.3 min，95%A；9.3～9.6 min，95%～4%A；9.6～14.5 min，4%A。流速0.4 mL/min，色譜柱溫度40℃，進樣量10 μL。

質譜鑒定：酶解后的RNA 片段經(jīng)色譜分離后用Agilent 6430 QQQ 三重串聯(lián)四極桿質譜儀進行質譜分析。檢測方式：正離子＋MRM 模式；離子源：電噴霧離子化源（ESI）。A 的定量條件為：母離子268.1 m/z，子離子136.1 m/z，裂解電壓30 V，碰撞能9 eV；進樣量10 μL。m6A 的定量條件為：母離子282.1 m/z，子離子150.1 m/z，裂解電壓70 V，碰撞能23 eV；進樣量10 μL。定量使用由純A和m6A 標準（A 為50～2 000 nmol/L，m6A 為0.1～10 nmol/L）生成的標準曲線，并在同一批樣品中進行3 次試驗。根據(jù)計算的濃度，確定m6A 與A 的比值。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計學處理結果以“”表示，組間比較采用獨立-T檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 藥物親和反應目標熒光猝滅分析

由于m6A 的豐度和FTO 與代謝疾病的高度相關性，推測FTO 是將黃酮類化合物與RNA 修飾聯(lián)系起來的一個強有力的靶點?？紤]到黃酮類化合物可能需要高結合能力來直接調控FTO 活性，首先通過黃酮類化合物親和響應目標熒光猝滅（MARFQ）分析評估了黃酮類化合物與FTO 蛋白的結合能力。MARTFQ 檢測是基于配體誘導的靶色氨酸含蛋白（如FTO）的內在熒光猝滅[36]，通過測定蛋白質以及反應體系的熒光強度，從而研究蛋白質構象、氨基酸微環(huán)境等的變化。以熒光峰的位置及其對應的波長作定性分析，以熒光強度與濃度的線性關系作定量分析。首先得到蛋白質的內源熒光光譜，在蛋白質溶液中依次加入一定體積的小分子，若此時得到的的熒光強度降低，說明小分子對蛋白質的熒光具有猝滅作用。如圖1a所示，黃酮類化合物以70∶1（黃酮類化合物∶FTO）的摩爾比猝滅FTO 的熒光，具有明顯的抑制FTO發(fā)射熒光的能力，且高良姜素的猝滅作用最強，其次是姜黃素。如圖1b～1d 所示，隨著黃酮類化合物濃度的升高，F(xiàn)TO 固有熒光強度降低，且最大熒光發(fā)射波長出現(xiàn)偏移，表明黃酮類化合物與FTO 發(fā)生了結合。這與前人報道的小分子與FTO 結合后改變了FTO 蛋白質殘基周圍的微環(huán)境結果一致[38-39]。

圖1 3 種黃酮類化合物對FTO 熒光光譜的影響（T=37 ℃，pH=7.4，λex=275 nm）Fig.1 Effect of three flavonoids on FTO fluorescence spectra（T=37 ℃，pH=7.4，λex=275 nm）

為了進一步估計黃酮類化合物與FTO 的結合常數(shù)（K 值），在一系列黃酮類化合物稀釋中進行了MARTFQ 測定，以構建修正的Stern Volmer曲線。如圖1e 和1f 所示，根據(jù)Stern Volmer 方程得出的K 值表明，高良姜素的K 值高于漆黃素和姜黃素，且這3 種黃酮類化合物的K 值高于已知的FTO 激動劑NADPH[36]。

2.2 藥物親和性響應目標穩(wěn)定性分析和細胞熱位移分析

為進一步評估黃酮類化合物結合FTO 的能力，進行了藥物親和性響應目標穩(wěn)定性（DARTS）試驗和細胞熱轉移試驗（CETSA）。DARTS 檢測是基于配體結合于靶蛋白后可提高其耐蛋白酶的水解能力[40]，是一種可以快速和直接識別小分子藥物潛在靶點蛋白的技術，即靶蛋白與藥物結合后，保護靶蛋白不被蛋白酶水解，進而維護靶蛋白的活性和功能。在高良姜素、漆黃素或姜黃素存在的情況下，用鏈酶蛋白酶E 體外消化細胞裂解物。如圖2a～2c 所示，高良姜素、漆黃素和姜黃素均能顯著降低FTO 的蛋白酶敏感性，說明3 種黃酮類化合物直接結合FTO，使FTO 的耐酶解性增加。然后進行CETSA 評估3 種黃酮類化合物結合細胞內FTO 的能力。CETSA 是基于配體結合于靶蛋白后可增強其熱穩(wěn)定性，是檢測小分子與蛋白質結合的新技術[41]。這項技術是根據(jù)熱展開蛋白在細胞中迅速沉淀后通過監(jiān)測熱變后剩余的可溶性蛋白來測量融化曲線的。這與使用純化蛋白的經(jīng)典熱轉移試驗類似，配體結合通常會導致蛋白穩(wěn)定和熔融溫度的正向轉移。免疫印跡的條帶強度被量化，并繪制出與溫度的關系圖。結果如圖3 所示，CETSA 也表明3 種黃酮類化合物顯著增強了FTO 的熱穩(wěn)定性，與MARFQ 和DARTS 的分析結果一致，進一步在體外及細胞水平證實了高良姜素、漆黃素和姜黃素與FTO 的直接結合。

圖2 3 種黃酮類化合物與FTO 結合的藥物親和性響應目標穩(wěn)定性分析Fig.2 Drug affinity response target stability analysis for the interactions of the three flavonoids with FTO

圖3 3 種黃酮類化合物與FTO 結合的細胞熱位移分析Fig.3 Cellular thermal shift assays for the interactions of the three flavonoids with FTO

2.3 計算機分子對接

蛋白質分子與藥物小分子主要通過疏水作用、靜電作用、氫鍵和范德華力等非共價作用相結合。蛋白質的結構比較復雜，在與藥物小分子作用過程中，易受體系中溶劑分子或其它共存離子的影響，因此其作用過程可能不是只存在一種作用力，而是幾種作用力共同作用。3 種黃酮類化合物的分子對接結果如表1 所示，3 種黃酮類化合物均與FTO 結合（對接能均小于-7 kcal/mol），且疏水性氨基酸殘基（Leu，Tyr，Met，Pro）與高良姜素、漆黃素和姜黃素接近，表明疏水相互作用是黃酮與FTO 結合的關鍵驅動力。圖4～6 分別顯示了高良姜素、漆黃素和姜黃素結合FTO 蛋白的位置以及與蛋白相關的氨基酸殘基。結果表明，3種黃酮類化合物均進入FTO 的催化活性空腔，而不是底物結合空腔。除疏水相互作用之外，3 種黃酮類化合物與部分殘基之間還存在氫鍵和π-陽離子作用，說明3 種黃酮類化合物與FTO 的相互作用力有多種類型，結合牢固。此外，黃酮類化合物與FTO 結合的關鍵氨基酸位點包括：Arg96、His231、His232、Asp233、His307、Arg322，而這些氨基酸殘基對于FTO 發(fā)揮去甲基化酶活性至關重要[42]。故黃酮類化合物與FTO 的結合很可能潛在影響其去甲基化酶活性，從而影響細胞內m6A 水平。

表1 3 種黃酮類化合物與FTO 蛋白的對接結果Table 1 The docking results of three flavonoids with FTO protein

圖4 高良姜素與FTO 蛋白相互作用的三維模型（a）及作用方式與位點（b）Fig.4 Three-dimensional model of interaction between galangin and FTO protein（a）and their interaction mode and site（b）

圖5 漆黃素與FTO 蛋白相互作用的三維模型（a）及作用方式與位點（b）Fig.5 Three-dimensional model of interaction between fisetin and FTO protein（a）and their interaction mode and site（b）

圖6 姜黃素與FTO 蛋白相互作用的三維模型（a）及作用方式與位點（b）Fig.6 Three-dimensional model of interaction between curcumin and FTO protein（a）and their interaction mode and site（b）

2.4 3 種黃酮類化合物對細胞內m6A 水平的影響

研究表明，m6A 水平的異常升高促進了細胞炎癥反應并引發(fā)慢性代謝性疾病[43]。因此，為了確定3 種黃酮類化合物是否可以調節(jié)細胞中FTO介導的m6A 去甲基化，評估了在低水平炎癥模型下黃酮類化合物對細胞內mRNA m6A 水平的影響。用高良姜素、漆黃素或姜黃素處理人臍靜脈內皮細胞，通過Agilent 6430 QQQ 三重串聯(lián)四極桿質譜儀，把RNA 打碎成核苷和堿基，通過質譜譜圖和峰強度計算出m6A 和總A 的比例，從而得知m6A 的整體水平。圖7a 為3 種黃酮類化合物處理細胞后的m6A 質譜譜圖，結果顯示姜黃素的峰面積最小，m6A 水平最低。如圖7b 所示，在IL-17 和TNFα 聯(lián)合誘導的低水平炎癥模型下，細胞內mRNA m6A 水平顯著升高，而3 種黃酮類化合物均能降低mRNA m6A 的水平，其中姜黃素對m6A 水平的降低作用最為顯著。

圖7 3 種黃酮類化合物處理后細胞內m6A 的質譜圖（a）和m6A/A 的比值（b）Fig.7 Mass spectrogram（a）and m6A/A ratio（b）of m6A in cells treated with the three flavonoids

3 結論

姜黃素、漆黃素、高良姜素均能與FTO 蛋白結合，且提高了蛋白耐酶解能力及熱穩(wěn)定性；這3種黃酮類化合物均結合在FTO 蛋白的催化活性空腔，重要的氨基酸結合位點包括：Arg96、His231、His232、Asp233、His307、Arg322，從而通過潛在活化FTO 活性來降低細胞內的RNA m6A 甲基化水平，其中姜黃素的作用效果最好。本研究結果為FTO 作為黃酮類化合物預防代謝性疾病的作用靶點提供理論依據(jù)，并為以FTO 為靶點尋找新的預防代謝性疾病的藥物或膳食補充劑提供科學數(shù)據(jù)，而FTO 下游具體的去甲基化靶RNA 有待進一步研究。