辛夢娜，袁棟棟，2，3，劉國榮，2，3*，趙世博，韓 非

（1 北京工商大學食品與健康學院 北京 100048 2 北京工商大學 老年營養(yǎng)與健康教育部重點實驗室 北京 100048 3 北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心 北京 100048）

肉類，是人們攝取蛋白質(zhì)的主要來源之一。由于肉類具有豐富的營養(yǎng)成分，因此更易受到微生物污染，導致其腐敗變質(zhì)，引發(fā)食源性疾病。食品保鮮與防腐一直是科學研究與行業(yè)發(fā)展的重要議題。一直以來添加合成防腐劑與化學防腐劑是控制食品腐敗的有效手段。然而，化學防腐劑濫用或亂用引起的食品安全事件使得消費者產(chǎn)生一些擔憂。同時，不斷提高的物質(zhì)生活水平也使人們更加追求食品的品質(zhì)與營養(yǎng)健康。綠色健康、安全無害的天然防腐劑逐漸受到人們的關注與青睞[1-2]。

乳酸鏈球菌素（Nisin）是一種由34 個氨基酸組成的多肽分子，由乳酸菌產(chǎn)生，進入人體后可被完全降解，安全無害，并且對革蘭氏陽性菌具有良好的抑制作用。乳酸鏈球菌素作為一種微生物來源的天然食品防腐劑已在世界上50 多個國家得到合法應用，然而乳酸鏈球菌素對革蘭氏陰性菌和真菌沒有抑制作用，常與其它抑菌劑復配使用[3-4]。精油作為植物源的天然抑菌劑同樣具有安全健康的優(yōu)點。香芹酚是牛至精油中含量最高、最為有效的抑菌活性成分[5-6]，同時具有抗炎[7]、抗癌[8]的作用，然而香芹酚具有顯著的揮發(fā)性氣味，限制了其使用劑量。已有文獻表明，乳酸鏈球菌素和香芹酚具有良好的協(xié)同作用[9-12]，通過復配能夠相互彌補不足之處，充分發(fā)揮各自優(yōu)勢。

然而，防腐劑的抑菌效果在實際使用過程中仍受到多種因素的影響，例如微生物因素，化學成分的生物活性，食品體系的內(nèi)在特性，以及各組分間的相互作用等[13]。已有文獻針對乳酸鏈球菌素和香芹酚在不同食品體系中的使用效果進行了研究。在乳制品中，乳脂的含量與乳酸鏈球菌素的抑菌活性緊密相關，乳脂濃度增加使乳酸鏈球菌素的抑菌活性顯著下降甚至喪失，可能是由于乳酸鏈球菌素與乳脂球之間存在某些相互作用[14-17]。在熟制香腸的保藏中，乳酸鏈球菌素的回收率隨著脂肪含量的增加而降低[18]；而且肉中谷胱甘肽存在時也導致乳酸鏈球菌素回收率極大降低，通過質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)二者發(fā)生結(jié)合[19]。一定濃度的鈣離子、鎂離子也造成乳酸鏈球菌素抑菌活性的損失[20]。同樣，在香芹酚抑菌活性的研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基環(huán)境中，香芹酚的最小抑菌濃度（MIC）隨葵花籽油含量的增加而顯著增大，蛋白提取物使MIC略有增大[21]。在烤雞、牛肉、豬肉等食品中應用時發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，添加相同含量的牛至精油并沒有達到相同的抑菌效果，菌的數(shù)量都有所增加，體外試驗的良好抑菌效果在實際應用中并不明顯[22-24]。以上研究結(jié)果表明，抑菌劑或其活性成分與菌體直接接觸時，可以發(fā)揮良好的抑制或滅活作用，然而，當被添加到一個復雜的食物系統(tǒng)中時，抑菌活性大大降低，顯然歸因于復雜的食品基質(zhì)成分干擾了其抑菌活性的發(fā)揮[3，13，17，25]。

目前，關于肉中哪些組分會對乳酸鏈球菌素和香芹酚抑菌活性存在影響還不明確。為此，本研究采用瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑，采用肉湯稀釋法測定菌落總數(shù)，分別探究肉中多種組分對乳酸鏈球菌素與香芹酚抑菌活性的影響，旨在為食品防腐劑的減量增效研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 指示菌為單核增生李斯特氏菌（L.monocytogenes），中國微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 原料與試劑 新鮮豬肉，物美超市；乳酸鏈球菌素、香芹酚、亞油酸、糖原，上海麥克林生化科技有限公司；賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、半胱氨酸、肌紅蛋白，Sigma-Aldrich 上海貿(mào)易有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、胰蛋白胨大豆固體培養(yǎng)基（TSA）、蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司；平板計數(shù)培養(yǎng)基（PCA），北京陸橋技術有限責任公司；鹽酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，福晨（天津）化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設備 電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；pH 計，安萊立思儀器科技（上海）有限公司；立式自動壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；微生物生長曲線儀，德國BMG Micro-GCM；菌落計數(shù)儀Scan 4000，法國interscience；切碎機，小熊電器股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 指示菌的活化與菌懸液的準備 取出凍存的單核增生李斯特氏菌（-80 ℃），解凍后按體積分數(shù)1%接種于TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，連續(xù)活化3 代后用PCA 培養(yǎng)基測定活菌總數(shù)，約為109CFU/mL。將活化后的菌液在TSB 培養(yǎng)基中稀釋至2×106CFU/mL 備用。

1.2.2 肉中組分對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響

1.2.2.1 乳酸鏈球菌素抑菌活性的測定 采用瓊脂擴散法（打孔）通過測定乳酸鏈球菌素的抑菌圈直徑大小來表征其抑菌活性。用無菌0.02 mol/L鹽酸溶液配制20 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液，用無菌純水分別稀釋至10，5，2.5，1.25，0.625 mg/mL的乳酸鏈球菌素溶液。在無菌平板中加入1 mL 準備好的菌懸液，倒入TSA 培養(yǎng)基（40～50 ℃），搖晃平板使菌懸液與培養(yǎng)基混勻，待培養(yǎng)基凝固，用牛津杯在合適位置打孔?？字蟹謩e加入100 μL 不同質(zhì)量濃度的乳酸鏈球菌素溶液，同時，以等量的無菌0.02 mol/L 鹽酸溶液作為空白對照。每個樣品做3 次平行。將平板置于4 ℃下擴散12 h，再轉(zhuǎn)移至37 ℃培養(yǎng)6～8 h，觀察抑菌圈，測量抑菌圈直徑。

1.2.2.2 肉湯對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響

將從超市采購的新鮮豬里脊肉，用無菌刀具切去表層，取里層組織肉用絞肉機絞碎，稱取一定質(zhì)量肉糜于無菌均質(zhì)袋中，加入無菌生理鹽水，均質(zhì)混勻，配成質(zhì)量分數(shù)為20%的肉湯。再配制20%肉湯與2.5 mg/mL 乳酸鏈球菌素的混合樣品，均質(zhì)混勻。以2.5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液作為對照。將所有樣品置于4 ℃搖床（120 r/min）作用4 h，每個樣品各取100 μL 采用瓊脂擴散法（打孔）測定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，每個樣品做3 次平行。向每個樣品中接入1%指示菌，以不含樣品的菌懸液作為空白對照，置于37 ℃培養(yǎng)12 h，每個樣品各取1 mL，在無菌生理鹽水中連續(xù)10 倍稀釋至合適梯度，用PCA 平板測定菌落總數(shù)。

1.2.2.3 肌紅蛋白對乳酸鏈球菌素n 抑菌活性的影響 配制5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液，用無菌水配制5，2，0.5 mg/mL 的肌紅蛋白溶液，將乳酸鏈球菌素溶液與不同濃度的肌紅蛋白溶液等量混合，以乳酸鏈球菌素與等量無菌水混合為空白對照，乳酸鏈球菌素最終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，肌紅蛋白的最終質(zhì)量濃度為2.5，1，0.25，0 mg/mL。將所有樣品置于4 ℃搖床（120 r/min），分別在0，3，6，9，12，18，24，36，48 h 取樣，采用瓊脂擴散法（打孔）測定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，記錄抑菌圈直徑，每個樣品做3 次平行。

1.2.2.4 肌原纖維蛋白對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 參考文獻[26]和[27]的方法提取肌原纖維蛋白，通過牛血清蛋白BCA 法測定所提取的蛋白質(zhì)量濃度為7.3 mg/mL。用無菌水稀釋獲得4，2，1，0.5 mg/mL 的肌原纖維蛋白，與5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液等量混合，以乳酸鏈球菌素與等量無菌水混合為空白對照，乳酸鏈球菌素最終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，肌纖蛋白的最終質(zhì)量濃度為2，1，0.5，0.25，0 mg/mL。將所有樣品置于4 ℃搖床（120 r/min）作用12 h 后取樣，采用瓊脂擴散法（打孔）測定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，記錄抑菌圈直徑，每個樣品做3 次平行。

1.2.2.5 亞油酸對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響向無菌水中加入亞油酸，保持55～65 ℃熱水浴高速攪拌（1 500 r/min）10 min，配制5 mg/mL 的亞油酸乳濁液，繼續(xù)稀釋獲得0.4，0.3，0.2，0.1，0.05 mg/mL 的亞油酸乳濁液，將不同質(zhì)量濃度的亞油酸乳濁液與5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液等量混合，以乳酸鏈球菌素與等量無菌水混合為空白對照，乳酸鏈球菌素最終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，亞油酸的最終質(zhì)量濃度分別為0.2，0.15，0.1，0.05，0.025，0 mg/mL。將所有樣品置于4 ℃搖床（120 r/min）作用12 h 后取樣，采用瓊脂擴散法（打孔）測定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，記錄抑菌圈直徑，每個樣品做3 次平行。

1.2.2.6 游離氨基酸對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 根據(jù)肌肉中游離氨基酸的種類及含量，選擇賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）、精氨酸（Arg）、半胱氨酸（Cys）8 種L 型氨基酸，配制氨基酸溶液，分別與乳酸鏈球菌素等體積混合，乳酸鏈球菌素最終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，賴氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.5，5，20，40 mg/mL，亮氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.5，1，5，10 mg/mL，異亮氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.1，0.5，1，15 mg/mL，纈氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.01，0.1，1，10，30 mg/mL，蛋氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.5，1，10，25 mg/mL，甘氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.1，1，10，60 mg/mL，精氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.1，1，10，45 mg/mL，半胱氨酸的終質(zhì)量濃度為0，0.05，0.1，0.5，1，5 mg/mL。將所有樣品置于4 ℃搖床（120 r/min）混合作用12 h 后取樣，采用瓊脂擴散法（打孔）測定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，記錄抑菌圈直徑，每個樣品做3 次平行。

1.2.2.7 糖原對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響根據(jù)肌肉中碳水化合物的含量配制一系列質(zhì)量濃度梯度（10，4，2，1，0.2 mg/mL）的糖原溶液，與5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素溶液等體積混合，以乳酸鏈球菌素與等量無菌水混合為空白對照，乳酸鏈球菌素最終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，糖原的最終質(zhì)量濃度為5，2，1，0.5，0.1，0 mg/mL。將樣品置于4℃搖床（120 r/min）作用12 h 后取樣，采用瓊脂擴散法（打孔）測定乳酸鏈球菌素的抑菌活性，記錄抑菌圈直徑，每個樣品做3 次平行。

1.2.3 肉中組分對香芹酚抑菌活性的影響

1.2.3.1 香芹酚在肉糜中的抑菌效果 用無菌水配制100，50，30，10，5，1 mg/mL 的香芹酚儲備液。將從超市采購的新鮮豬里脊肉，用無菌刀具切去表層，放入預先滅菌處理的絞肉機中絞碎。稱取3份200 g 肉糜，分別加入20 mL 的100，50，30，10，5，1 mg/mL 香芹酚儲備液，攪拌混勻，轉(zhuǎn)移至無菌樣品袋中，向200 g 豬肉中加入20 mL 的無菌水作為空白對照。香芹酚的最終含量分別是10，5，3，1，0.5，0.1，0 mg/g。將全部樣品轉(zhuǎn)移至25 ℃下貯存，在0，6，12，24，48 h 分別取樣25 g 置于無菌均質(zhì)袋中，向每份樣品中加入225 mL 無菌生理鹽水，均質(zhì)后得到1∶10 的樣液，繼續(xù)稀釋至合適梯度，用PCA 平板測定菌落總數(shù)。

1.2.3.2 MIC 的測定 將活化好的單核增生李斯特氏菌在TSB 培養(yǎng)基中稀釋至2×106CFU/mL。用無菌緩沖蛋白胨水（BWP）配制初始質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的香芹酚溶液，用漩渦振蕩器混勻，繼續(xù)用無菌緩沖蛋白胨水稀釋香芹酚溶液至2，1，0.5，0.25 mg/mL。將稀釋好的菌液和二倍稀釋后的香芹酚溶液按體積比1∶1 混合均勻，以菌液和無菌蛋白胨水的混合體系作為空白對照，體系中香芹酚的最終質(zhì)量濃度為1，0.5，0.25，0.125，0 mg/mL。每個試樣分別取200 μL 加入到96 孔板中，用酶標儀記錄OD600nm初始值，將所有試樣在37 ℃下培養(yǎng)24 h 后再次測定OD600nm，OD600nm無明顯變化的最低抑菌劑濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.3.3 肌紅蛋白對香芹酚抑菌活性的影響 用無菌水配制1 mg/mL 香芹酚乳濁液，分別稱取一定質(zhì)量肌紅蛋白于無菌管中，再分別加入1 mg/mL香芹酚溶液，混合均勻，使肌紅蛋白質(zhì)量濃度分別為20，14，8，2 mg/mL，置于4 ℃作用12 h。取不同質(zhì)量濃度的肌紅蛋白和香芹酚的混合液各1 mL，分別加入1 mL 菌懸液，混合均勻，以菌液加香芹酚溶液的樣品為空白對照，以菌液加無菌水的樣品為陽性對照。肌紅蛋白的最終質(zhì)量濃度為10，7，4，1，0 mg/mL，香芹酚的質(zhì)量濃度（MIC）是0.5 mg/mL。將樣品置于37 ℃下培養(yǎng)，分別在0，3，6，9，12 h 取樣100 μL，用無菌緩沖蛋白胨水10 倍稀釋至合適濃度，涂布于TSA 培養(yǎng)基上，置于37℃下培養(yǎng)24 h，記錄活菌總數(shù)。

1.2.3.4 肌原纖維蛋白對香芹酚抑菌活性的影響用無菌水配制7.3，3.65，1.825 mg/mL 的肌原纖維蛋白，與2 mg/mL 香芹酚溶液等量混合制成混合反應液，置于4 ℃下作用12 h。分別取混合液各1 mL，分別加入1 mL 菌懸液，混合均勻，以菌液加香芹酚溶液的樣品為空白對照，以菌液加無菌水的樣品為陽性對照。肌纖蛋白的最終質(zhì)量濃度分別為1.825，0.9，0.45，0 mg/mL，香芹酚的MIC 是0.5 mg/mL。將樣品置于37 ℃下培養(yǎng)，在0，3，6，9，12 h 分別取樣測定活菌總數(shù)。

1.2.3.5 亞油酸對香芹酚抑菌活性的影響 向無菌水中加入亞油酸，保持55～65 ℃熱水浴高速攪拌（1 500 r/min）10 min，配制5 mg/mL 的亞油酸乳濁液，繼續(xù)稀釋獲得0.8，0.4，0.2 mg/mL 的亞油酸乳濁液，將不同質(zhì)量濃度的亞油酸乳濁液與2 mg/mL 香芹酚溶液等量混合，將所有混合反應液置于4 ℃下作用12 h。分別取混合液各1 mL，分別加入1 mL 菌懸液，混合均勻，以菌液加香芹酚溶液的樣品為空白對照，以菌液加無菌水的樣品為陽性對照。亞油酸的最終質(zhì)量濃度為0.2，0.1，0.05，0 mg/mL，香芹酚的MIC 為0.5 mg/mL。將樣品置于37 ℃下培養(yǎng)，分別在0，3，6，9，12 h 取樣測定活菌總數(shù)。

1.2.3.6 游離氨基酸對香芹酚抑菌活性的影響配制賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、半胱氨酸的溶液，分別與2 mg/mL 香芹酚溶液在4 ℃下混合作用12 h，分別取不同混合液各1 mL，分別加入1 mL 菌懸液，混合均勻，以菌液加香芹酚溶液的樣品為空白對照，以菌液加無菌水的樣品為陽性對照。游離氨基酸的質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，香芹酚的MIC 是0.5 mg/mL。將樣品置于37 ℃下培養(yǎng)12 h 后，測定活菌總數(shù)。

1.2.3.7 糖原對香芹酚抑菌活性的影響 配制一系列不同質(zhì)量濃度（10，4，2，1，0.2 mg/mL）的糖原溶液，與2 mg/mL 香芹酚溶液以1∶1 的體積比混合，在4 ℃下作用12 h，取各混合液1 mL，加入1 mL 菌懸液，混合均勻，以菌液加香芹酚溶液的樣品為空白對照，以菌液加無菌水的樣品為陽性對照。糖原的最終質(zhì)量濃度為5，2，1，0.5，0.1，0 mg/mL，香芹酚的MIC 為0.5 mg/mL。將樣品置于37℃下培養(yǎng)12 h 后，測定活菌總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉中組分對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響

2.1.1 乳酸鏈球菌素的抑菌活性 以單核增生李斯特菌為指示菌，采用瓊脂擴散法通過測定抑菌圈直徑來表征乳酸鏈球菌素的抑菌活性。如圖1所示，乳酸鏈球菌素具有良好的抑菌作用，隨著乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度逐漸增大，抑菌圈直徑逐漸增大，當乳酸鏈球菌素的質(zhì)量濃度為0.625 mg/mL時，仍然具有抑菌效果，推斷乳酸鏈球菌素的最小抑菌濃度小于0.625 mg/mL。當乳酸鏈球菌素的質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時，抑菌圈直徑達到了20 mm，因此選擇2.5 mg/mL 的乳酸鏈球菌素，采用瓊脂擴散法考察肉中組分對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響。

圖1 乳酸鏈球菌素的抑菌活性Fig.1 The antibacterial activity of nisin

2.1.2 肉湯對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 通過測定抑菌圈直徑和菌落總數(shù)分別考察了鮮肉組分是否會對乳酸鏈球菌素的活性產(chǎn)生影響。如圖2a 所示，與乳酸鏈球菌素對照組相比，肉湯與乳酸鏈球菌素混合的試驗組無抑菌圈，乳酸鏈球菌素已無抑菌效果；如圖2b 所示，乳酸鏈球菌素的對照組中無菌生長，而肉汁與乳酸鏈球菌素混合的試驗組的菌落總數(shù)大幅度升高，達到了107CFU/mL。結(jié)果表明，肉汁影響了乳酸鏈球菌素的抑菌活性，與溶液中的乳酸鏈球菌素相比，肉湯中的乳酸鏈球菌素的抑菌活性下降，這可能是由于肉湯中復雜的組分與乳酸鏈球菌素之間存在某些效應，抑制了乳酸鏈球菌素抑菌活性的發(fā)揮。

圖2 肉湯對乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.2 The effect of broth on the antibacterial activity of nisin

2.1.3 肌紅蛋白對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響肌紅蛋白是決定肉的顏色的重要組分，通過測定抑菌圈直徑的變化探索了其對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響。如圖3 所示，隨著作用時間延長，乳酸鏈球菌素的抑菌圈直徑逐漸減小，乳酸鏈球菌素的抑菌活性受到了抑制；而且，肌紅蛋白的質(zhì)量濃度與乳酸鏈球菌素的抑菌活性呈反比，肌紅蛋白的質(zhì)量濃度越大，乳酸鏈球菌素的抑菌活性越弱。圖3a 為作用24 h 后乳酸鏈球菌素的抑菌圈直徑圖，可以觀察到抑菌圈明顯減小，當肌紅蛋白的質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時，乳酸鏈球菌素幾乎無抑菌圈，肌紅蛋白削弱了乳酸鏈球菌素的抑菌活性，影響效果顯著。

圖3 肌紅蛋白對乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.3 The effect of myoglobin on the antibacterial activity of nisin

2.1.4 肌原纖維蛋白對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 肌原纖維蛋白是肉中含量最多的一類蛋白，約占蛋白組分的50%（質(zhì)量分數(shù)），通過測定抑菌圈直徑探索肌原纖維蛋白對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白對乳酸鏈球菌素的抑菌活性有不利影響。如圖4 所示，作用12 h 后，乳酸鏈球菌素的抑菌圈明顯減小，肌原纖維蛋白的質(zhì)量濃度越大，對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響效果越大，抑菌圈越??；當加入的肌原纖維蛋白的質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時，乳酸鏈球菌素已無抑菌圈。

圖4 肌原纖維蛋白對乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.4 The effect of myofibrillar protein on the antibacterial activity of nisin

2.1.5 亞油酸對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響亞油酸在肌肉組織中含量大約占10%（質(zhì)量分數(shù)），是肌肉脂肪組織中含量最高的多不飽和脂肪酸，通過測定抑菌圈直徑探索亞油酸對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響。結(jié)果顯示，亞油酸會減弱乳酸鏈球菌素的抑菌活性。如圖5 所示，乳酸鏈球菌素與亞油酸作用12 h 后，乳酸鏈球菌素的抑菌圈直徑逐漸減小，并且與亞油酸的質(zhì)量濃度呈負相關，質(zhì)量濃度越大時抑菌圈直徑越小，直至沒有明顯的抑菌區(qū)域。

圖5 亞油酸對乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.5 The effect of linoleic acid on the antibacterial activity of nisin

2.1.6 游離氨基酸和糖原對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響 肌肉組織中含有多種游離氨基酸，氨基酸種類和含量是評價肌肉營養(yǎng)價值的重要指標，同時，一些呈味氨基酸也是肉制品風味的重要來源；而肌肉組織中的碳水化合物主要是肌糖原，含量在1.0%（質(zhì)量分數(shù)）左右。通過測定抑菌圈直徑探索多種游離氨基酸和糖原對乳酸鏈球菌素抑菌活性的影響，結(jié)果顯示，游離氨基酸和糖原對乳酸鏈球菌素的抑菌活性無明顯影響。如圖6～7 所示，乳酸鏈球菌素的抑菌圈直徑大小基本一樣，沒有隨氨基酸種類與質(zhì)量濃度的不同而發(fā)生變化，也沒有隨糖原質(zhì)量濃度的不同而發(fā)生變化，說明游離氨基酸和糖原不是影響乳酸鏈球菌素抑菌活性的組分。

圖6 多種游離氨基酸對乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.6 The effect of several free linoleic acids the on antibacterial activity of nisin

圖7 糖原對乳酸鏈球菌素的抑菌活性的影響Fig.7 The effect of glycogen on the antibacterial activity of nisin

圖8 在常溫條件下不同質(zhì)量濃度的香芹酚處理豬肉糜的菌落總數(shù)變化Fig.8 Changes of total number of bacteria in pork ground treated with different mass concentrations of carvacrol at room temperature

2.2 肉中組分對香芹酚抑菌活性的影響

2.2.1 香芹酚在肉糜中的抑菌效果 用不同質(zhì)量濃度的香芹酚處理豬肉糜，在常溫條件（25 ℃）下貯藏，通過測定菌落總數(shù)的變化來評價香芹酚的抑菌效果。試驗數(shù)據(jù)顯示，10 mg/mL 的香芹酚可以保證肉糜在48 h 內(nèi)無微生物生長；5 mg/mL 的香芹酚可以很好地抑制微生物生長，在48 h 時菌落總數(shù)在104CFU/g 左右；3 mg/mL 的香芹酚可以控制微生物在48 h 內(nèi)菌落總數(shù)在106CFU/g 左右，在24 h 時菌落總數(shù)在102CFU/g 左右；當香芹酚質(zhì)量濃度在1 mg/mL 及以下時，不能很好的抑制微生物生長，24 h 時菌落總數(shù)接近106CFU/g。

2.2.2 香芹酚對抗單核增生李斯特氏菌的MIC測定了單核增生李斯特氏菌在不同質(zhì)量濃度的香芹酚處理下的生長狀況，從圖9 可以看出，當初始菌落數(shù)約為2×106CFU/mL 時，不同濃度的香芹酚對指示菌有一定的抑制作用，當香芹酚的質(zhì)量濃度在0.25 mg/mL 及以下時，不能抑制香芹酚生長，當大于0.5 mg/mL 及以上時，抑制效果明顯，因此推斷香芹酚對單核增生李斯特氏菌的MIC 為0.5 mg/mL。

圖9 單核增生李斯特氏菌在不同香芹酚處理下的生長曲線Fig.9 Growth curves of L.monocytogenes treated with different carvacrol

2.2.3 肌紅蛋白對香芹酚抑菌活性的影響 在接入2×106CFU/mL 指示菌的TSB 肉湯中加入0.5 mg/mL 的香芹酚，再加入不同質(zhì)量濃度的肌紅蛋白，通過測定體系中菌落總數(shù)變化來探究肌紅蛋白對香芹酚抑菌活性的影響。結(jié)果顯示，肌紅蛋白對香芹酚的抑菌活性產(chǎn)生了不利影響。如圖10 所示，0 h 時，加入4 mg/mL 及更高質(zhì)量濃度肌紅蛋白的體系中有菌生長，而菌落數(shù)仍然小于陽性對照組，而加入1 mg/mL 和不加肌紅蛋白的體系無菌生長，說明足夠大濃度的肌紅蛋白對香芹酚的抑菌活性造成了不利影響。這種不利影響在3 h的取樣結(jié)果中依然可以體現(xiàn)。通過6 h 取樣結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著時間延長香芹酚逐漸發(fā)揮了最大的抑菌能力，基本無活菌存在，而在添加10 mg/mL肌紅蛋白的體系中依然有2.5 lg（CFU/mL）的菌。從9 h 的取樣結(jié)果發(fā)現(xiàn)，香芹酚的抑菌能力逐漸失效，菌落總數(shù)增長，而添加肌紅蛋白的體系中菌落總數(shù)均大于空白對照組，且隨肌紅蛋白質(zhì)量濃度的增大而增加。以上結(jié)果表明，在模擬肉湯環(huán)境中，質(zhì)量濃度較大的肌紅蛋白會使香芹酚的抑菌活性下降。然而，老齡牛肉中肌紅蛋白的含量是16～20 mg/g，老齡豬肉中含量為8～12 mg/g，老齡羊肉中含量為12～18 mg/g[28]，因此，在實際應用中，肉中的肌紅蛋白可能會削弱香芹酚的抑菌效果。

圖10 肌紅蛋白對香芹酚抑菌活性的影響Fig.10 The effect of myoglobin on the antibacterial activity of carvacrol

2.2.4 肌原纖維蛋白對香芹酚抑菌活性的影響在接入2×106CFU/mL 指示菌的TSB 肉湯中加入0.5 mg/mL 的香芹酚與不同質(zhì)量濃度的肌原纖維蛋白，通過測定體系中菌落總數(shù)變化來探究肌原纖維蛋白對香芹酚抑菌活性的影響。結(jié)果顯示，肌原纖維蛋白對香芹酚抑菌活性產(chǎn)生了一定的抑制作用。如圖11 所示，在0，3 h 的樣品中發(fā)現(xiàn)，加入1.825 mg/mL 與0.9 mg/mL 肌纖維蛋白的體系中有指示菌生長，而加入0.45 mg/mL 與不加肌纖維蛋白的體系沒有菌生長，這表明肌纖維蛋白的對香芹酚的抑菌活性產(chǎn)生了抑制作用。同樣在6，9，12 h 的結(jié)果中也能觀察到抑制作用，且肌原纖維蛋白的質(zhì)量濃度越大，對香芹酚的影響越大。

圖11 肌原纖維蛋白對香芹酚抑菌活性的影響Fig.11 The effect of myofibrillar protein on the antibacterial activity of carvacrol

2.2.5 亞油酸對香芹酚抑菌活性的影響 在接入2×106CFU/mL 指示菌的TSB 肉湯中加入0.5 mg/mL 的香芹酚與不同質(zhì)量濃度的亞油酸，通過測定體系中菌落總數(shù)變化來探究亞油酸對香芹酚抑菌活性的影響。結(jié)果顯示，亞油酸對香芹酚的抑菌活性存在不利影響。如圖12 所示，前6 h 加入不同質(zhì)量濃度的亞油酸組分與空白對照的抑菌效果基本保持一致，而9，12 h 取樣結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，加入0.1 mg/mL 與0.2 mg/mL 亞油酸的體系中，菌落總數(shù)大于空白對照，說明亞油酸對香芹酚的抑菌活性產(chǎn)生了抑制，且抑制作用強弱與亞油酸質(zhì)量濃度存在正相關關系。

圖12 亞油酸對香芹酚抑菌活性的影響Fig.12 The effect of linoleic acid on the antibacterial activity of carvacrol

2.2.6 游離氨基酸和糖原對香芹酚抑菌活性的影響 通過測定體系中菌落總數(shù)的變化探究多種游離氨基酸和糖原對香芹酚抑菌活性的影響，結(jié)果顯示，游離氨基酸和糖原對乳酸鏈球菌素的抑菌活性無明顯影響。如圖13 所示，加入游離氨基酸的試驗組中菌落總數(shù)與空白對照基本保持一致，沒有明顯的上升趨勢。如圖14 顯示，在加入不同質(zhì)量濃度的糖原體系中，與空白對照相比也沒有發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)的上升，說明游離氨基酸和糖原并不是影響香芹酚抑菌活性的組分。

圖13 多種游離氨基酸對香芹酚抑菌活性的影響Fig.13 The effect of several free linoleic acids on the antibacterial activity of carvacrol

圖14 糖原對香芹酚抑菌活性的影響Fig.14 The effect of glycogen on the antibacterial activity of carvacrol

3 討論與結(jié)論

本研究在單一變量的模擬環(huán)境中，明確了肉中哪些組分對乳酸鏈球菌素和香芹酚的抑菌活性產(chǎn)生影響。其中，蛋白組分包括水溶性的肌紅蛋白和水不溶性的肌原纖維蛋白都對乳酸鏈球菌素和香芹酚的抑菌活性產(chǎn)生了不利影響；其次，亞油酸對乳酸鏈球菌素和香芹酚的抑菌活性也產(chǎn)生了一定的抑制作用；另外，多種游離氨基酸和糖原對乳酸鏈球菌素和香芹酚的抑菌活性未見明顯影響。有文獻探明食物中的酪蛋白、卵磷脂對乳酸鏈球菌素的抑菌活性有負面影響[29]。黃現(xiàn)青等[30]發(fā)現(xiàn)高濃度亞油酸對脂肽類抗菌肽（Surfactin）滅活芽孢具有負面影響，本試驗結(jié)果與文獻研究結(jié)果一致。有大量文獻研究[31-32]表明食物蛋白組分與添加劑中活性分子之間存在相互作用，形成沉淀物、凝聚體或復合物，改變蛋白結(jié)構(gòu)的同時也可能會影響小分子的活性。例如，牛乳中的乳清蛋白與表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）發(fā)生共價結(jié)合，改性后的蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，具有更好的發(fā)泡和乳化性能[33]，且復合物抗氧化活性明顯增強[34]。然而，乳清蛋白與ε-聚賴氨酸之間主要通過靜電相互作用形成凝聚物，不僅影響食品體系的穩(wěn)定性，而且削弱了ε-聚賴氨酸的抑菌效果[35]。重要的是，已有文獻報道香芹酚與肌原纖維蛋白、牛血清蛋白之間存在結(jié)合相互作用[36-37]?；谝陨涎芯客茰y，乳酸鏈球菌素和香芹酚與肌紅蛋白和肌原纖維蛋白可能存在相互作用，導致抑菌活性減弱。雖然關于天然活性分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用研究成果很多，但是它們與脂類組分之間的非共價相互作用研究卻較少，關于脂肪組分對乳酸鏈球菌素和香芹酚抑菌活性影響的具體機制未見報道，還需進一步研究。不過也有文獻綜述提及類黃酮類分子與脂質(zhì)雙分子層存在相互作用，將多酚包埋于納米脂質(zhì)體中制備運載體系等[38-39]。因此，亞油酸作為一種油性分子可能對乳酸鏈球菌素和香芹酚產(chǎn)生一定的吸附作用，附著在分子表面，使之無法有效擴散，不能與菌體直接接觸，從而使其抑菌效果下降，也有可能是亞油酸與抑菌劑分子發(fā)生疏水性結(jié)合，從而影響了結(jié)構(gòu)微環(huán)境導致其抑菌活性改變。

本研究明確了肉中多種組分對乳酸鏈球菌素和香芹酚的抑菌活性存在不利影響，對指導理論研究和生產(chǎn)實踐具有重要意義。綜上，接下來將構(gòu)建單一模擬體系，針對肌紅蛋白、亞油酸與乳酸鏈球菌素、香芹酚之間的具體互作機制展開研究，以期豐富應用這類天然抑菌劑的理論研究。