商迎輝，魏 俊，李夢(mèng)潔，劉蕓如，黃漢昌，勞鳳學(xué)

（北京市生物活性物質(zhì)和功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京聯(lián)合大學(xué)功能因子與腦科學(xué)研究院 北京 100191）

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種退行性疾病。全球每3 s 會(huì)有1 位癡呆癥患者產(chǎn)生，目前至少有5 000 萬(wàn)癡呆癥患者，到2050年，預(yù)計(jì)將達(dá)到1.52 億人，其中60%～70%是AD患者[1]。在中國(guó)目前約有1 000 萬(wàn)阿爾茨海默癥患者，到2050 年，預(yù)計(jì)將超過(guò)4 000 萬(wàn)人[2]。目前阿爾茨海默癥的發(fā)病機(jī)制不明，并缺乏有效的預(yù)防、診斷及治療方法[3]。阿爾茨海默癥病理征狀出現(xiàn)前，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）被激活，錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)增多，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失衡，是AD 的早期事件[4]。當(dāng)神經(jīng)元中發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，未折疊蛋白反應(yīng)（Unfoldedprotein response，UPR）被激活，并引起下游一系列相關(guān)蛋白信號(hào)的表達(dá)[5-7]。3 種感受器參與UPR，包括PKR 樣ER 調(diào)節(jié)激酶（PKR-like ER kinase，PERK）、抑制物阻抗性酯酶1α（Inositol-requiring enzyme-1α，IRE1α）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（Activating transcription factor 6，ATF6）[8]。

類(lèi)胡蘿卜素是天然的脂溶性抗氧化劑，在水果和蔬菜中作為彩色色素大量存在，至少有600種類(lèi)胡蘿卜素是天然存在的[9]。其中，玉米黃素（Zeaxanthin，Zea）是一種具有強(qiáng)抗氧化活性的類(lèi)胡蘿卜素[10]，以中藥枸杞子中含量最多[11]。玉米黃素有3 種立體異構(gòu)體，分別是（3R，3'R）型、（3R，3'S）型和（3S，3'S）型，自然界中絕大多數(shù)以（3R，3'R）型存在（分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1）。其分子中的11 個(gè)共軛雙鍵與尾端基團(tuán)的羥基，使得它們具有較強(qiáng)的抗氧化能力。研究表明，葉黃素/玉米黃素異構(gòu)體能通過(guò)改善神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和突觸蛋白以及大腦皮層的氧化能力來(lái)有效減少神經(jīng)變性[12]。玉米黃素具有穿過(guò)血腦屏障并在神經(jīng)組織中積累的能力，且存在β 環(huán)，可能會(huì)防止形成或破壞β-淀粉樣蛋白的聚集，因此玉米黃素等類(lèi)胡蘿卜素具有預(yù)防和治療AD 的巨大潛力[13]。

圖1 玉米黃素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structural formula of zeaxanthin

衣霉素（Tunicamycin，TM）作為天然抗生素現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型[14-15]，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[16-17]。研究表明，TM 誘導(dǎo)的持續(xù)UPR 表達(dá)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡，并激活自噬與GRP78 的結(jié)合[18]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[19]，TM 質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)，可對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞造成損傷；建立有效ERS模型，2～10 μmol/L 玉米黃素可明顯減輕TM 損傷，其中濃度為5 μmol/L，預(yù)處理6 h，保護(hù)效果最好。本試驗(yàn)采用5 μg/mL TM 處理建立ERS 細(xì)胞模型，5 μmol/L 玉米黃素對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，研究玉米黃素通過(guò)PERK/CHOP 通路對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響，對(duì)AD 的靶點(diǎn)治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃素（純度為85.7%，無(wú)水乙醇溶解，配制成30 mmol/L 的儲(chǔ)存液，避光于-20 ℃保存），上海源葉生物科技有限公司。

TM 用DMSO 溶解，配制成5 μg/μL 的儲(chǔ)存液，-20 ℃保存，北京華越洋生物科技有限公司；神經(jīng)母瘤細(xì)胞（SH-SY5Y），中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源中心；3-甲基腺嘌呤，美國(guó)Selleckchem 公司；胎牛血清、1640 培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco；L-谷氨酰胺、羥乙基哌嗪乙硫磺酸、雙抗，北京Solarbio 公司；BCA試劑盒，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Caspase 3 活性檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Anti-PERK、Anti-p-eIF2α、Anti-ATF4、Anti-β-actin 和Anti-CHOP 抗體，美國(guó)Sigma 公司；Anti-GRP78 抗體，美國(guó)Bioworld Technology公司；Anti-Beclin 抗體，跨國(guó)BD Transduction Laboratories 公司；辣根過(guò)氧化物酶山羊抗鼠IgG（H＋L），中杉金橋公司。

1.2 儀器與設(shè)備

E191IR 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)金西盟公司；CKX41 倒置顯微鏡，Olympus 公司；Varioskan Flash 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；5043BR57802 轉(zhuǎn)膜裝置，BIO-RAD 公司；凝膠成像分析儀，Image Quant RTECL 公司。

1.3 方法

1.3.1 SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇SH-SY5Y 細(xì)胞，在含有10%胎牛血清的RPIM 1640 培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷模型的建立 將SHSY5Y 細(xì)胞用胰酶消化、細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，以達(dá)到貼壁狀態(tài)，棄去上清液，加入由RPIM 1640 培養(yǎng)液配制的TM 溶液。TM 處理36 h 后，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞試驗(yàn)分組 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程同1.3.1 所述方法，細(xì)胞試驗(yàn)分為空白對(duì)照組、玉米黃素保護(hù)組、TM 損傷組、損傷加保護(hù)組，TM 損傷組使用5 μg/mL TM 處理36 h，玉米黃素保護(hù)組使用5 μmol/L 玉米黃素預(yù)處理6 h，損傷加保護(hù)組為5 μmol/L 玉米黃素預(yù)處理6 h 后再加入5 μg/mL TM 處理36 h。

1.3.4 檢測(cè)Caspase 3 活性 細(xì)胞培養(yǎng)及處理過(guò)程同1.3.1 和1.3.3 節(jié)，Caspase 3 活性根據(jù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。收集經(jīng)處理后的SH-SY5Y細(xì)胞，并用細(xì)胞裂解液收集總蛋白，Bradford 法對(duì)總蛋白定量后與Caspase 3 底物Ac-DEVD-pNA于37 ℃反應(yīng)2 h，發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)，用酶標(biāo)儀在405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度OD 值。將TM組的Caspase 3 的活性定義為100%。使用公式（1）計(jì)算Caspase 3 活性。

1.3.5 Western Blot 分析 使用預(yù)冷的PBS 將藥物處理后的細(xì)胞洗滌2～3 次，加入適量RIPA 細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），置于冰上30 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，收集上清，BCA 方法測(cè)定蛋白濃度。按體積比1∶4 將5×SDS 上樣緩沖液加入到剩余上清液中，煮沸5 min，-20 ℃保存蛋白樣品。樣品采用SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗孵育4 ℃過(guò)夜。TBST 洗滌3 次，室溫下用二坑孵育2 h，TBST 慢速搖動(dòng)10 min，洗滌3 次。ECL 發(fā)光液檢測(cè)PVDF 膜上條帶的光密度值，用β-actin作為內(nèi)參，分析條帶的灰度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，每組試驗(yàn)做3 組平行，SPSS 19.0 數(shù)據(jù)分析，Origin 7.5 繪制圖表。試驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），用Bonferroni 法多重比較，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米黃素對(duì)ERS 細(xì)胞模型中Caspase 3的影響

促進(jìn)凋亡的Caspase（Cysteine-requiring aspartate protease）家族在ERS 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過(guò)程中也起到重要作用，Caspase 在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中研究較多的一個(gè)蛋白，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，可激活Caspase 3，Caspase 3激活后能夠特異性剪切許多特定的凋亡底物，引發(fā)細(xì)胞凋亡。除此之外，Caspase 3 可導(dǎo)致染色質(zhì)固縮、DNA 片段化等一系列導(dǎo)致細(xì)胞核凋亡的事件。因此，用Caspase 3 試劑盒對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，并按要求將TM 處理后的ERS 細(xì)胞模型組的Caspase 3 活性定義為100%。結(jié)果如圖2 所示，可以看出，經(jīng)過(guò)5 μmol/L 玉米黃素處理后，其Caspase 3 活性顯著低于ERS 模型組（P＜0.01）。因此可以初步判斷，玉米黃素能抑制TM 引起的Caspase 3 活性的上升，對(duì)凋亡具有一定的作用。至于對(duì)凋亡早期階段和晚期階段的影響還需試驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明。

圖2 玉米黃素對(duì)TM 誘導(dǎo)后的SH-SY5Y細(xì)胞Caspase 3 活性的影響Fig.2 Effect of zeaxanthin on caspase 3 activity of SH-SY5Y cells damaged by TM

2.2 玉米黃素作用于ERS 細(xì)胞模型后對(duì)凋亡的影響

2.2.1 玉米黃素通過(guò)抑制PERK 通路來(lái)緩解ERS引起的凋亡 PERK 蛋白是細(xì)胞內(nèi)一種重要的UPR 近端感受器，當(dāng)神經(jīng)元中引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，PERK 會(huì)與GRP78 解離，并且可通過(guò)跨膜磷酸化而傳到ERS 反應(yīng)信號(hào)。并通過(guò)磷酸化下游翻譯起始因子（Eukaryotic initiation factor 2，elF2）的α亞基進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，同時(shí)活化轉(zhuǎn)錄活化因子4（ATF4），上調(diào)促凋亡因子CHOP，促進(jìn)細(xì)胞的程序性死亡。

因此在ERS 產(chǎn)生后，PERK 通路的異常變化對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生重要影響。為探究玉米黃素能否在ERS 細(xì)胞模型中對(duì)PERK-elF2α 通路產(chǎn)生影響，用Western Blot 同時(shí)檢測(cè)了PERK 及其下游的elF2α 蛋白和ATF4 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3 所示，與TM 模型組相比，當(dāng)5 μmol/L 的玉米黃素作用于ERS 模型細(xì)胞后，結(jié)果顯示PERK 及其下游調(diào)控蛋白elF2α 和ATF4 的表達(dá)能顯著下降（P＜0.01），說(shuō)明玉米黃素可通過(guò)調(diào)控PERK 通路來(lái)緩解SH-SY5Y 細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可能機(jī)制是阻止PERK 蛋白與GRP78 的分離。

圖3 玉米黃素對(duì)ERS 模型中PERK 通路的影響Fig.3 Effect of zeaxanthin on PERK pathway in ERS model

2.2.2 玉米黃素抑制促凋亡因子CHOP 的產(chǎn)生CHOP 是PERK 通路下游的蛋白，是細(xì)胞從抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)換的一種關(guān)鍵信號(hào)因子。為進(jìn)一步探究玉米黃素對(duì)ERS 細(xì)胞模型的保護(hù)作用機(jī)制，同時(shí)對(duì)各組的CHOP 蛋白進(jìn)行分析，Western Blot結(jié)果如圖4 所示，與對(duì)照組相比，TM 模型組的CHOP 蛋白的表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.005），而玉米黃素處理組CHOP 蛋白的表達(dá)水平極顯著低于TM 模型組（P＜0.01），這說(shuō)明玉米黃素可以通過(guò)調(diào)控PERK 通路來(lái)抑制ERS 細(xì)胞模型中促凋亡蛋白CHOP 的升高。

圖4 玉米黃素對(duì)ERS 模型中CHOP 表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of zeaxanthin on CHOP expression in ERS model

2.3 玉米黃素作用于ERS 細(xì)胞模型后對(duì)自噬的影響

2.3.1 玉米黃素緩解ERS 引起的自噬 自噬溶酶體系統(tǒng)是清除錯(cuò)誤蛋白和損傷細(xì)胞器的一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡發(fā)揮著重要作用。越來(lái)越多的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)自噬[20]，并且指出自噬是發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中的一種適應(yīng)性反應(yīng)，然而這些研究相繼報(bào)道了自噬在細(xì)胞死亡中的雙重作用，即它可以保護(hù)細(xì)胞使其免于凋亡，而自噬的過(guò)度激活也會(huì)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[21-22]。

為了闡明玉米黃素作用于ERS 細(xì)胞模型后的保護(hù)作用與自噬之間的關(guān)系，深入研究了玉米黃素作用于ERS 細(xì)胞模型后自噬標(biāo)志性蛋白Beclin 1 的變化。Beclin 1 基因是被證實(shí)的哺乳動(dòng)物的自噬基因，在自噬體的形成過(guò)程中至關(guān)重要[23]。如圖5 所示，TM 作用24 h 后玉米黃素組的Beclin 1 水平明顯高于TM 組，結(jié)果有極顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明在初期階段玉米黃素組自噬水平顯著增強(qiáng)，然而當(dāng)TM 作用36 h 后，TM 組Beclin 1 的水平持續(xù)升高，沒(méi)有降低的趨勢(shì)，而玉米黃素組的Beclin 1 水平與TM 組相比極顯著降低（P＜0.01），由此可以說(shuō)明玉米黃素能在ERS 初始階段促進(jìn)自噬，當(dāng)ERS 持續(xù)存在時(shí)，玉米黃素又能穩(wěn)定自噬水平。可能的原因是，在ERS 初期階段，錯(cuò)誤折疊及未折疊蛋白增多，此階段玉米黃素能促進(jìn)自噬對(duì)錯(cuò)誤蛋白或未折疊蛋白進(jìn)行清除降解，此時(shí)的自噬是作為細(xì)胞的一種保護(hù)性機(jī)制，然而當(dāng)ERS 長(zhǎng)期且持續(xù)進(jìn)行時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的錯(cuò)誤蛋白及未折疊蛋白增多至超出負(fù)荷，細(xì)胞應(yīng)激失去控制，激活的自噬無(wú)法正常發(fā)揮功能，為防止自噬功能紊亂導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，玉米黃素在此階段可以降低自噬，避免自噬導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。而TM 組由于沒(méi)有玉米黃素的調(diào)控，自噬持續(xù)增加，最終導(dǎo)致失控而引起細(xì)胞死亡。

圖5 玉米黃素對(duì)ERS 模型中Beclin 1表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of zeaxanthin on Beclin 1 expression in ERS model

2.3.2 抑制自噬會(huì)減弱玉米黃素對(duì)ERS 的緩解作用 為了進(jìn)一步明確玉米黃素對(duì)ERS 細(xì)胞模型的保護(hù)作用與自噬之間的關(guān)系，研究采用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3MA）進(jìn)一步檢測(cè)自噬被抑制后玉米黃素對(duì)細(xì)胞內(nèi)ERS的影響。3MA 是細(xì)胞試驗(yàn)中常用的自噬抑制劑，可抑制自噬體的形成[24]。用自噬抑制劑3MA 抑制自噬后，分析Beclin 1 和GRP78 的變化情況，以深入探究玉米黃素在ERS 細(xì)胞模型中與自噬的關(guān)系。細(xì)胞分組后，自噬抑制組用10 mmol/L 3MA預(yù)處理6 h 后，加入5 μg/mL TM 繼續(xù)處理36 h。由圖6 的Western Blot 結(jié)果可知，加入3MA 后，無(wú)論是TM 組還是玉米黃素組（Zea＋TM）Beclin 1的表達(dá)水平均降低，表明自噬被抑制，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白GRP78 的表達(dá)水平均高于未添加組。從圖6b 柱形圖也可直觀的看出，加入3MA 抑制自噬后，玉米黃素組的GRP78 水平與未加3MA的玉米黃素組相比極顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明自噬被抑制后玉米黃素緩解ERS 的能力被減弱。綜合以上結(jié)果證明玉米黃素對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的緩解作用與自噬的調(diào)控有關(guān)，抑制自噬會(huì)減弱玉米黃素對(duì)ERS 的緩解作用。

圖6 自噬抑制劑會(huì)減弱玉米黃素對(duì)ERS 的緩解作用Fig.6 Autophagy inhibitor decreased the alleviative effect of zeaxanthin on ERS cell model

3 討論

AD 作為一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是威脅老年人群健康的較常見(jiàn)的危險(xiǎn)疾病。多數(shù)在65歲之后發(fā)病，少于5%的患者在65 歲之前發(fā)病。中國(guó)在步入老齡化階段后，AD 的患病率將逐年升高，尤其隨著人均壽命延長(zhǎng)，這不僅會(huì)使AD 患者生活質(zhì)量下降，還會(huì)給照顧者、家庭和公共衛(wèi)生部門(mén)造成巨大負(fù)擔(dān)[25]。針對(duì)AD 治療的藥物無(wú)法完全治愈本病，對(duì)AD 的治療策略更加注重早期預(yù)防[26]。蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊是AD 病理生理學(xué)的關(guān)鍵事件，因此，ERS 也是其一[27]，且發(fā)生在AD 早期，是一種早期的應(yīng)激性反應(yīng)[28]。長(zhǎng)期過(guò)度的ERS 會(huì)激活凋亡和自噬且發(fā)揮反面作用導(dǎo)致自噬功能紊亂，過(guò)度的自噬也會(huì)引起細(xì)胞死亡[29]。因此探討通過(guò)有效的生物活性物質(zhì)來(lái)調(diào)控ERS，進(jìn)而抑制早期AD 病理，具有重要意義。

多項(xiàng)研究表明類(lèi)胡蘿卜素對(duì)AD 具有保護(hù)作用，最近一項(xiàng)通過(guò)系統(tǒng)評(píng)價(jià)和薈萃分析的研究顯示，血漿中的玉米黃素濃度與AD 風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[30]。此外，類(lèi)胡蘿卜素的酮β-環(huán)和κ-環(huán)，可能防止或抑制β-淀粉樣蛋白的聚集。研究顯示，玉米黃素通過(guò)激活A(yù)KT 信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激緩解高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡[31]，也可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期等信號(hào)途徑抑制細(xì)胞凋亡[32]。一項(xiàng)流行性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，膳食類(lèi)胡蘿卜素可能會(huì)限制自由基對(duì)神經(jīng)元的損傷，增加葉黃素和玉米黃素的攝入量可能有助于預(yù)防或減緩認(rèn)知能力下降[33]。因此，玉米黃素可能具有預(yù)防或治療AD 的潛力。

本研究用TM 建立SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，研究玉米黃素對(duì)ERS 引起的細(xì)胞凋亡的機(jī)制，進(jìn)而探究其在預(yù)防AD 中的潛力。試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米黃素能抑制TM 引起的凋亡蛋白Caspase 3 的活性；下調(diào)ERS 模型中PERK 及其下游調(diào)控蛋白elF2α 和ATF4 的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白CHOP 的升高。在ERS 初期階段，自噬作為細(xì)胞的一種保護(hù)性機(jī)制，玉米黃素能促進(jìn)自噬，然而當(dāng)ERS 長(zhǎng)期且持續(xù)進(jìn)行時(shí)，激活的自噬失常，為防止自噬功能紊亂導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，玉米黃素在此階段可以降低自噬，避免自噬功能紊亂造成的細(xì)胞死亡。

綜上所述，玉米黃素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，具體機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控PERK/CHOP 通路，緩解并抑制細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。