胡毓元，馬傳國，劉 君，白 歌，郭姝婧

（河南工業(yè)大學(xué) 小麥與玉米深加工國家工程研究中心 鄭州 450001）

植物甾醇是植物中的一類天然化學(xué)物質(zhì)，廣泛分布于植物油、堅果和谷物中[1]。自20 世紀(jì)50年代以來，植物甾醇因優(yōu)良的降膽固醇活性和預(yù)防心血管疾病的作用而受到廣泛關(guān)注[2]。食用含有植物甾醇的食物，有利于降低血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，從而降低心血管疾病的風(fēng)險。一般來說，推薦的植物甾醇攝入量約為1.5～3 g/d，可以使LDL-C 水平下降7%～12%[3]。然而，由于油溶性差、水不溶性和高熔點(diǎn)等特性，因此游離植物甾醇在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到限制。構(gòu)建新型植物甾醇衍生物，通過結(jié)構(gòu)修飾來提高游離植物甾醇的理化特性和生物利用率是解決方法之一。

目前，有許多研究嘗試對植物甾醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。以植物甾醇二酸單酯為中間體，將取代基引入植物甾醇是一種常用的方法。由于獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，新型植物甾醇衍生物可能具有突出的功能特性。例如，植物甾醇琥珀酸聚乙二醇酯具有良好的表面活性[4]。β-谷甾醇琥珀酸兒茶素酯在乳液中表現(xiàn)出一定的抗氧化性[5]。此外，植物甾醇琥珀酸單酯能夠有效降低動物模型血液中的膽固醇和LDL-C 水平且對肝臟沒有明顯的負(fù)面影響[6]，說明植物甾醇二酸單酯保留了植物甾醇的降膽固醇活性且未表現(xiàn)出毒性。

植物甾醇酯的合成方法主要有化學(xué)法和生物酶法。然而，以植物甾醇和二元酸或二元酸酐為底物，植物甾醇二元酸單酯的酶促合成效率非常低[7]。Chung 等[8]以4-二甲基氨基吡啶為催化劑，在甲苯中，將β-谷甾醇與琥珀酸酐進(jìn)行偶聯(lián)。在回流溫度下反應(yīng)6 h，植物甾醇琥珀酸單酯的產(chǎn)率為81%。王慧慧[9]以甲苯為溶劑，以離子液體為催化劑制備植物甾醇琥珀酸單酯。結(jié)果表明，1-丁基磺酸-3-甲基咪唑硫酸氫鹽（[BSO3HMim][HSO4]）為最適宜催化劑，在100 ℃下反應(yīng)2 h，酯化率達(dá)94%。Klumphu 等[10]以甲苯和三乙胺為溶劑和催化劑，在60 ℃下制備植物甾醇琥珀酸單酯，產(chǎn)率達(dá)98%。植物甾醇和琥珀酸酐在干燥甲苯中，氮?dú)夥諊拢?20 ℃無催化劑合成植物甾醇琥珀酸單酯，產(chǎn)率為95%[11]。雖然這些方法都有效，但是化學(xué)方法往往涉及催化劑殘留和植物甾醇高溫易氧化等風(fēng)險。

生物酶催化劑被越來越多地用于非水溶劑中，催化非天然酯化和酯交換反應(yīng)[12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，以β-谷甾醇和己二酸二乙烯酯為反應(yīng)底物制備β-谷甾醇己二酸乙烯酯時，β-谷甾醇己二酸乙烯酯會發(fā)生部分水解，生成β-谷甾醇己二酸單酯[13]，這有望成為一條溫和的高效制備植物甾醇己二酸單酯的酶促路線。同時，在體外胃腸道消化模擬過程中，β-谷甾醇己二酸多元醇酯也會被胰脂酶水解成β-谷甾醇己二酸單酯，最大水解率超過25%，因此有必要評估β-谷甾醇己二酸單酯是否保留了重要的降膽固醇活性。本文擬對β-谷甾醇己二酸單酯的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察其物理特性，探討其體外降膽固醇的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-谷甾醇（＞75%）、油酸（分析純）、膽固醇（99%），阿拉丁試劑（上海）有限公司；己二酸二乙烯酯（＞99.0%）、?；悄懰徕c（＞95.0%），西亞化學(xué)科技（山東）有限公司；Novozym 435（來自南極念珠菌的脂肪酶B，10 U/mg）、Lipozyme RM（來自米黑根霉的脂肪酶，250 IUN/g）、Lipozyme TL IM（來自疏毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶，250 IUN/g），諾維信（中國）有限公司；皺褶假絲酵母脂肪酶（Type VII，≥700 U/mg），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

正己烷、異辛烷、叔丁醇，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純），德國Meker 公司；甲酸（色譜純），阿拉丁試劑（上海）有限公司；所有反應(yīng)用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 高效液相色譜系統(tǒng)（配有蒸發(fā)光檢測器），美國Agilent 公司；SHA-CA 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，上海華燕儀器有限公司；AL104-IC 電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZF 真空干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TGL-16C 高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；D8 Advance X 射線衍射儀，德國Bruker 公司；DSC 204F1 差示掃描量熱儀，德國Netzsch 公司；DSA-100 接觸角測量儀，德國KRUSS 公司；Axioscope 5 偏振光顯微鏡，德國ZEISS 公司；Zetasizer Nano ZSP 動態(tài)光散射，英國馬爾文儀器公司；HT7700 透射電子顯微鏡，日本日立高新技術(shù)公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 β-谷甾醇己二酸單酯的制備 參照前期研究方法[13]，以β-谷甾醇和己二酸二乙烯酯為原料，皺褶假絲酵母脂肪酶（CRL）為催化劑，通過酯交換反應(yīng)制備β-谷甾醇己二酸乙烯酯。待β-谷甾醇完全反應(yīng)完后，過濾回收酶。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去溶劑。將析出的固體加入10 mL 溶劑，溶解完全后加入20 mg/mL 脂肪酶置于50 ℃水浴恒溫振蕩器中，以200 r/min 的速率振蕩。反應(yīng)1 h 后，過濾回收酶。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去溶劑。析出的固體加入熱蒸餾水（60 ℃）洗滌，以洗脫過量的己二酸。所得固體經(jīng)真空干燥過夜，密封保存?zhèn)溆?。?谷甾醇己二酸單酯的合成反應(yīng)路線圖見圖1。

圖1 β-谷甾醇己二酸單酯的合成反應(yīng)路線圖Fig.1 Synthetic route of β-sitosterol adipate monester

1.3.2 高效液相色譜儀（HPLC）條件 參照任明星[14]的方法，采用Zorbax 300SB-C18 反相色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），35 ℃柱溫箱溫度，10 μL進(jìn)樣量，甲醇/甲酸（V/V，1 000/1）流動相，1 mL/min流速，60 ℃蒸發(fā)光檢測器溫度。利用各組分相應(yīng)的純化產(chǎn)物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于定量分析。

1.3.3 X 射線衍射儀（XRD）條件 在檢測池中放置適量的樣品，以銅X 射線管作為X 射線源。以每分鐘0.5 次的速度掃描，衍射掃描區(qū)域為5°～40°。

1.3.4 差示掃描量熱儀（DSC）條件 樣品（5～10 mg）被放入鋁鍋中，以10 ℃/min 的速度從50 ℃加熱到150 ℃。在20.0 mL/min 的氮?dú)夥諊掠涗洘岱治銮€以及數(shù)據(jù)。一個空的鋁制鍋?zhàn)鳛榭瞻住?/p>

1.3.5 接觸角測量儀條件 配制高濃度樣品的二氯甲烷溶液，滴于預(yù)熱的載玻片上使溶劑蒸發(fā)的同時樣品延展成膜。將載玻片固定于接觸角測定儀操作臺，滴加10 μL 去離子水于樣品上，測量其固液接觸角。

1.3.6 偏振光顯微鏡（PLM）條件 將粉末樣品分散在水中滴到載玻片上，分別使用10 倍（10×）和100 倍（100×）的物鏡觀察。至少捕獲5 張圖像來確定樣本的特征。

1.3.7 膽固醇模型膠束的制備 采用Wang 等[15]的方法制備模型膠束，略做調(diào)整。將含有5 mmol/L?；悄懰徕c、2 mmol/L 膽固醇、4 mmol/L 油酸、132 mmol/L 氯化鈉的15 mmol/L 磷酸鈉緩沖液（PBS，pH 7.4）超聲處理30 min，然后置于35 ℃的水浴恒溫振蕩器中，過夜平衡。所得懸浮液以15000 r/min 離心20 min 后，進(jìn)一步用0.22 μm 的膜過濾器過濾。濾液即為膽固醇模型膠束，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.8 體外降膽固醇活性的測定 將4 mg 樣品加入4 mL 模型膠束中，然后在35 ℃孵育至少24 h。同時，將不添加樣品的模型膠束作為對照組，在相同條件下進(jìn)行孵育。最后，經(jīng)離心和過濾后，得到膠束相和沉淀相。采用HPLC 測定樣品在膠束相的溶解度。此外，降膽固醇的活性（%）根據(jù)公式（1）[15]計算：

式中，A空白——對照組的膽固醇峰值面積；A——試驗組的膽固醇峰值面積。

1.3.9 膠束相平均粒徑的測定 膠束相的平均粒徑測定范圍為0.6～10 000 nm，樣品在25 ℃下平衡2 min，掃描11 次。所有樣品均直接測定，不稀釋。

1.3.10 透射電子顯微鏡（TEM）條件 為了觀察膠束相和沉淀相的微觀形態(tài)，通過TEM 獲得高分辨率圖像。取少量膠束相溶液直接滴在300 目碳支撐網(wǎng)格上，沉淀相需預(yù)分散在PBS 溶液中再滴在碳網(wǎng)上，在室溫下干燥，然后進(jìn)一步分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有測量均獨(dú)立重復(fù)至少3 次，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）”表示。使用SPSS 17.0（美國IBM公司）進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)定值為0.05。使用Origin 8.6（美國OriginLab 公司）繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-谷甾醇及其衍生物的定量分析

在前期研究[13]中，已采用紅外光譜、核磁共振、液質(zhì)聯(lián)用等手段確定了β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇己二酸單酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)。各組分的液相色譜圖見圖2。其中，膽固醇、β-谷甾醇、β-谷甾醇己二酸單酯和β-谷甾醇己二酸乙烯酯的保留時間分別為5.5，6.2，6.8，9.2 min。可以看出，所選的液相條件可以有效的分離各組分物質(zhì)。有文獻(xiàn)指出，保留時間與物質(zhì)疏水性有關(guān)[16]。所以，膽固醇極性較大，β-谷甾醇己二酸單酯和β-谷甾醇的極性相近，β-谷甾醇己二酸乙烯酯的極性最小。為了能夠?qū)Ω鹘M分進(jìn)行定量分析，配制了一系列具有濃度梯度的溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。水解率及膠束溶解度根據(jù)膽固醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=1.6318x＋8.3474，R2=0.9998）、β-谷甾醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=1.3711x＋7.2558，R2=0.9990）、β-谷甾醇己二酸單酯含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=1.5449x＋7.8429，R2=0.9991）和β-谷甾醇己二酸乙烯酯含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=1.6541x＋8.2307，R2=0.9997）來確定。

2.2 脂肪酶和反應(yīng)溶劑對β-谷甾醇己二酸乙烯酯水解的影響

已知CRL 和正己烷是制備β-谷甾醇己二酸乙烯酯最適宜的生物酶催化劑和反應(yīng)溶劑[13]。本文考察了4 種商業(yè)脂肪酶和4 種常用反應(yīng)溶劑對β-谷甾醇己二酸乙烯酯水解的影響。從表1 可以看出，叔丁醇更有利于β-谷甾醇己二酸乙烯酯的水解。可能的原因是，只有叔丁醇可以與水互溶，促進(jìn)了β-谷甾醇己二酸乙烯酯的水解過程。另外，Lipozyme TL IM 在β-谷甾醇己二酸乙烯酯的水解反應(yīng)中表現(xiàn)出最高活性。因此，Lipozyme TL IM 和叔丁醇分別為β-谷甾醇己二酸乙烯酯水解的最適生物酶催化劑和溶劑。值得注意的是，水解后在反應(yīng)體系中未發(fā)現(xiàn)游離植物甾醇的生成，說明植物甾醇C-3 位?；⑽窗l(fā)生水解，可能是因為乙烯酯具有高酯交換活性，在發(fā)生酯交換的過程中會生成乙醛，優(yōu)先水解。

表1 脂肪酶和反應(yīng)溶劑對β-谷甾醇己二酸乙烯酯水解的影響Table 1 Effect of lipase and solvent on the hydrolysis of β-sitosterol vinyl adipate

2.3 β-谷甾醇及其衍生物的物理特性

為深入研究β-谷甾醇改性前、后物理特性的變化，采用XRD、DSC、PLM 和接觸角對β-谷甾醇及其衍生物的結(jié)晶性、潤濕性和微觀形貌進(jìn)行表征（見圖3 和圖4）。

圖3 β-谷甾醇及其衍生物的XRD 圖譜、DSC 曲線和接觸角Fig.3 XRD pattern，DSC curves and contact angle of β-sitosterol and their derivatives

圖4 β-谷甾醇及其衍生物的PLM 圖像Fig.4 PLM images of β-sitosterol and their derivatives

在XRD 圖譜中，游離β-谷甾醇顯示出一系列與文獻(xiàn)一致的特征衍射峰[17]，其中2θ=15.0°處出現(xiàn)衍射峰，其強(qiáng)度最高且在所有衍射圖譜中不遮蓋，因此選擇此峰來估計β-谷甾醇及其衍生物的結(jié)晶度?？梢钥闯?，β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇己二酸單酯依然具有尖峰，表明晶體的存在。而特征峰強(qiáng)度變?nèi)?，說明改性后的β-谷甾醇晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，結(jié)晶度下降。這一結(jié)果與文獻(xiàn)[18]一致，植物甾醇酯的結(jié)晶度與游離植物甾醇相比較低，這可能是由于植物甾醇經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后降低了分子間的有序性。

在DSC 曲線中，β-谷甾醇及其衍生物均表現(xiàn)出一個熔點(diǎn)范圍，說明在受熱過程中不存在相態(tài)的轉(zhuǎn)變。比較β-谷甾醇及其衍生物的熱行為時，發(fā)現(xiàn)改性后的β-谷甾醇衍生物的熔融溫度顯著降低。結(jié)果表明：β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇己二酸單酯的結(jié)晶度低于β-谷甾醇，這與XRD 的結(jié)果一致。

樣品的潤濕性主要通過接觸角來表征。從圖3 可以看出，β-谷甾醇與水的接觸角為131.4°，屬于超疏水材質(zhì)。β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇己二酸單酯具有相似的接觸角，并且都低于β-谷甾醇。然而，兩種β-谷甾醇衍生物的接觸角依舊大于90°，說明僅文中改性的效果是有限的，后期可以嘗試?yán)^續(xù)用親水基團(tuán)對植物甾醇己二酸單酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。

利用偏振光顯微鏡（PLM）技術(shù)進(jìn)一步表征樣品的結(jié)晶。從PLM 圖像中可以看出，β-谷甾醇和β-谷甾醇己二酸乙烯酯具有高結(jié)晶度，分散在水中時，呈板狀晶體，與文獻(xiàn)[19]一致。值得注意的是，β-谷甾醇己二酸單酯的小晶體聚集或靜電附著在大晶體的表面，且表面存在明顯缺陷，邊緣出現(xiàn)虛化。結(jié)果表明，β-谷甾醇己二酸單酯在水相體系下的結(jié)晶度下降，可能是由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在的端羧基與水分子相互作用，形成氫鍵，促進(jìn)水合作用而形成低晶基質(zhì)。

2.4 體外降膽固醇的可能作用機(jī)制

植物甾醇經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾后，結(jié)晶度和潤濕性等物理特性的改變，可能會影響其生物利用率和降膽固醇活性。多項研究表明，降低血漿膽固醇水平的作用機(jī)制主要包括兩個方面：（1）抑制腸道膽固醇吸收；（2）影響膽固醇代謝的基因表達(dá)。He 等[20]已在高脂動物模型中發(fā)現(xiàn)，植物甾醇琥珀酸單酯通過影響調(diào)控膽固醇穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)降低膽固醇水平。抑制腸道膽固醇吸收是降低血液膽固醇水平的前瞻性靶點(diǎn)。由于膽固醇是通過摻入膽鹽膠束而被吸收的，考察膽鹽膠束中膽固醇的溶解度常被用作評估物質(zhì)降膽固醇活性的指標(biāo)。因此，本文利用膽固醇模型膠束，重點(diǎn)探究β-谷甾醇及其衍生物體外降膽固醇的可能作用機(jī)制。

如表2 所示，膽固醇在單一膠束相中的初始溶解度為（2.145±0.001）mmol/L。β-谷甾醇及其衍生物加入模型膠束后構(gòu)成二元混合膠束體系，且在一定程度上降低膽固醇的膠束溶解度。與預(yù)期結(jié)果一致，β-谷甾醇具有顯著的降膽固醇活性。β-谷甾醇的降膽固醇活性為（16.72±1.51）%，略高于Jia 等[21]的試驗結(jié)果。β-谷甾醇己二酸乙烯酯的降膽固醇活性最低。Brown 等[22]觀察到一致的現(xiàn)象：完整的植物甾醇脂肪酸酯不能溶解到膽鹽膠束中，不能改變膽固醇的膠束溶解度。β-谷甾醇己二酸單酯的降膽固醇活性為（14.29±0.81）%，證明其對混合膠束中膽固醇的溶解具有抑制作用。值得注意的是，β-谷甾醇和β-谷甾醇己二酸乙烯酯在二元混合膠束體系中的溶解度小于0.1 mmol/L，而β-谷甾醇二酸單酯在混合膠束中具有良好的溶解度（超過1.7 mmol/L）。摻入胃腸道膽鹽混合膠束的部分與生物利用率有關(guān)[23]。β-谷甾醇二酸單酯的結(jié)晶度降低和潤濕性增強(qiáng)，有利于其摻入混合膠束，提高其生物利用率。猜測β-谷甾醇二酸單酯進(jìn)入混合膠束后，可能會引起膠束疏水核膨脹，膠粒尺寸增大，導(dǎo)致混合膠束沉淀，從而降低膽固醇的膠束溶解度。為了驗證猜測，利用DLS 和TEM對混合膠束微觀形貌進(jìn)行表征。DLS 顯示無論單一體系還是混合體系，膠束相的平均粒徑在110～140 nm 之間，與TEM 觀察到的結(jié)果（圖5a～5d）一致，說明試驗過程采取的分離膠束相和沉淀相的方法比較穩(wěn)定?；旌夏z束的微觀形態(tài)近似球形，與文獻(xiàn)中顯示的TEM 圖像相似[24]。如圖5e～5f 所示，β-谷甾醇與膽固醇的混合體系的沉淀相呈類似于β-谷甾醇的板狀。Zeng 等[25]報道，β-谷甾醇可與膽固醇共結(jié)晶，形成不溶性混合晶體，減少膽固醇在小腸中的吸收。這一結(jié)果可以解釋為什么β-谷甾醇與膽固醇形成的二元混合體系的膠束相尺寸最小。此外，觀察到添加β-谷甾醇己二酸乙烯酯和β-谷甾醇己二酸單酯獲得的二元混合體系沉淀相的微觀形態(tài)與單一體系沉淀相的微觀形態(tài)相似，而膠粒尺寸急劇膨脹（圖5g～5h）。結(jié)果表明，β-谷甾醇己二酸單酯由于加入到混合膠束中，擴(kuò)大膠束疏水核尺寸，導(dǎo)致混合膠束沉淀，降低了膠束中膽固醇水平。雖然β-谷甾醇己二酸乙烯酯同樣擴(kuò)大了混合膠束的尺寸，但它沒有較強(qiáng)的膠束摻入能力，對混合膠束的沉淀作用較弱，因此幾乎不影響膽固醇在膠束相中的溶解度。

表2 單一和混合體系中各組分參數(shù)Table 2 Parameters of each component in single and binary mixed micelles systems

圖5 膠束相和沉淀相的TEM 圖像Fig.5 TEM images of micellar phase and precipitation phase

3 結(jié)論

采用生物酶促水解制備β-谷甾醇己二酸單酯，條件溫和，產(chǎn)品易于分離純化，水解率達(dá)到99%以上。XRD、DSC、PLM 和接觸角的測定結(jié)果表明，與β-谷甾醇相比，β-谷甾醇己二酸單酯的結(jié)晶度降低和潤濕性增強(qiáng)（接觸角從131.4°降至98.6°）。膽固醇模型膠束的結(jié)果表明，β-谷甾醇己二酸單酯具有一定的降膽固醇潛力，可能的作用機(jī)制是由于其物理特性的改變，增強(qiáng)其摻入膠束的能力，引起膠束疏水核的膨脹，膠粒尺寸增大，導(dǎo)致模型膠束沉淀，從而降低膽固醇的膠束溶解度。植物甾醇二元酸單酯的優(yōu)良性能表明其在食品工業(yè)中具有一定的應(yīng)用前景。